2407785 - Соединение ws727713

Соединение ws727713

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к биотехнологии. Соединение WS727713 получено путем культивирования в среде для культивирования штамма актиномицетов рода Pseudonocardia FERM ВР-7570, продуцирующего это соединение, и выделено из культуральной жидкости. Соединение WS727713 используют в качестве модулятора рецептора меланокортина и применяют для модуляции рецептора меланокортина при производстве лекарственного или косметического средства и получении фармацевтической композиции. Кроме того, предложены фармацевтическая композиция, содержащая соединение WS727713, способ, включающий введение в организм человека или животного указанного соединения, и применение его для лечения или профилактики заболеваний, восприимчивых к регуляции рецепторов меланокортина. Группа изобретений обладает активностью модулятора рецептора меланокортина. 10 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл.

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому соединению, которое используют в качестве лекарственного или косметического средства, способу его получения и к фармацевтической композиции, содержащей это соединение.

Уровень техники

Меланокортин (МС) относится к группе пептидных гормонов, которые получают в результате посттрансляционных модификаций посредством ферментативного расщепления препрогормона. Меланокортины (MС) включают меланоцитстимулирующие гормоны (МСГ), например α-МСГ, β-МСГ и γ-МСГ, а также адренокортикотропный гормон (АКТГ). Эти MС регулируют различные физиологические функции посредством мембранных рецепторов МК (MC-R). Пять MC-R (MC1-R, MC2-R, MC3-R, MC4-R и MC5-R) клонированы и описаны. MC1-R (первым обнаруженный в качестве рецептора α-МСГ) экспрессируется в меланоцитах кожи и участвует в образовании эпидермальной меланиновой пигментации и окраске животного.

Недавно обнаружено, что MC1-R вовлечен в процесс боли и воспаления, и мРНК MC1-R эспрессируется клетками воспалительного инфильтрата, например нейтрофилами или мононуклеарными клетками. Вероятно, что MC1-R отвечает за ингибирующие действия α-MСГ на продукцию оксида азота в моноцитах и миграцию нейтрофилов. Экспериментальные данные показывают, что молекулы α-MСГ ослабляли воспалительную реакцию на экспериментальных животных моделях воспалительных реакций человека. α-MСГ уменьшал воспаление кожи мыши, индуцированное с помощью распространенных раздражителей. Также α-MСГ угнетал отек лапы мыши, индуцированный введением каррагенана. Таким образом, ожидается, что агонисты MC1-R будут пригодными в качестве лекарственных средств в отношении воспалительной реакции.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к новому соединению, которое используется в качестве модулятора рецепторов меланокортина, способу его получения и к фармацевтической или косметической композиции, содержащей это соединение.

Конкретнее, данное изобретение относится к соединению агониста рецептора меланокортина, которое уменьшает воспалительную реакцию.

Авторы данного изобретения также обнаружили, что модулятор рецептора меланокортина, например WS727713, имеет мощное противовоспалительное действие. Следовательно, модулятор рецептора меланокортина, например WS727713, пригоден в качестве активного ингредиента противовоспалительного средства и пригоден в качестве терапевтического или профилактического средства для таких заболеваний, восприимчивых к регуляции рецепторов меланокортина, как ишемическое/реперфузионное повреждение, воспалительные заболевания головного мозга, воспалительные заболевания почек, гепатит, сепсис/септический шок, гипоксический шок, острый респираторный дистресс синдром (ARDS), ревматоидный артрит (RA), подагрический артрит, регургитация крови при недостаточности аортального клапана (AR), ювенильный хронический артрит, остеоартрит, нефрит, индуцированная толерантность, контактная гиперчувствительность, воспалительная болезнь кишечника (IBD), нарушение половой функции, трансплантация, боль, прогрессирование ВИЧ до болезни, поствоспалительная гипопигментация, отрубевидный лишай, идиопатический каплевидный гипомеланоз, лихорадочное состояние, функциональное заболевание кишечника, ожирение, эффект насыщения, сахарный диабет, модуляция экзокринной функции кожи, седина (очаговая седина), седины, панкреатит, фиброзные заболевания (гипертрофические рубцы, келоиды, очаговая склеродермия, системный склероз, склеродермическая кожная реакция «трансплантат против хозяина», цирроз печени, идиопатический или индуцированный блеомицином фиброз легкого, нефропатия, индуцированная циклоспорином), увеит (главным образом при синдроме Бехчета и саркоидозе), васкулит, микробные инфекции, глютеновая болезнь, синдром вульварного вестибулита, инвазия меланомы, анорексия и тому подобное.

Исходя из этого одной из задач данного изобретения является предоставление соединения, которое имеет вышеуказанные виды биологической активности.

Другой задачей данного изобретения является предоставление способа получения WS727713 посредством ферментации в культуральной среде штамма, относящегося к роду Pseudonocardia, продуцирующего WS727713.

Еще одной задачей данного изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента WS727713.

Еще одной задачей данного изобретения является обеспечение применения модуляторов рецепторов меланокортина, например WS727713, для лечения и профилактики вышеуказанных заболеваний.

Таким образом, настоящее изобретение включает следующее.

(1) По существу очищенное соединение WS727713, имеющее следующие характеристики:

а) молекулярная формула: C₃₀H₄₄N₈O₈

b) ¹H спектр ядерного магнитного резонанса:

(500 МГц, ДМСО-d6) δ

9,76 (1Н, с, изменяемо), 8,76 (1Н, д, J=7,5 Гц, изменяемо), 8,23 (1Н, д, J=5 Гц, изменяемо), 7,76 (1Н, дд, J=8,5 и 3 Гц, изменяемо), 7,25-7,17 (5Н, м), 5,71 (1Н, дд, J=10,5 и 5 Гц), 5,08 (1Н, дд, J=11 и 4 Гц, изменяемо), 5,03 (1Н, м), 4,99 (1Н, м), 4,92 (1Н, м), 4,85 (1Н, м), 4,83 (1Н, д, J=3 Гц, изменяемо), 4,76 (1Н, ушир.д, J=12 Гц, изменяемо), 4,12 (1Н, дд, J=16,5 и 8,5 Гц), 3,65 (1Н, дд, J=16,5 и 3 Гц), 3,58 (1Н, м), 3,07 (1Н, дд, J=13,5 и 8,5 Гц), 2,94(1Н, ушир.д, J=13 Гц), 2,86 (1Н, дд, J=13,5 и 6 Гц), 2,73-2,68 (2Н, м), 2,58 (1Н, м), 2,24 (1Н, ушир.д, J=13 Гц), 2,08 (1Н, ушир.д, J=14 Гц), 1,88 (1Н, м), 1,67 (1Н, м), 1,55 (1Н, м), 1,42-1,36 (2Н, м), 1,21 (1Н, м), 1,19 (3Н, д, J=7 Гц), 1,09 (1Н, м), 0,76 (3Н, д, J=6,5 Гц), 0,75 (3Н, д, J=6,5 Гц).

с) ¹³С спектр ядерного магнитного резонанса:

(125 МГц, ДМСО-d6) δ

173,8 (с), 171,7 (с), 170,4 (с), 169,8 (с), 169,1 (с), 167,6 (с), 137,2 (с), 129,2 (д)х2, 128,0 (д)х2, 126,3 (д), 60,2 (д), 53,2 (т), 51,1 (д), 50,8 (д), 49,6 (д), 47,4 (д), 47,0 (т), 44,7 (д), 41,2 (т), 36,4 (т), 35,4 (т), 33,2 (т), 23,6 (д), 23,5 (т), 23,1 (кв), 21,7 (кв), 21,0 (т), 15,8 (кв).

(2) Штамм актиномицетов, относящийся к роду Pseudonocardia, который имеет депозитарный номер FERM ВР-7570.

(3) Соединение, обладающее активностью модулятора рецептора меланокортина, полученное в результате культивирования штамма актиномицетов по вышеуказанному абзацу (2), в среде для культивирования, и выделения этого соединения из культурального бульона.

(4) Способ получения соединения WS727713 по вышеуказанному абзацу (1), который включает культивирование в культуральной среде штамма, относящегося к роду Pseudonocardia, продуцирующего WS727713, и выделение соединения из этого культурального бульона.

(5) Способ по вышеуказанному абзацу (4), где штамм, продуцирующий WS727713, относящийся к роду Pseudonocardia, является штаммом актиномицетов по вышеуказанному абзацу (2).

(6) Фармацевтическая или косметическая композиция, содержащая соединение WS727713 по вышеуказанному абзацу (1) или его соль и фармацевтически приемлемый, по существу нетоксичный носитель или наполнитель.

(7) Соединение по вышеуказанному абзацу (1) для использования в качестве лекарственного или косметического средства.

(8) Способ получения соединения, обладающего активностью модулятора рецептора меланокортина, который включает культивирование в среде для культивирования штамма актиномицетов, относящегося к роду Pseudonocardia, который продуцирует соединение, обладающее активностью модулятора рецептора меланокортина, и выделение указанного соединения.

(9) Соединение, обладающее активностью модулятора рецептора меланокортина, которое получено посредством культивирования в среде для культивирования штамма актиномицетов, относящегося к роду Pseudonocardia, который продуцирует соединение, обладающее активностью модулятора рецептора меланокортина, и выделение данного соединения из этого культурального бульона.

(10) Модулятор рецептора меланокортина, включающий соединение по вышеуказанному абзацу (1) или его соль.

(11) Способ модуляции рецептора меланокортина, включающий введение в организм человека или животного соединения по вышеуказанному абзацу (1) или его соли.

(12) Применение соединения по вышеуказанному абзацу (1) или его соли для производства лекарственного или косметического средства для модуляции рецептора меланокортина.

(13) Фармацевтическая или косметическая композиция для лечения или профилактики ишемического/реперфузионного повреждения, воспалительных заболеваний головного мозга, воспалительных заболеваний почек, гепатита, сепсиса/септического шока, гипоксического шока, острого респираторного дистресс синдрома (ARDS), ревматоидного артрита (RA), подагрического артрита, регургитации крови при недостаточности аортального клапана (AR), ювенильного хронического артрита, остеоартрита, нефрита, индуцированной толерантности, контактной гиперчувствительности, воспалительной болезни кишечника (IBD), нарушения половой функции, трансплантации, боли, прогрессирования ВИЧ до болезни, поствоспалительной гипопигментации, отрубевидного лишая, идиопатического каплевидного гипомеланоза, лихорадочного состояния, функционального заболевания кишечника, ожирения, эффекта насыщения, сахарного диабета, модуляции экзокринной функции кожи, седины (очаговая седина), седины, панкреатита, фиброзных заболеваний (гипертрофические рубцы, келоиды, очаговая склеродермия, системного склероза, склеродермическая кожная реакция «трансплантат против хозяина», цирроза печени, идиопатического или индуцированного блеомицином фиброза легкого, нефропатии, индуцированной циклоспорином), увеита (главным образом при синдроме Бехчета и саркоидозе), васкулита, микробных инфекций, глютеновой болезни, синдрома вульварного вестибулита, инвазии меланомы или анорексии, которая содержит соединение по вышеуказанному абзацу (1) или его соль, и фармацевтически пригодный, по существу очищенный нетоксичный носитель или наполнитель.

(14) Способ лечения или профилактики ишемического/реперфузионного повреждения, воспалительных заболеваний головного мозга, воспалительных заболеваний почек, гепатита, сепсиса/септического шока, гипоксического шока, острого респираторного дистресс синдрома (ARDS), ревматоидного артрита (RA), подагрического артрита, регургитации крови при недостаточности аортального клапана (AR), ювенильного хронического артрита, остеоартрита, нефрита, индуцированной толерантности, контактной гиперчувствительности, воспалительной болезни кишечника (IBD), нарушения половой функции, трансплантации, боли, прогрессирования ВИЧ до болезни, поствоспалительной гипопигментации, отрубевидного лишая, идиопатического каплевидного гипомеланоза, лихорадочного состояния, функционального заболевания кишечника, ожирения, эффекта насыщения, сахарного диабета, модуляции экзокринной функции кожи, седины (очаговой седины), седины, панкреатита, фиброзных заболеваний (гипертрофические рубцы, келоиды, очаговая склеродермия, системный склероз, склеродермическая кожная реакция «трансплантат против хозяина», цирроз печени, идиопатический или индуцированный блеомицином фиброз легкого, нефропатия, индуцированная циклоспорином), увеита (главным образом при синдроме Бехчета и саркоидозе), васкулита, микробных инфекций, глютеновой болезни, синдрома вульварного вестибулита, инвазии меланомы или анорексии, который включает введение в организм человека или животного соединения по вышеуказанному абзацу (1) или его соли.

(15) Применение соединения по вышеуказанному абзацу (1) или его соли, для производства лекарственного средства для лечения или профилактики ишемического/реперфузионного повреждения, воспалительных заболеваний головного мозга, воспалительных заболеваний почек, гепатита, сепсиса/септического шока, гипоксического шока, острого респираторного дистресс синдрома (ARDS), ревматоидного артрита (RA), подагрического артрита, регургитации крови при недостаточности аортального клапана (AR), ювенильного хронического артрита, остеоартрита, нефрита, индуцированной толерантности, контактной гиперчувствительности, воспалительной болезни кишечника (IBD), нарушения половой функции, трансплантации, боли, прогрессирования ВИЧ до болезни, поствоспалительной гипопигментации, отрубевидного лишая, идиопатического каплевидного гипомеланоза, лихорадочного состояния, функционального заболевания кишечника, ожирения, эффекта насыщения, сахарного диабета, модуляции экзокринной функции кожи, седины (очаговой седины), седины, панкреатита, фиброзных заболеваний (гипертрофические рубцы, келоиды, очаговая склеродермия, системный склероз, склеродермическая кожная реакция «трансплантат против хозяина», цирроз печени, идиопатический или индуцированный блеомицином фиброз легкого, нефропатия, индуцированная циклоспорином), увеита (главным образом при синдроме Бехчета и саркоидозе), васкулита, микробных инфекций, глютеновой болезни, синдрома вульварного вестибулита, инвазии меланомы или анорексии.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 изображен график инфракрасного спектра.

На фигуре 2 изображен график ¹H спектра ядерного магнитного резонанса.

На фигуре 3 изображен график ¹³С спектра ядерного магнитного резонанса.

Лучший способ осуществления данного изобретения

Соединение, которое имеет мощное модулирующее действие на активность рецептора меланокортина, может быть описано посредством следующих характеристик. Графики инфракрасного спектра, ¹Н спектра ядерного магнитного резонанса и ¹³С спектра ядерного магнитного резонанса представлены на фигурах 1-3.

a) молекулярная формула: С₃₀H₄₄N₈О₈

b) ESI-MS (+:m/z): 645 (М+Н)⁺

c) инфракрасный спектр (фиг.1):

νmax (KBr): 3310, 2950, 1640, 1545, 1450, 1410, 1370, 1350, 1300, 1245, 1160, 1125, 1095, 995 см^-1

d) ¹H спектр ядерного магнитного резонанса (фиг.2):

(500 МГц, ДМСО-d6) δ

9,76 (1Н, с, изменяемо), 8,76 (1Н, д, J=7,5 Гц, изменяемо), 8,23 (1Н, д, J=5 Гц, изменяемо), 7,76 (1Н, дд, J=8,5 и 3 Гц, изменяемо), 7,25-7,17 (5Н, м), 5,71 (1Н, дд, J=10,5 и 5 Гц), 5,08 (1Н, дд, J=11 и 4 Гц, изменяемо), 5,03 (1Н, м), 4,99 (1Н, м), 4,92 (1Н, м), 4,85 (1Н, м), 4,83 (1Н, д, J=3 Гц, изменяемо), 4,76 (1Н, ушир.д, J=12 Гц, изменяемо), 4,12 (1Н, дд, J=16,5 и 8,5 Гц), 3,65 (1Н, дд, J=16,5 и 3 Гц), 3,58 (1Н, м), 3,07 (1Н, дд, J=13,5 и 8,5 Гц), 2,94 (1Н, ушир.д, J=13 Гц), 2,86 (1Н, дд, J=13,5 и 6 Гц), 2,73-2,68 (2Н, м), 2,58 (1Н, м), 2,24 (1Н, ушир. д, J=13 Гц), 2,08 (1Н, ушир.д, J=14 Гц), 1,88 (1Н, м), 1,67 (1Н, м), 1,55 (1Н, м), 1,42-1,36 (2Н, м), 1,21 (1Н, м), 1,19 (3Н, д, J=7 Гц), 1,09 (1Н, м), 0,76 (3Н, д, j=6,5 Гц), 0,75 (3Н, д, J=6,5 Гц).

с) ¹³С спектр ядерного магнитного резонанса (фиг.3):

(125 МГц, ДМСО-d6) δ

В частности, соединение WS727713 имеет следующие физико-химические характеристики:

Молекулярная формула: C₃₀H₄₄N₈O₈

ESI-MS(+:m/z): 645(M+H)⁺

HR-ESI-TOF/MS (+:m/z)

расчетное 645,3360 (М+Н)⁺

обнаруженное 645,3387 (М+Н)⁺

Удельная оптическая активность:

[α]_D(23°С) 32° (с=0,5, в ДМСО)

Растворимость:

Растворимо в: метаноле, ацетонитриле, ацетоне, этиловом эфире уксусной кислоты, ДМСО

Слаборастворимо в: Н₂О

Цветная реакция

Положительная: реакция паров иода, реакция с сульфатом церия, реакция Эрлиха, реакция Драгендорфа

Отрицательная: реакция Молиша, нингидриновая реакция

Тонкослойная хроматография (ТСХ):

Неподвижная фаза	Проявляющий растворитель	Значение Rf
Силикатный гель 60 F254*	СНСl₃:СН₃ОН=10:1	0,45
RP-18W F254S HPTLC*	МеСN:вода=80:20	0,53
* производство E.Merck

Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC)

Условия:

Подвижная фаза: 35% водный ацетонитрил

Колонка: Mightysil RP-18 GP (4,6×150 мм)

Скорость тока: 1,0 мл/минута

Детекция: УФ при 210 нм

Время удерживания: 9,3 минуты

Инфракрасный спектр (фиг.1):

νmax (KBr): 3310, 2950, 1640, 1545, 1450, 1410, 1370, 1350, 1300, 1245, 1160, 1125, 1095, 995 см^-1

¹H спектр ядерного магнитного резонанса (фиг.2):

(500 МГц, ДМСО-d6) δ

¹³С спектр ядерного магнитного резонанса (фиг.3):

(125 МГц, ДМСО-d6) δ

Цвет и состояние:

Белый кристалл

Температура плавления:

272-277°С (распад)

Особенности получения штамма №727713

Штамм №727713 изолировали из образцов опавших листьев, собранных в префектуре Чиба, Япония. Для таксономического исследования штамма №727713 применяли способы и культуры, описанные у Shirling and Gottlieb (Shirling, E.B. and D.Gottlieb: Methods for characterization of Streptomyces species. Int.J.Syst.Bacteriol. 16, 313-340, 1966), и у Waksman (Waksman, S.A.: The actinomycetes Vol.2: Classification, identification and description of genera and species: The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961). Исследования проводили после культивирования в течение 14 дней при 30°С. Морфологические исследования проводили на культурах, выращенных на витаминном агаре с гуминовой кислотой (Hayakawa, М. and Nonomura, H.: Humic acid-vitamin agar, a new medium for the selective isolation of soil actinomycetes. J.Ferment.Technol., 65, 501-509, 1987), с использованием светового микроскопа и сканирования с помощью электронного микроскопа. Температурный интервал для выращивания определили на крахмальном агаре с дрожжевым экстрактом, содержащем 2 г дрожжевого экстракта (Daigo Eiyo, Осака, Япония), 10 г растворимого крахмала, и 16 г агара в 1000 мл водопроводной воды (перед стерилизацией рН доводили до 7,2, используя 1 н. NaOH). Утилизацию углерода определяли в среде Pridoham и Gottlieb (Pridoham, T.G. and D. Gottlieb: The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an acid for species determination: J. Bacteriol. 56: 107-114, 1948), дополненной 0,1% дрожжевого экстракта. Названия цветов, используемые в этом исследовании, заимствованы из Methuen Handbook of Colour (Kornerup, A. and J.H.Wanscher: Methuen Handbook of Colour, Methuen, London, 1978). Подготовку клеток и определение изомера диаминопимелиновой кислоты осуществляли по методике Becker et al (Becker, В., M.P.Lechevalier, R.E.Gordon and H.A.Lechevalier: Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates: Appl. Microbiol. 12,421-423, 1964). Содержание сахара в клетке определяли по методике Lechevalier and Lechevalier (Lechevalier, M.P. and H.A.Lechevalier: Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycetes. Int.J.Sysfc.Bacteriol., 20, 435-443, 1970). Последовательность 16S рДНК определяли по методике Reichert et al. (Katrin Reichert, Andre Lipski, Silke Pradella, Erko Stackebrandt and Karlheinz Altendorf: Pseudonocardia asaccharolytica sp. nov. and Pseudonocardia sulfidoxydans sp.nov., two new dimethyl disulfide-degrading actinomycetes and emended description of the genus Pseudonocardia: Int.J.Syst-Bacteriol., 48, 441-449, 1998). Последовательности 16S рДНК типовых штаммов получали из базы данных DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp). Филогенетическое дерево конструировали, используя программу CLUSTAL (Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G.: The CLUSTAL X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 24: 4876-4882, 1997).

Его бактериологические характеристики были следующими. Характеристики культуры различных агаровых сред и физиологические характеристики указаны в таблице 1 и 2 соответственно. Рост штамма наблюдали на агаре с экстрактом дрожжей и солода, овсяном агаре, и железосульфитном агаре, содержащем пептон и дрожжевой экстракт, но не на крахмальном агаре, содержащем неорганические кислоты, глицерин-аспарагиновом агаре, и тирозиновом агаре. Воздушный мицелий наблюдали только на витаминном агаре с гуминовой кислотой, и цвет этой воздушной массы был белый. Цвет оборотной стороны культуры был светло-оранжевый. Меланоидные пигменты не образовывались в бульоне с дрожжевым экстрактом и триптоном и на железосульфитном агаре с пептоном. Растворимые пигменты не образовывались. Цветовой фон мицелия не был рН-чувствительным.

В отношении морфологических характеристик субстратный мицелий развивался хорошо и ветвился несимметрично. Наблюдали образование нароста сегментов гифов. Этот штамм вырабатывал воздушный мицелий с прямыми цепочками спор, который содержал более 10 спор в цепи. По форме споры были веретенообразные (1,6-2,3×0,5-0,6 мкм). Их поверхности были сглажены. Склеротические гранулы, спорангии, и подвижные поры, и фрагменты не наблюдались.

Штамм №727713 способен к росту в температурном интервале от 11 до 32°С, с оптимумом роста при 28°С.

Мезодиаминопимелиновую кислоту, лактозу и арабинозу определяли в клеточных гидролизатах этого штамма, типом клеточной стенки был тип IV.

Частичная последовательность штамма №727713 представлена в последовательности SEQ ID №1 в списке последовательностей. Степень сходства 16S рДНК между штаммом №727713 и членами рода Pseudonocardia составляет 91,8-97,4%, и они образуют единый кластер в филогенетическом дереве (данные не представлены).

Основываясь на вышеописанных морфологических и химических характеристиках и филогенетическом анализе, штамм №727713 рассматривается как принадлежащий к роду Pseudonocardia (Lechevalier, M.P. and H.A.Lechevalier: Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycefces. Int.J.Syst.Bacteriol., 20, 435-443, 1970; Pridham, T.G., et al.: Appl. Microbiol. 6: 54, 1958). Поэтому этот штамм обозначен как Pseudonocardia sp.№727713. Этот штамм был помещен в Международный банк-депозитарий запатентованных микроорганизмов (International Patent Organism Depositary) Национального Института Развития Промышленной науки и технологии (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-8566, Япония (адрес), под названием FERM ВР-7570 (дата депонирования: Апрель 25, 2001).

Таблица 1Характеристики культуры штамма №727713
Среда	Характеристики среды
Агар с экстрактом дрожжей и солода	G: хороший
А: не наблюдается
(ISP-2)	R: светло-оранжевый (5А5)
	S: не обнаружен
Овсяный агар (ISP-3)	G: умеренный
А: не наблюдается
R: светло-оранжевый (5А5)
S: не обнаружен
Крахмальный агар с неорганическими кислотами (ISP-4)	G: не наблюдается
Глицерин-аспарагиновый агар (ISP-5)	G: не наблюдается
Железосульфитный агар, содержащий дрожжевой экстракт и пептон (ISP 6)	G: слабый
А: не наблюдается
R: светло-оранжевый (5А5)
S: не обнаружен
Тирозиновый агар	G: не наблюдается

Аббревиатура А: воздушный мицелий, G: рост, S: растворимый пигмент, R: цвет оборотной стороны.

Эти признаки наблюдали через 14 дней инкубирования при 30°С. Интерпретация цвета основана на Methuen Handbook of Colour (Kornerup.A. and J.H.Wanscher, 3-rd ed., pp.252, Mefchuen, London, 1978).

Таблица 2Физиологические характеристики штамма №727713
Условия	Характеристики
Температурный интервал для роста	11-32°С
Оптимальная температура роста	28°С
Выработка меланоидных пигментов	-
Выработка растворимых пигментов	-
Утилизация углерода
D-глюкоза	+
Сахароза	+
D-ксилоза	+
D-фруктоза	+
L-рамноза	±
Раффиноза	+
L-арабиноза	+
Инозит	+
D-маннит	+

Должно быть понятно, что получение WS727713 не ограничено использованием конкретного описанного здесь организма, который приведен только в качестве иллюстрации. Это изобретение также включает использование любых мутантов, способных вырабатывать WS727713, в том числе природные мутанты и искусственные мутанты, которые могут быть получены из описанного организма посредством обычных способов, как например, технологии рекомбинантных ДНК, облучение рентгеновскими лучами, ультрафиолетовым излучением, обработка N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином, 2-аминопурином и тому подобное.

Получение WS727713

Из соединений, имеющих вышеописанные свойства, соединение WS727713 получают, когда щтамм, вырабатывающий WS727713, принадлежащий к роду Pseudonocardia, растет в среде для культивирования, содержащей источники усвояемого углерода и азота при аэробных условиях (например, перемешиваемая культура, взвешенная культура, и тому подобное).

Предпочтительными источниками углерода в среде для культивирования являются углеводы, например глюкоза, сахароза, крахмал, фруктоза или глицерин и т.п.

Предпочтительными источниками азота являются арахисовая пудра, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, пептон, полипептон, глютеновая мука, пудра из семени хлопчатника, порошок из соевых бобов, соевая мука, кукурузный экстракт, сухие дрожжи, пшеничный зародыш, и т.п., а также неорганические и органические соединения азота, например соли аммония (например, нитрат аммония, сульфат аммония, фосфат аммония, и т.п.), мочевина или аминокислота или что-либо подобное.

Источники углерода и азота, даже успешно используются в комбинации, не обязательно должны использоваться в их очищенной форме, потому что менее очищенные вещества, содержащие следы факторов роста и значительные количества минеральных питательных веществ, также пригодны для использования.

При желании в среду для культивирования можно добавить минеральные соли, например, карбонат натрия или кальция, фосфат натрия или калия, хлорид натрия или калия, иодид натрия или калия, магниевые соли, соли меди, соли цинка, соли железа, или соли кобальта, или что-либо подобное.

При необходимости, особенно если среда для культивирования сильно пенится, можно добавить антивспенивающий агент, например жидкий парафин, жидкий жир, растительное масло, минеральное масло, силикон или что-либо подобное. Перемешивание и аэрацию культуральной смеси можно проводить различными путями, например, перемешивание с помощью винта или схожего устройства для механического перемешивания, посредством вращения или встряхивания ферментера, и тому подобное. Ферментацию обычно проводят при температуре приблизительно между 10°С и 40°С, предпочтительно от 20°С до 30°С, в промежуток времени приблизительно от 50 часов до 150 часов, который может варьировать в зависимости от ферментационных условий и уровней.

Полученный культуральный бульон для выделения соединения WS727713 затем подвергают различным процедурам, обычно используемым для восстановления и очистки биологически активных веществ, например, экстрагированию растворителем с использованием соответствующего растворителя или смеси некоторых растворителей, хроматографии или рекристаллизации из соответствующего растворителя или их смеси.

Соединение WS727713 может быть в виде сольвата, что находится в объеме настоящего изобретения. Сольват предпочтительно включает в себя гидрат и этанолат.

В качестве примеров, демонстрирующих биологические свойства вышеуказанных соединений, некоторые биологические данные представлены далее.

Тест 1. Анализ связывания

Буфер для связывания состоял из 25 мМ HEPES-KOH (рН 7,0), 1,5 мМ CaCl₂, 1 мМ MgSO₄, 100 мМ NaCl, 1 мМ 1, 10-фенантролина, 0,2% BSA, и 1 таблетки полного ингибитора протеаз ТМ (Complete ТМ Protease Inhibitor)/100 мл (Boehringer-Mannheim). Анализ связывания был модифицирован с помощью метода Receptor Biology, Inc. Мембранная суспензия (25 мкл), [¹²⁵I] -NDP-MSH (25 мкл, NEN, 3,08×10^-11 М конечно), буфер (50 мкл) и ингибитор инкубировали 60 мин при 37°С. Затем смесь фильтровали через фильтр GF/C (предварительно вымоченный в 0,5% полиэтиленимине), и дважды отмывали ледяным PBS (-). После высушивания, используя счетчик Top Counter (Packard) измеряли радиоактивность частиц, осажденных на фильтре GF/C.

Клетки В16 росли в среде RPMI1640, с добавлением 10% FBS и антибиотиков. Субсливающиеся клетки дважды отмывали ледяным PBS (-) и отскабливали. Затем эти клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали при 2000 оборотах в минуту при 4°С в течение 5 мин. Супернатант, полученный таким образом, центрифугировали при 30000 оборотах в минуту при 4°С в течение 60 мин. Мембранную фракцию суспендировали в ледяном PBS (-) и хранили при -80°С.

Финальные концентрации каждого рецепторного белка были следующие: MC1-R (В16) 0,139 мг/мл; MC3-R (рекомбинантный*) 0,0693 мг/мл; MC4-R (рекомбинантный*) 0,104 мг/мл; и MC5-R (рекомбинантный*) 0,070 мг/мл (*: из Receptor Biology, Inc.)

Как показано в Таблице 3, соединение WS727713 ингибировало связывание [¹²⁵I]-NDP-MSH рецепторами меланокортина. Результат показывает, что соединение WS727713 будет работать как агонист или антагонист рецепторов меланокортина.

Таблица 3Эффекты WS727713 и NDP-MSH на связывание [¹²⁵I] -NDP-MSH рецепторами меланокортина
IC50 (М)	MC1-R	MC3-R	MC4-R	MC5-R
NDP-MSH	4,05×10^-11	8,15×10^-11	2,64×10^-10	5,58×10^-10
WS727713	1,21×10^-7	4,16×10^-6	1,81×10^-6	2,50X10^-6

Тест 2. Дозозависимое снижение продукции TNF-α, индуцированной LPS, посредством соединения WS727713 у мышей

Фактор некроза опухоли (TNF-α) лежит в основе патологических процессов и функциональных расстройств при остром и хроническом воспалительном заболевании и повреждении. Нейроиммуномодуляторный пептид α-МСГ модулирует действие и продукцию провоспалительных цитокинов, в том числе TNF-α. Для исследования WS727713 самцам мыши (ICR) внутрибрюшинно инъецировали либо липополисахарид (LPS; Sigma, L-3129, E.coli 0127:В8, 100 мкг/особь) в физиологическом растворе, либо только физиологический раствор в двух повторяющихся экспериментах. За 30 мин до инъекции LPS внутрибрюшинно вводили WS727713. Через 60 мин после инъекции LPS мышей умерщвляли. Уровни TNF-α в плазме крови измеряли, используя твердофазный иммуноферментный анализ (набор TNF-α ELISA; Amersham). Этот результат представлен в Таблице 4.

Как показано в Таблице 4, уровень TNF-α, индуцированного LPS, был снижен в дозозависимой манере в результате введения WS727713. Результат демонстрирует, что WS727713 действует как агонист рецептора меланокортина.

Таблице 4Эффект WS727713 на выработку TNF-α, индуцированную LPS, у мышей
	Уровень TNF-α в плазме крови (пг/мл)	Ингибирование (%)
Контрольный носитель (0,5% МС/физиологический раствор)	8533±1602	0
WS727713 (10 мг/кг, внутрибрюшинно)	3695±385	56,7
WS727713 (32 мг/кг, внутрибрюшинно)	2556±892	70,0
WS727713 (100 мг/кг, внутрибрюшинно)	2038±973	76,1
NDP-MSH (100 мкг/особь, внутрибрюшинно)	4808±175	43,7
NDP-MSH (100 мкг/особь, внутривенно)	2187±1120	74,4
МС: метилцеллюлоза

По существу чистое соединение WS727713 представляет собой модулятор рецепторов меланокортина MC1-R, MC3-R, MC4-R и/или MC5-R, в частности имеющее действие агониста MC1-R. Фармацевтическая композиция, содержащая по существу чистое соединение WS727713, используется в качестве терапевтического или профилактического средства заболеваний, вызванных воспалительным или иммунным состоянием. Кроме того, оно используется для лечения воспаления, в частности воспаления, вызванного активацией NF-кВ и/или высвобождением воспалительных цитокинов.

Более того, фармацевтические препараты, содержащие в себе по существу чистое соединение WS727713, используются для лечения или профилактики следующих заболеваний.

Заболевания, ассоциированные с хроническим или острым воспалением и иммунной модуляцией, например воспалительная болезнь кишечника, синдром раздраженной толстой кишки, глютеновая болезнь, заболевание желчного пузыря, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, ревматоидный артрит, подагрический артрит, остеоартрит, остеопороз, травматический артрит, артрит, обусловленный краснухой, дистрофия мышечной ткани, панкреатит (острый или хронический), псориаз, гломерулонефрит, сывороточная болезнь, волчанка (системная красная волчанка), крапивница, склеродерма, склеродермия, хронический тиреоидит, диффузный токсический зоб, дерматит (контактный или атопический), синдром вульварного вестибулита, дерматомиозит, алопеция, атопическая экзема, ихтиоз, лихорадка, сепсис, мигрень, кластерная головная боль, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Крейтцфельда-Якоба, рассеянный склероз, туберкулез, деменция, и отторжения трансплантата

(например, почки, печени, сердца, легкого, поджелудочной железы, костного мозга, роговицы, тонкой кишки, кожных аллотрансплантатов, кожных гомотрансплантатов, и ксенотрансплантатов, и тому подобное).

Респираторные аллергические реакции и заболевания, например астма, синдром острой дыхательной недостаточности, поллиноз, аллергический ринит и хроническое обструктивное заболевание легких; воспалительные заболевания центральной нервной системы, например ВИЧ-энцефалит, церебральная малярия, менингит, и атаксия-телеангиэктазия; и боль, например, послеоперационная боль, нейромыщечная боль, головная боль, боль, обусловленная злокачественным новообразованием, зубная боль и боль при воспалении суставов.

Вирусные и аутоиммунные заболевания, вызванные, например, вирусом простого герпеса типа 1 (HSV-1), вирусом простого герпеса типа 2 (HSV-2), цитомегаловирусом, вирусом Эпштейна-Барра, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), болезнь Аддисона (аутоиммунное заболевание надпочечников), идиопатическая недостаточность надпочечников, аутоиммунное полигландулярное заболевание (также известное как аутоиммунный полигландулярный синдром), хронический активный гепатит или инфекция острого гепатита (в том числе гепатит А, гепатит В, и гепатит С), аутоиммунный гастрит, аутоиммунная гемолитическая анемия и аутоиммунная нейтропения; грибковые инфекции, например грибовидный микоз.

Заболевания сердечно-сосудистой системы, например атеросклероз, атеросклеротическое поражение трансплантата, заболевание периферических сосудов, воспалительное заболевание сосудов, перемежающаяся хромота, рестеноз, цереброваскулярный инсульт, преходящее нарушение мозгового кровообращения, ишемия миокарда или инфаркт миокарда, гипертензия, гиперлипидемия, болезнь коронарных артерий, нестабильная стенокардия, тромбоз, агрегация тромбоцитов, индуцированная тромбином, и/или последствия болезни, возникшие в результате тромбоза, и/или образование атеросклеротических бляшек.

Инсульт и другие ишемические заболевания головного мозга и/или нейродегенеративные заболевания, ассоциированные с ними, и нейродегенеративные состояния или последствия черепно-мозговой травмы.

Солнечная эритема, акне, витилиго, гнездная алопеция, нарушения светочувствительности, альбинизм, поседение (очаговое поседение), седина, сухая кожа и Порфирия.

Нейродегенеративные расстройства, например депрессия, тревога, невроз навязчивых состояний, (обессивно-компульсивное расстройство), невроз, психоз, бессонница/расстройство сна, апноэ во сне и лекарственная или наркотическая зависимость.

Половые расстройства у мужчин, например половое бессилие, утрата либидо, и эректильная дисфункция (в том числе, неспособность достижения или поддерживания эрекции, отсутствие семяизвержения, преждевременная эякуляция или неспособность достижения оргазма). Половые расстройства у женщин, например нарушение полового возбуждения или нарушения, относящиеся к желанию, половой восприимчивости, оргазму и/или нарушения триггерных зон половой функции, и боль при половом акте, преждевременные роды, дисменорея, избыточная менструация и эндометриоз.

Нарушения массы тела, например ожирение или анорексия (например, из-за изменения аппетита, интенсивности метаболизма потребления жира или избыточного потребления углеводов); сахарный диабет (из-за увеличения толерантности к глюкозе и/или снижения резистентности к инсулину).

Злокачественное новообразование легкого, поджелудочной железы, толстого кишечника, молочной железы, яичников и кости, кожи (например, инвазия меланомы) или ангиогенные нарушения, в том числе образование или рост солидной опухоли.

Фиброзные заболевания, например гипертрофические рубцы, келоиды, очаговая склеродермия, системный склероз, склеродермическая кожная реакция «трансплантат против хозяина», цирроз печени, идиопатический или индуцированный приемом блеомицина фиброз легкого, и индуцированная циклоспорином нефропатия.

Ветеринарное заболевание, например ветеринарные вирусные инфекции, в том числе кошачий вирус иммунодефицита, бычий вирус иммунодефицита и вирус иммунодефицита псовых.

Увеит, главным образом при синдроме Бехчета и саркоидозе, васкулит и микробные инфекции.

Фармацевтическая и косметическая композиция по данному изобретению может быть использована в форме фармацевтического препарата, например в твердой, пол

Соединение ws727713

Патент 2407785