Композиции пептидного конъюгата и способы для профилактики и лечения болезни альцгеймера

Композиции пептидного конъюгата и способы для профилактики и лечения болезни альцгеймера

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для профилактики и лечения амилоидогенных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Болезнь Альцгеймера (БА (AD)) характеризуется прогрессирующим поражением памяти и когнитивными нарушениями. Ее отличительными патологическими изменениями являются отложения амилоида (сенильные бляшки), нейрофибриллярные клубки и потеря нейронов в специфических областях головного мозга. Отложения амилоида состоят из бета-пептидов амилоида (Аβ) из 40-43 остатков аминокислот, которые являются протеолитическими продуктами белка предшественника амилоида (АРР). Нейрофибриллярные клубки представляют собой внутриклеточные агрегаты волокон гиперфосфорилированных тау-белков (Selkoe, Science, 275: 630-631, 1997).

Патогенез БА до конца не ясен, но предполагают, что он представляет собой многофакторное явление. Считают, что накопление и агрегация Аβ играют основную роль в патологическом процессе, что также известно как гипотеза амилоидного каскада (Golde, Brain Pathol., 15: 84-87, 1995). В соответствии с этой гипотезой Аβ, особенно Аβ₄₂, склонен к образованию различных форм агрегатов, варьирующихся от небольших олигомеров до крупных, длинных структур профибрилл. Такие агрегаты являются нейротоксичными и отвечают за патологию синапсов, ассоциированную с потерей памяти и когнитивными нарушениями на ранних стадиях заболевания (Klein et al., Neurobiol. Aging, 25: 569-580, 2400). В недавней публикации предположили, что снижение Аβ в тройной трансгенной модели на мышах также предотвращает внутриклеточное отложение тау (Oddo et al., Proc.Neuron, 43: 321-332, 2004). Такое открытие предполагает, что внеклеточное отложение амилоида может быть причиной последующего образования нейрофибриллярных клубков, что может, в свою очередь, приводить к потере нейронов.

Иммунизация АРР-трансгенных мышей Аβ антигеном может уменьшать отложения Аβ в головном мозге и смягчать прогрессирование болезни. Это впервые было описано Shenk et al., Nature, 400: 173-177, 1999, и в настоящее время подтверждено большим количеством исследований, включающих различные трансгенные модели на животных, различные активные вакцины, а также пассивную иммунизацию Аβ-специфическими моноклональными антителами (Bard et al., Nature Med, 6: 916-919, 2000; Janus et al., Nature, 408: 979-982, 2000; Morgan et al., Nature, 408: 982-985, 2000; DeMattos et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 98: 8850-8855, 2001; Bacskai et al., J.Neurosci., 22: 7873-7878, 2002; Wilcock et al., J.Neurosci., 23: 3745-3751, 2003). Согласуясь с такими данными о животных, три опубликованных исследования посмертных тканей человеческого головного мозга от пациентов, которые ранее получили активную иммунизацию пре-агрегированным Аβ(1-42) иммуногеном (AN1792, Betabloc), показали локальное исчезновение сенильных бляшек (Nicoll et al., Nature Med., 9: 448-452, 2003; Ferrer et al., Brain Pathol., 14: 11-20, 2004; Mesliah et al., Neurology, 64: 129-131, 2005). Эти данные в общем показывают, что вакцины, которые эффективно устраняют иммунный ответ на Аβ антигены, являются эффективными в отношении патологических сенильных бляшек, образующихся при БА. Однако механизм вакцины или иммунная эффективность остаются неясными.

Наиболее современной основанной на иммунотерапии программой для БА в общественном пользовании было исследование II Фазы вакцины по активной иммунизации с использованием AN1792 (Betabloc), вакцины, состоящей из заранее агрегированного Аβ (1-42), вводимого совместно с добавкой, QS-21^TM (Antigenics, New York, NY. В январе 2002 это исследование было завершено, когда у четырех пациентов появились симптомы, соответствующие менингоэнцефалиту (Senior, Lancet Neurol., 1:3, 2002). В конечном счете, у 18 из 298 получавших лечение пациентов развились признаки менингоэнцефалита (Orgogozo et al., Neurology, 61: 46-54, 2003). Не было обнаружено корреляции между энцефалитом и титром антител, и сообщили, что вероятным причинным механизмом этого эффекта была активация Т-клеток против ауто-иммуногена, особенно серединной и карбокси концевой части пептида Аβ₄₂ (Monsonego et al., J.Clin.Invest., 112: 415-422, 2003). В поддержку этого заключения, посмертное исследование ткани головного мозга от двух получавших вакцину, у которых развился энцефалит, выявило существенную менингеальную инфильтрацию CD4+ Т-клетками у одного пациента (Nicoll et al., Nature Med., 9:448-452, 2003) и CD4+, CD8+, CD3+, CD5+, CD7+ Т-клетками у другого (Ferrer et al., Brain Pathol., 14: 11-20, 2004).

Существующие доказательства предполагают, что увеличение уровня Аβ плазмы после пассивной или активной иммунизации отражает начало периферического падения как предшественника последующего снижения Аβ в головном мозге. Периферическое падение относится к изменению в равновесии запасов Аβ в головном мозге и плазме, приводящих к суммарному оттоку центрального Аβ на периферию (см., например, Deane et al., J.Neurosci., 25: 11495-11503, 2005; DeMattos et al., Pro.Natl.Acad.Sci.USA, 98:8931-8932, 2001). Другие исследования предполагают, что такое повышение Аβ плазмы, наблюдаемое после анти-Аβ иммунотерапии, является необходимым для развития последующего снижения центрального Аβ (Cribbs et al., 7^th International Conference on AD/PD, Sorrento, Italy, 2005). Следовательно, когда в Аβ замещены две аминокислоты (например, так как происходит при мутациях Dutch и Iowa), пептид больше неспособен проходить из центрального в периферический отделы (Davis et al., Neurobiol Aging, в печати, доступная on-line с 18 августа 2005). Когда иммунизировали мышей, экспрессирующих такую мутантную форму Аβ и мутацию Swedish, не обнаруживали повышения Аβ плазмы и не было отмечено последующего снижения Аβ в головном мозге. Наоборот, мыши, экспрессирующие последовательность человеческого Аβ дикого типа плюс мутацию Swedish, отвечали на активную иммунизацию и увеличением Аβ плазмы и последующим снижением центрального Аβ (Cribbs et al., 7^th International Conference on AD/PD, Sorrento, Italy, 2005). Cоответственно ожидают, что любой активный иммуноген вакцины, способный вызывать иммунный ответ, который приводит к повышению уровня Аβ плазмы, будет применимым для лечения болезни Альцгеймера и связанных заболеваний, характеризующихся повышением уровня Аβ в головном мозге.

Заявители неожиданно обнаружили, что антиген, из которого удаляют Т-клеточные эпитопы, чтобы избежать Т-клеточного ответа, является иммуногенным и повышает уровень Аβ плазмы. Это представляет собой потенциальное средство для получения безопасной и эффективной вакцины для БА. Заявители в настоящем изобретении предоставляют такой антиген и композицию для применения в качестве вакцины от БА.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую иммуногенный фрагмент Аβ, не имеющий Т-клеточного эпитопа, способный индуцировать иммунный ответ в форме антител к Аβ. В одном аспекте такая композиция включает линейные пептиды из 8 аминокислот (8-меры) Аβ. В еще одном аспекте такая композиция содержит поливалентные линейные 8-меры с вставленным по меньшей мере одним линкером или поливалентные разветвленные множественные антигенные пептиды (МАР). Фармацевтическая композиция может быть использована в качестве вакцины от БА и связанных амилоидных заболеваний.

В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция представляет собой средство, повышающее Аβ плазмы, включающее иммуногенный фрагмент Аβ с отсутствием Т-клеточного эпитопа, способный индуцировать иммунный ответ в форме антител к Аβ, который повышает уровень Аβ плазмы. Фармацевтическая композиция может быть использована в качестве вакцины против БА и связанных амилоидных заболеваний, характеризующихся повышенным уровнем Аβ в головном мозге.

В еще одном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция связана с молекулой-носителем с образованием конъюгата, где носитель помогает выявить иммунный ответ, включающий антитела к фрагменту Аβ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения носителем является белковый комплекс наружной мембраны Neisseria meningitides (OMPC).

В следующем варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию вводят с фармацевтически приемлемым адъювантом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения адъювантом является алюминиевый адъювант (адъювант квасцы Merck, MAA) или адъювант на основе сапонина (ISCOMATRIX®, CSL Ltd., Parkville, Australia).

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет способы для профилактики или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Аβ в головном мозге пациента. Такие заболевания включают болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, когнитивные нарушения или другие формы сенильной деменции. Способ включает введение иммуногенного фрагмента Аβ, с отсутствием Т-клеточного эпитопа, выбираемого из группы, состоящей из линейных пептидов из 8 аминокислот (8-меров), поливалентных линейных пептидов, соединенных с, по меньшей мере, одним линкером, и поливалентных разветвленных множественных антигенных пептидов (МАР). В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммунногенный фрагмент включает поливалентный линейный пептид с полиэтиленгликолевым (PEG) линкером. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенный фрагмент включает поливалентный разветвленный МАР, Аβ (3-10)/(21-28) конъюгат, Конструкт № 12, Фиг.6А, конъюгированный с ОМРС.

Такие способы предусматривают введение эффективной дозы иммуногенного фрагмента Аβ, с отсутствием Т-клеточного эпитопа, пациентам, нуждающимся в таком лечении, что вызовет иммунный ответ в форме антител к Аβ. Указанный ответ антител способен повышать уровень Аβ плазмы. В другом аспекте настоящего варианта осуществления изобретения вводимый иммуногенный фрагмент связан с молекулой носителем. В еще одном аспекте настоящего изобретения иммуногенный фрагмент вводят с адъювантом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой синтетические пептиды из 8 аминокислот (8-меры) (SEQ ID №№ 2-36), полученные из Аβ (1-42) (SEQ ID № 1), из которых выбирали пептиды для проведения линейного пептидного сканирования для определения эпитопов Аβ.

Фиг.2 представляет собой 8-меры, выбранные для конъюгации с KLH (фиг.2А) и OMPC (Фиг.2В).

Фиг.3 представляет собой иммуногенность выбранных конъюгатов Аβ, описанных на фиг.2, после первой (PD1), второй (PD2) и третьей (PD3) дозы.

Фиг.4 представляет собой перекрестную реакцию сыворотки, полученной от морской свинки, ранее иммунизированной конъюгатом Аβ (3-10)-KLH (SEQ ID № 40) с тканью головного мозга человека при БА. На фиг.4А показана иммуногенность анти Аβ моноклонального антитела 6F3D (которое распознает аминокислоты 8-17 Аβ). Вид окрашивания выявляет выраженную амилоидную патологию в такой ткани головного мозга. На фиг.4В продемонстрировано отсутствие иммунной реакции того же головного мозга с до-иммунной сывороткой от иммунизированной морской свинки до иммунизации. На фиг.4С показана иммунная реакция сыворотки от иммунизированной морской свинки после иммунизации.

На фиг.5 показаны характерные поливалентные линейные 8-мерные пептиды, которые выбирают на основании иммуногенности отдельных 8-меров в исследованиях на морских свинках (Пример 3). Такие конъюгаты синтезировали, как описано, и конъюгировали с ОМРС (Пример 1.J. и 1.K).

На фиг.6 показаны характерные поливалентные разветвленные МАР конъюгаты, которые были выбраны на основании иммуногенности отдельных 8-меров в исследованиях на морских свинках (Пример 3). На фиг. 6А показаны характерные двухвалентные МАР, и на фиг. 6В показаны характерные бромацетилцистеиновые МАР. Такие конъюгаты синтезировали, как описано, и конъюгировали с ОМРС (Пример 2).

Фиг.7 представляет собой титр анти-Аβ₄₀ из сыворотки, полученной от резус-макак после 1 (PD1) или 2 (PD2) инъекций пептида Аβ(1-18), конъюгированного с ОМРС, рецептированного только в квасцах Merck или в квасцах Merck и IMX (ISCOMATRIX®, CSL, Ltd., Parkville, Australia) в качестве добавки.

Фиг.8 представляет собой увеличение уровня Аβ плазмы после введения конъюгата Аβ. На фиг.8А показано более чем трехкратное повышение после введения МАР конструкта, включающего Аβ(3-10)/(21-28) (Конструкт № 12, Фиг.6А), конъюгированный с ОМРС по сравнению с мономерными конструктами, Аβ(3-10) ((SEQ ID № 69) и Аβ(21-28) (SEQ ID № 73) (□ Конструкт № 12, Фиг.6А; ● Аβ(3-10) ((SEQ ID № 69), ▲ Аβ(21-28) (SEQ ID № 73). На фиг.8В показано, что уровень Аβ плазмы не зависит от уровня титра ((□ Конструкт № 12, Фиг.6А; ● Аβ(3-10) ((SEQ ID № 69), ▲ Аβ(21-28) (SEQ ID № 73).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин «8-мер» относится к пептиду из восьми аминокислот, который соответствует фрагменту Аβ, аналогу естественного пептида Аβ или пептидомиметику. Один или более 8-меров могут быть скомбинированы с, по меньшей мере, одним линкером для получения поливалентного линейного пептида или для получения поливалентного разветвленного МАР.

Термин «Аβ-конъюгат» обозначает 8-мер или иммуногенный фрагмент Аβ, который химически или биологически связан с носителем, таким как гемоцианин фиссуреллы или белковый комплекс наружной мембраны Neisseria meningitidies (OMPC).

Термин «Аβ-пептид» обозначает любой из Аβ пептидов, описанных в настоящем описании, включая, но не ограничиваясь, линейные 8-меры, поливалентные линейные пептиды с, по меньшей мере, одним линкером, и поливалентные антигенные пептиды (МАР).

Термин «эпитоп» относится к участку на антигене, на который реагируют В- или Т-клетки. В-клеточные эпитопы могут быть образованы и из заменимых аминокислот и из незаменимых аминокислот, соединенных третичной структурой белка. Эпитопы, образованные из заменимых аминокислот, обычно сохраняются от воздействия денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные третичной структурой, обычно теряются при обработке денатурирующими растворителями. Т-клеточный эпитоп состоит из пептидов, которые способны образовывать комплексы с молекулами МНС организма-хозяина. Т-клеточные эпитопы для человеческих молекул МНС I класса, которые отвечают за индукцию CD8+ Т-клеточного ответа, обычно включают от 9 до 11 аминокислотных остатков, тогда как эпитопы для человеческих молекул МНС II класса, которые отвечают за CD4+ Т-клеточный ответ, обычно включают 12 или более аминокислотных остатков (Bjorkman et al., Nature 329: 506-512, 1987; Madden et al., Cell 75: 693-708; Batalia and Collins; Engelhard Annu Rev Immunol., 12: 181-207-622. 1995; Madden, Annu. Rev. Immunol., 13: 587-622. 1995). В отличие от Т-клеток, В-клетки способны распознавать пептиды, такие небольшие, как 4 аминокислоты в длину. Рецепторы Т-клеток распознают комплексы Т-клеточных эпитопов/МНС, приводя к активации Т-клеток.

Термин «иммуногенный фрагмент Аβ» или «иммуногенный фрагмент Аβ с отсутствием Т-клеточного ответа», как используется в настоящем описании, относится к 8-меру или фрагменту Аβ, который способен вызывать иммунный ответ в форме антител к Аβ, но такой ответ не включает Т-клеточного ответа на сам антиген, Аβ.

Термин «иммунологический», или «иммунный», или «иммуногенный» ответ относится к развитию гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованному антиген-специфичными Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного против антигена у позвоночного. Такой ответ может быть активным ответом, индуцированным введением иммуногена, или пассивным ответом, индуцированным введением антитела.

Термин «поливалентный пептид» относится к пептидам, имеющим более чем одну антигенную детерминанту.

Термин «фармацевтическая композиция» обозначает химическую или биологическую композицию, подходящую для введения млекопитающему. Как используется в настоящем описании, он относится к композиции, включающей 8-меры, иммуногенные фрагменты Аβ и конъюгаты Аβ, описанные в настоящем описании для введения необязательно вместе с адъювантом или без него.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано ранее, доклинические исследования предполагают, что активная иммунизация, приводящая к ответу анти-Аβ поликлональных антител, обеспечивает эффективность против патологических и когнитивных симптомов, ассоциированных с БА, у трансгенных мышей, у которых чрезмерно экспрессируется белок предшественник амилоида (Bard et al., Nature Med., 6: 916-919, 2000; Janus et al., Nature, 408: 979-982, 2000; Morgan et al., Nature, 408: 982-985, 2000; DeMattos et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 98: 8850-8855, 2001; Bacskai et al., J.Neurosci., 22: 7873-7878, 2002; Wilcoc et al., J.Neurosci., 23: 3745-3751, 2003). Такие доклинические исследования поддерживаются единственным клиническим исследованием, где агрегированную форму Аβ₄₂ использовали в качестве активного иммуногена. Предварительные доказательства из этого исследования предполагают, что после лечения были обнаружены патологические (Nicoll et al., Nature Med., 9: 448-452, 2003; Ferrer et al., Brain Pathol., 14:11-20, 2004; Masliah et al., Neurology, 64: 129-131, 2005) и когнитивные улучшения (Gilman et al., Neurology 64 (9): 1553-1562, 2005). Тогда как такие открытия являются обнадеживающими и согласующимися с доклиническими исследованиями, лечение оказалось небезопасным и было прекращено после возникновения менингоэнцефалита у приблизительно 6% пациентов, получавших лечение (Orgogozo et al., Neurology, 61: 46-54, 2003). Следовательно, существует необходимость в методиках активной иммунизации, дающих эффективный иммунный ответ и лишенных нежелательных проблем с безопасностью.

В этом предварительном клиническом исследовании был осуществлен прогресс в понимании природы нежелательных явлений. В настоящее время несколько исследователей сообщают о присутствии CD4+ и CD8+ положительных менингеальных инфильтратов при посмертном исследовании (Nicoll et al., Nature Med., 9: 448-452, 2003; Ferrer et al., Brain Pathol., 14: 11-20, 2004), предполагающих Т-клеточный ответ, направленный на собственный пептид Аβ_42. Однако тогда как специалист в области техники понимает необходимость избегать самонаправленного Т-клеточного ответа при поддержании существенного ответа антител (опосредованного В-клетками), средства для получения агента, обладающего таким свойством, неизвестны. Подобная проблема осложняется отсутствием предсказуемых моделей на животных или других доклинических анализов с предсказуемой значимостью для таких действий.

С этой целью заявители в настоящем описании использовали отличающуюся природу эпитопов Т и В клеток для создания пептидов, применимых для изобретения. Были созданы конструкты вакцин вырезанием линейного пептида размером до восьми аминокислот и, если необходимо, удалением любого потенциального С-концевого якорного остатка Т-клеточного эпитопа.

Соответственно одним аспектом настоящего изобретения была идентификация фрагментов Аβ, которые являются иммуногенными, но не имеют Т-клеточного эпитопа, для применения в качестве вакцины от БА. До настоящей заявки не было точно известно, какие аминокислотные фрагменты пептида Аβ дадут иммуногенный ответ, которые также не будут иметь Т-клеточного эпитопа. Специалист в области техники понимает, что предыдущие указания в области техники не прогнозируют, например, что 8-мер даст иммунный ответ, и не различают применимость фрагментов из различных участков пептида Аβ. См., например, патенты США №№ 6808712 и 6787144.

Дополнительный аспект изобретения далее включает определение агентов, повышающих Аβ плазмы, включающих иммуногенный фрагмент Аβ, с отсутствием Т-клеточного эпитопа, которые вызывают ответ в форме антител к Аβ и которые повышают уровень Аβ плазмы. Такие агенты могут быть использованы в качестве вакцины от БА и для связанных амилоидных заболеваний, характеризующихся повышенным уровнем Аβ в головном мозге. До создания данного изобретения не было известно или прогнозируемо, какие иммуногенные фрагменты Аβ будут приводить к повышенному уровню Аβ плазмы. Без связи с какой-либо теорией считают, что агенты, повышающие Аβ плазмы, описанные в настоящем описании, действуют, индуцируя иммунный ответ в форме антител к Аβ, которые, в соответствии с теорией периферического падения клиренса Аβ, дают повышенные уровни Аβ плазмы, что приводит к последующему снижению Аβ в головном мозге. Более того, тогда как отдельные 8-меры или иммуногенные фрагменты Аβ могут быть способны вызывать иммунный ответ, так что уровни Аβ плазмы повышаются, Заявители обнаружили, что поливалентный разветвленный МАР, Аβ(3-10)/(21-28) (Конструкт №12, Фиг.6А), конъюгированный с ОМРС, был особенно эффективным в повышении уровня Аβ плазмы относительно его составляющих мономерных конструктов, Аβ (3-10) (SEQ ID № 69) или Аβ (21-28) (SEQ ID № 73).

Амилоидные заболевания

Изобретение обеспечивает композиции и способы для профилактики и терапевтического лечения заболеваний, характеризующихся накоплением отложений амилоида. Отложения амилоида включают пептид, агрегированный до нерастворимой массы. Природа пептида варьируется при различных заболеваниях, но в большинстве случаев агрегат имеет β-складчатую структуру и окрашивается красителем Конго Красный. Заболевания, характеризующиеся отложениями амилоида, включают болезнь Альцгеймера (БА) с поздним и с ранним началом. При обоих заболеваниях отложения амилоида включают пептид, называемый амилоид бета (Аβ), который накапливается в головном мозге пораженного человека. Следовательно, термин «амилоидное заболевание» также относится к заболеванию, характеризующемуся повышенным уровнем Аβ в головном мозге.

Терапевтические агенты

Терапевтические агенты для применения в настоящем изобретении индуцируют иммунный ответ в форме антител к Аβ. Индукция иммунного ответа может быть активной, когда иммуноген вводят для индукции антител или Т-клеток, реагирующих с Аβ у пациента, или пассивной, когда вводят антитело, которое само связывается с Аβ у пациента.

Терапевтический агент для использования в предотвращении или лечении амилоидных заболеваний, таких как БА, включает пептидные фрагменты Аβ, которые могут быть любой из естественных форм (т.е. Аβ39, Аβ40, Аβ41, Аβ42 или Аβ43). Такие последовательности известны в области техники, см., например, Hardy et al., TINS 20: 155-158, 1997.

Как используется в настоящем описании, терапевтическим агентом является, в предпочтительном варианте осуществления, иммуногенный фрагмент с отсутствием Т-клеточного эпитопа, способный вызывать иммунный ответ в форме антител к Аβ. Иммуногенный фрагмент Аβ может быть в форме 8-мера, поливалентного линейного конъюгата Аβ, имеющего по меньшей мере один PEG линкер или поливалентный разветвленный конъюгат Аβ МАР. Терапевтический агент можно вводить в форме фармацевтической композиции. В другом варианте осуществления изобретения терапевтическим агентом является агент, повышающий Аβ плазмы, способный вызывать иммунный ответ в форме антител к Аβ, и который повышает уровень Аβ плазмы у пациента. Такие агенты могут включать фрагмент естественного пептида или могут включать один или более заместителей, добавлений или делеций и могут включать синтетические или ненатуральные аминокислоты. Фрагменты и конструкты могут быть оценены в отношении профилактической и терапевтической эффективности в анализах, описанных в приведенных здесь примерах.

Тогда как в предпочтительном варианте осуществления изобретения терапевтические агенты включают пептидный фрагмент Аβ, такие агенты также могут включать пептиды и другие соединения, которые необязательно имеют значительное средство последовательности аминокислот с Аβ, но, тем не менее, могут служить миметиками Аβ и индуцировать сходный иммунный ответ. Например, пептиды и белки, образующие β-складчатые структуры, могут быть исследованы в отношении соответствия настоящему изобретению. Подобным образом, комбинаторные библиотеки и другие соединения могут быть исследованы в отношении соответствия настоящему изобретению.

Такие определенные терапевтические средства могут быть связаны или химически, или биологически с носителем для облегчения их применения в качестве иммуногена. Такие носители включают альбумины сыворотки, гемоцианин фиссуреллы (KLH), молекулы иммуноглобулина, овальбумин, белок столбнячного токсина или токсин от других патогенных бактерий, таких как дифтерия, E. сoli, холера или H.pylori или аттенуированное производное токсина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения носителем является белковый комплекс наружной мембраны Neisseria meningitides (OMPC).

Данное изобретение также предусматривает применение таких терапевтических средств в фармацевтической композиции, включающей 8-мер или иммуногенный фрагмент Аβ, которые могут быть связаны с носителем, для введения необязательно с адъювантом. Подходящие адъюванты включают соли алюминия (квасцы), липид, такой как 3 де-О-ацетилированный монофосфориллипид А (MPL), или адъювант на основе сапонина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения адъювантом является алюминиевый адъювант (Merck alum adjuvant, MAA) или адъювант на основе сапонина (ISCOMATRIX®, CSL Ltd., Parkville, Australia).

Схемы лечения

Эффективные дозы композиций по настоящему изобретению для профилактического или терапевтического лечения БА и других амилоидных заболеваний будут варьироваться в зависимости от множества факторов, включая, но не ограничиваясь, средства введения, целевое место, физиологическое состояние пациента, другие вводимые препараты и является ли лечение терапевтическим, т.е. после появления симптомов заболевания, или профилактическим, т.е. для предотвращения развития симптомов заболевания. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пациентом является человек, и терапевтическое средство вводят инъекционно.

Количество используемого иммуногена или терапевтического агента также будет зависеть от того, вводится ли адъювант одновременно или последовательно, с использованием более высоких доз в отсутствие добавки.

Количество используемого иммуногена или терапевтического агента будет варьироваться, но количества, варьирующиеся от 0,5 до 50 мкг пептида (на основании содержания пептида Аβ) на инъекцию, рассматриваются для применения у человека. Специалист в области техники знает, как рецептировать композиции, включающие антигены типа, описанного в настоящем описании.

Схема введения будет состоять из первичной иммунизации с последующими бустерными (поддерживающими) инъекциями с установленными интервалами. Интервалы между первичной иммунизацией и повторной иммунизацией, интервалы между повторными инъекциями и количество повторных инъекций будет зависеть от титра и длительности существования антител, вызванных вакциной. Также это будет зависеть от функциональной эффективности ответа антител, а именно уровня титра антител, требуемого для предотвращения развития БА или проявления терапевтических эффектов у пациентов с БА. Обычная схема будет состоять из исходной серии инъекций через 1, 2 и 6 месяцев. Другая схема будет состоять из исходных инъекций через 1 и 2 месяца. Для каждой схемы повторные инъекции будут вводиться каждые шесть месяцев или ежегодно, в зависимости от титра и продолжительности существования антител. Схема введения также может быть основываясь на необходимости, что определяют по наблюдению за иммунным ответом у пациента.

Определение эпитопов вакцины от БА

С целью определения, какие фрагменты из 8 аминокислот («8-меры») пептида Аβ были достаточны для получения иммунного ответа, заявители систематически исследовали полную длину Аβ₄₂ с небольшими (8 аминокислот) перекрывающимися синтетическими пептидами, полученными из естественной последовательности Аβ (SEQ ID № 1), как показано на фиг.1 (SEQ ID №№ 2-37). Были синтезированы двадцать девять перекрывающихся пептидов из восьми аминокислот, охватывающие полную длину Аβ₄₂ (фиг.2А) для применения в качестве антигенов. Для улучшения растворимости несколько пептидов были модифицированы добавлением тройных остатков лизина (ККК) (SEQ ID №№ 52, 53, 54, 56, 59, 60, 62, 64 и 65) или глутамина (ЕЕЕ) (SEQ ID №№ 50, 51 и 61) или с применением полиэтиленгликолевого линкера (PEG) (SEQ ID №№ 55 и 63). По той причине пептиды, охватывающие последовательность Аβ, соответствующую остаткам (11-18) и (13-20), получали во множестве форм, первую с линкером 6-аминогексановой кислоты (Aha) плюс функциональная группа для химической сшивки на N-конце, и другую форму - с Aha и функциональной группой на С-конце. В качестве контроля заявители включали более длинный пептид, Аβ(1-18).

Как используется в настоящем описании, иммуногенными фрагментами могут быть 8-мерные пептиды (остатки восьми аминокислот), полученные из естественных источников, т.е. дикого типа, или синтетического Аβ (SEQ ID № 1), или их любые мутации или варианты. Такие мутации или варианты могут быть получены синтетическими или рекомбинантными средствами, известными обычному специалисту в области техники. Одним примером такого варианта является EV субстрат (EVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) (SEQ ID № 66), пептид, соответствующий Аβ (1-42), в котором положения 1 и 2 Аβ дикого типа были изменены.

Конъюгаты Аβ для применения в композициях вакцин

Выбор конъюгатов Аβ для применения в рецептировании вакцин был основан на иммуногенности 8-меров. С целью определения иммуногенности 8-мера у видов с последовательностью, идентичной последовательности человеческого Аβ, 29 пептидов (фиг.2А) были конъюгированы с KLH для получения конъюгата Аβ и протестированы у морских свинок (фиг.3). В качестве контрольного иммуногена в этот анализ включали Аβ (1-18)-KLH (SEQ ID № 37).

Морских свинок иммунизировали, как описано в примере 3В, конъюгированными иммуногенами, рецептированными в квасцах плюс 50 мкг ISCOMATRIX® (CSL, Ltd., Parkville, Australia). С целью отличия иммуногенного от неиммуногенного фрагмента Аβ₄₂ морских свинок иммунизировали три раза с интервалами в четыре недели. Через три недели после каждой иммунизации брали образцы крови и исследовали посредством ELISA в отношении титров антител к пептиду Аβ₄₀. Такие титры показаны на фиг.3 как после 1 введения (PD1), после 2 введения (PD2) и после третьего введения (PD3) соответственно.

После первой инъекции (PD1) некоторые участки пептидов давали существенные титры антител, как 18-мерный контроль. В частности, конъюгаты Аβ, соответствующие аминокислотам Аβ 1-8, 2-9, 3-10, 17-24, 21-28 и 33-40, все давали титры в избытке 1:800. После второй инъекции (PD2) 15 конъюгатов Аβ давали титры антител в избытке 1:1000. Анализ после 3 инъекции (PD3) дополнительно подтвердил, что определенные участки Аβ являются более иммуногенными относительно остальных. Одиннадцать участков продемонстрировали титры более чем 1:6000. Они включают участки, соответствующие аминокислотам Аβ 1-8, 3-10, 7-14, 11-18, 13-20, 15-22, 19-26, 21-28, 23-30, 27-34 и 29-36. Из этих участков пять участков были высокоиммуногенными (>1:10000), включая: участки 1-8, 15-22, 21-28, 23-30 и 29-36. Полученные данные предполагают, что определенные участки Аβ из 8 аминокислот являются высокоиммуногенными, тогда как другие участки (например, 5-12, 25-32, 31-38 и 35-42) являются неиммуногенными (титры <1:300). Результаты также демонстрируют, что тогда как конъюгаты Аβ способны вызывать ответ антител, специфических к пептиду Аβ₄₀, не все фрагменты Аβ являются в равной степени иммуногенными.

Иммуногенность конъюгатов Аβ пептида-KLH

С целью продемонстрировать, что иммунная сыворотка, полученная от морских свинок после иммунизации конъюгатами Аβ пептида-KLH подходит при человеческой БА, было проведено исследование для оценки иммунореактивности поликлональной сыворотки от морских свинок, иммунизированных конъюгатом Аβ(3-10)-KLH (SEQ ID № 40). Образцы сыворотки, полученные через четыре недели после второй инъекции конъюгата Аβ(3-10)-KLH (SEQ ID № 40) от морских свинок, исследовали в отношении реакции с тканями головного мозга при человеческой БА посредством иммуногистохимии (пример 4).

Как изображено на фиг.4, иммуногенный ответ, вызванный конъюгатом Аβ(3-10)-KLH (SEQ ID № 40), давал ответ антител, который был направлен против человеческой ткани головного мозга с БА. На фиг.4А продемонстрирована иммунореактивность моноклонального анти-Аβ антитела 6F3D (Vector Laboratories). Как показано, в таком головном мозге имеются избыточные отложения Аβ таким образом, который считается типичным для человеческой БА. На фиг.4В продемонстрировано отсутствие иммунной реакции сыворотки от заранее иммунизированных морских свинок. На фиг.4С показана положительная иммунная реакция сыворотки от той же морской свинки после двух инъекций конъюгата Аβ(3-10)-KLH (SEQ ID № 40). В целом, полученные данные демонстрируют, что иммуногенность, обнаруженная ELISA, включает существенный ответ антител, направленный против человеческого Аβ, обнаруженного в этой ткани с БА. Такие результаты подтверждают и расширяют неожиданное открытие различной иммуногенности, проявляемой определенными фрагментами Аβ, что далее демонстрирует, что такой ответ направлен образом, согласующимся с терапевтическим применением.

Получение конъюгатов ОМРС и множественных антигенных конъюгатов

На основании иммуногенности у морских свинок, относительного расположения пептидных фрагментов в аминокислотной последовательности Аβ₄₂, растворимости фрагментов Аβ и возможности использования ОМРС в качестве белка носителя Заявители выбрали семь 8-меров (фиг.2В) для конъюгирования с ОМРС. Такие пептидные фрагменты соответствовали следующим аминокислотным участкам Аβ: 1-8, 2-9, 3-10, 7-14, 17-24, 21-28 и 33-40.

Изобретение, описанное в настоящем описании, включает поливалентные пептидные конъюгаты, такие как показанные на фиг.5, 6А и 6В. Поливалентные, разветвленные МАР-ОМРС конъюгаты (фиг. 6А и 6В) получали с использованием лизиновой основы, тогда как поливалентные линейные конъюгаты 8-меров-ОМРС (фиг.5) получали с использованием PEG-линкера. Специалист в области техники понимает, что PEG-линкер, по сравнению с обычными аминокислотными линкерами, которые могут быть использованы в настоящем описании, дает преимущество более низкой иммуногенности и большей растворимости пептида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенным фрагментом является поливалентный МАР, конъюгированный с ОМРС. Специалисту должно быть понятно в области техники, что такое конъюгирование не является соотношением пептида и носителя 1:1. Скорее, множество пептидов прикреплено сферическим образом к каждой молекуле ОМРС. Кроме того, специалист в области техники должен понимать, что применение поливалентных линейных конструктов с МАР усилит растворимость, стабильность состава, иммуногенность и разнообразие поликлонального ответа.

Иммуногенность вакцин конъюгата ОМРС

В попытке оценить иммуногенность конъюгата Аβ пептида-ОМРС и для дальнейшей оценки преимущества добавки с таким конструктом вакцины заявители начали исследование у макак-резус. Резус-макак вакцинировали конъюгатом Аβ(1-18)-ОМРС (дозировка на основании содержания пептида Аβ), который рецептировали или с квасцами Merck (MAA) в качестве адъюванта или MAA и ISCOMATRIX® (CSL., Ltd., Parkville, Australia). Образцы крови получали и использовали для определения титров антител против Аβ₄₀. Промежуточный анализ этого продолжающегося исследования продемонстрировал, что после 1 введения (PD1) у макак, получивших 5 мкг вакцины в квасцах, не развились какие-либо определяемые титры, тогда как у получивших 30 мкг вакцины в квасцах развились низкие специфические титры к Аβ₄₀. У всех макак, которые получили композицию квасцов плюс ISCOMATRIX®, развились значительные титры специфических антител. После 2 введения (PD2) обе дозы конъюгата Аβ только в квасцах давали сходные титры антител, тогда как в группе, получившей квасцы плюс ISCOMATRIX®, появились титры антител в 10 раз выше относительно группы только с квасцами. Результаты этого исследования подтверждают, что конъюгат Аβ-ОМРС является иммуногенным у нечеловекообразных приматов. Данные, кроме того, демонстрируют, что эффективность такой конъюгированной вакцины существенно увеличивается адъювантом на основании сапонина, такой как ISCOMATRIX®.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Получение конъюгатов Аβ

Этот пример описывает получение пептидных фрагментов Аβ, в последующем используемых для конъюгатов Аβ для индукции иммунного ответа в форме антител к Аβ.

А. Получение пептидов Аβ (8-меров) (SEQ ID №№ 37-65; фиг.2А)

Пептиды, предназначенные для конъюгации с белками-носителями, полученными их малеимида, синтезировали с цистеиновым остатком на карбокси-конце. Линкер, Aha (6-аминогексановая кислота) включали между первичной последовательностью пептида и карбоксиконцевым цистеином в качестве структурного элемента для минимизации стерической доступности в отношении белка-носителя во время конъюгации. Кроме того, растворяющие остатки, представленные ЕЕЕ, ККК или PEG, вводили на С-конец в последовательностях 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. PEG компонент вводили как О-(N-Fmoc-2-аминоэтил)-O'-(2-карбоксиэтил)ундекаэтиленгликоль [Fmoc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₁₀CH₂CH₂OCH₂CH₂CO₂H].

Начиная с смолы Rink Amide MBHA, получали пептиды Аβ твердоф