Способ получения жидкого коджи

Способ получения жидкого коджи

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу получения жидкого коджи, в частности способу получения жидкого коджи с повышенной ферментативной активностью.

Что касается коджи, используемого в производстве алкогольных напитков, существует твердый коджи, который выращивают посредством того, что споры волокнистых грибков высевают на сырье, прошедшее термическую обработку и т.п., и жидкий коджи, который выращивают посредством того, что сначала путем добавления в воду сырья и других источников питательных веществ создают жидкую среду, а потом в эту среду высевают споры плесени коджи или уже выращенные грибницы плесени коджи и т.п.

В традиционном производстве ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких, как алкогольные напитки, включая, например, сакэ, шочу, соевый соус, ферментированная паста из соевых бобов, сладкая сакэ и т.п., то, что называется твердым коджи, приготовляемым методом твердой культуры, получило широкое применение. Метод твердой культуры - это метод культивирования, в котором споры плесени коджи, такие, как Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae и подобные им, рассеивают на твердом сырье типа термообработанного зерна, чтобы позволить плесени коджи расти на твердой поверхности.

Например, для изготовления шочу широко используется такой твердый коджи, как Aspergillus kawachii и Aspergillus awamori. Однако поскольку метод твердой культуры является системой культивирования, в которой сырье и плесень коджи распределяются неравномерно, трудно обеспечить однородность таких параметров, как температура, содержание воды и различные питательные составы, и метод твердой культуры очень сложен с точки зрения контролирования культуры. В дополнение к этому, получение коджи часто осуществляется в открытых условиях, так что для предотвращения загрязнения другими бактериями требуется большая тщательность при контролировании качества. По этой причине метод твердой культуры непригоден для широкомасштабного производства.

В противоположность этому, метод жидкой культуры обеспечивает легкий контроль культуры и качества, по причине чего он пригоден для эффективного производства. Однако по той причине, что, например, ферментативная активность недостаточна для варения шочу, культура, полученная культивированием плесени коджи в жидкой среде, редко используется как коджи для шочу. Культурой, полученной в методе жидкой культуры, может быть сама культура, полученная методом культивирования в жидкой среде (здесь и далее также называемая «жидким коджи»), а также культуральная жидкость, клетки и их концентрат или их сухой порошок.

В дополнение к вышеуказанным причинам, весомой причиной, по которой культура, полученная методом культивирования в жидкой среде, не используется для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких, как шочу, является то, что известно, что поведение плесени коджи, состоящее в производстве таких белков, как амилаза и целлюлаза, в жидкой культуре сильно отличается от соответствующего поведения в твердой культуре, и также известно, что продуктивность этих белков в целом низка (см. непатентные документы 1 и 2).

В производстве алкогольных напитков, таких, как шочу, алкоголь обычно генерируется в процессе одновременного засахаривания и брожения. В силу этого расщепляющие сахар ферменты плесени коджи, которые влияют на снабжение плесени коджи глюкозой, в частности, глюкоамилаза и кислотоустойчивая α-амилаза, являются ключевыми ферментами в алкогольном брожении. Однако, известно, что в культуре, полученной методом культивирования в жидкой среде, активность глюкоамилазы крайне низка, и ее производительность также сильно отличается от производительности в твердой культуре (см. непатентные документы 3-6).

В качестве способа улучшения глюкоамилазной активности плесени коджи, есть сообщения о способе культивирования плесени коджи, в котором упор делается на выращивание грибницы (см. патентный документ 1), и о способе, в котором жареные зерновые добавляются в жидкую культуру плесени коджи (см. патентный документ 2). В способе, раскрытом в патентном документе 1, культивирование осуществляют на пористой мембране или в инклюзивном связующем агенте, имеющим воздушные полости, что обеспечивает экспрессию нового гена glaB, кодирующего глюкоамилазу, для повышения, таким образом, ферментативной активности.

Соответственно, этот метод требует строгого контроля и специфического оборудования для выращивания, по причине чего неудобен для практического применения. В методе же, раскрытом в патентном документе 2, плесень коджи разводят в жидкой среде с использованием жареных зерновых в качестве, по меньшей мере, части сырья, что требует дополнительной стадии жарения зерновых.

Авторы настоящего изобретения предоставили изобретение, относящееся к способу выращивания плесени коджи с использованием жидкой среды, содержащей сахариды, которые плесень коджи разлагает с трудом (см. патентный документ 3). Путем культивирования плесени коджи в жидкой среде с использованием настоящего изобретения, культура плесени коджи, имеющая высокую активность гликолитических ферментов, таких, как глюкоамилаза, что может быть использовано для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких, как сакэ, может быть получена удобным и недорогим способом.

С другой стороны, недавно был проведен детальный молекулярно-биологический анализ кислотоустойчивой α-амилазы (см. непатентный документ 7). Анализ принес следующие результаты: белая плесень коджи имеет два разных гена амилазы, которые соответственно отвечают за две разные характеристики, а именно, некислотоустойчивая α-амилаза и кислотоустойчивая α-амилаза. Характер экспрессии соответствующих генов сильно различен. При жидком культивировании, некислотоустойчивая α-амилаза производится в достаточных количествах, тогда как кислотоустойчивая α-амилаза, являющаяся ключевым ферментом в производстве шочу, едва ли производится.

Для производства шочу сбраживание производится при низком pH с целью предотвращения гниения шочу-каши. Некислотоустойчивая амилаза вносит очень маленький вклад в гликолиз при варении шочу, потому при низком pH она быстро инактивируется. Таким образом, для производства шочу является безусловно необходимым, чтобы, путем жидкого выращивания плесени коджи, кислотоустойчивая α-амилаза производилась в большом количестве, что, как считают, вносит вклад в гликолиз при сбраживании шочу.

Характеристики производства кислотоустойчивой α-амилазы при жидком выращивании плесени коджи были детально исследованы и опубликованы. Однако, в данном способе используется синтетическая среда, содержащая пептон и раствор цитратного буфера и требующая 100 или более часов выращивания культуры, по причине чего ее было бы трудно использовать в самом варении шочу (см. непатентные документы 8-10).

Как описано выше, вообще, считается, что кислотоустойчивая α-амилаза - это фермент, который по существу не может быть получен путем жидкого культивирования, и, таким образом, жидкий коджи, имеющий высокую активность кислотоустойчивой α-амилазы, не разрабатывался.

Патентный документ 1: JP 11-225746 A

Патентный документ 2: JP 2001-321154 A

Патентный документ 3: JP 2003-265165 A

Непатентный документ 1: Iwashita K. et al: Biosci. Biotechnol. Bioche., 62, 1938-1946(1998)

Непатентный документ 2: Yuichi Yamane et al.: Journal of the Brewing Society of Japan, 99, 84-92(2004)

Непатентный документ 3: Hata Y. et al.: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997)

Непатентный документ 4: Hata Y. et al.: Gene., 207, 127-134 (1998)

Непатентный документ 5: Ishida H. et al.: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998)

Непатентный документ 6: Ishida H. et al.: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000)

Непатентный документ 7: Nagamine K. et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem, 67, 2194-2202 (2003)

Непатентный документ 8: Sudo S. et al.: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993)

Непатентный документ 9: Sudo S. et al.: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994)

Непатентный документ 10: Shigetoshi Sudo et al.: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994).

Раскрытие изобретения

Проблема, которую изобретение разрешает

Авторы настоящего изобретения выяснили, что жидкий коджи, в достаточной степени имеющий активность ферментов, таких, как глюкоамилаза, кислотоустойчивая α-амилаза и им подобные, необходимые для производства шочу и ему подобных, могут быть получены путем культивирования плесени коджи в жидкой среде, содержащей в качестве культурального сырьевого материала зерна, поверхность которых полностью или частично покрыта шелухой, и уже подали заявки на патенты (см. описания патентной заявки JP No. 2004-350661 и патентной заявки JP No. 2004-352320).

Однако характеристики производства ферментов, за исключением глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы, в этих способах остались неизвестными.

Цель настоящего изобретения - разработать способ увеличения ферментативной активности амилолитических ферментов, таких, как глюкоамилаза и кислотоустойчивая α-амилаза, и других ферментов в жидком коджи. В частности, цель настоящего изобретения - предоставить способ получения жидкого коджи, имеющего высокую активность фермента, путем оптимизации состава жидкой среды.

Средства для решения проблемы

Ввиду того, что в жидком кожди достигается повышенное производство ферментов, авторы настоящего изобретения глубоко исследовали свойства комбинаций видов вышеупомянутого культурального сырьевого материала и различных источников питательных веществ, и выяснили, что продуктивность глюкоамилазы, являющейся амилолитическим ферментом, целлюлазы, являющейся целлюлолитическим ферментом, и кислотной карбоксипептидазы, являющейся протеолитическим ферментом, может быть увеличена, если в жидкую среду включить специальный источник азота и, дополнительно к этому, позволить источнику азота сосуществовать, по меньшей мере, с одним из двух - сульфатом или фосфатом, и, таким образом, оформили изобретение.

То есть, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента, способ, включающий культивирование белой плесени коджи и/или черной плесени коджи в жидкой среде, содержащей источник азота, при использовании в качестве культурального сырьевого материала зерна, поверхность которого полностью или частично покрыта шелухой.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором источник азота включает нитратную соль.

В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором источник азота включает, по меньшей мере, один из группы, состоящей из дрожжевых клеток или их обработанных продуктов, шелухи и отрубей зерновых, или их смеси с нитратной солью.

В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором жидкая среда содержит нитратную соль в концентрации от 0,05 до 2,0% (вес./об.).

В соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии со вторым аспектом, в котором жидкая среда далее содержит фосфатную соль.

В соответствии с шестым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с пятым аспектом, в котором жидкая среда содержит фосфатную соль в концентрации от 0,05 до 1,0% (вес./об.).

В соответствии с седьмым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с пятым аспектом, в котором жидкая среда далее содержит сульфатную соль.

В соответствии с восьмым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с седьмым аспектом, в котором жидкая среда содержит сульфатную соль в концентрации от 0,01 до 0,5% (вес./об.).

В соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором фермент включает один или два или более из группы, состоящей из амилолитического фермента, целлюлолитического фермента и протеолитического фермента.

В соответствии с десятым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором зерно включает рис, пшеницу, ячмень, гречку, японское просо, итальянское просо, просо, сорго или кукурузу.

В соответствии с одиннадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен жидкий коджи, полученный способом в соответствии с любым из аспектов с первого по десятый.

В соответствии с двенадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения ферментного препарата, включающий применение жидкого коджи в соответствии с одиннадцатым аспектом.

В соответствии с тринадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен ферментный препарат, полученный способом в соответствии с двенадцатым аспектом.

В соответствии с четырнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента, включающий получение фермента путем культивирования белой плесени коджи и/или черной плесени коджи в жидкой среде, содержащей источник азота и, в качестве культурального сырьевого материала, зерно, поверхность которого полностью или частично покрыта шелухой.

В соответствии с пятнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором источник азота включает нитратную соль.

В соответствии с шестнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором источник азота включает, по меньшей мере, один из группы, состоящей из дрожжевых клеток или их обработанных продуктов, шелухи и отрубей зерновых, или их смеси с нитратной солью.

В соответствии с семнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором жидкая среда содержит нитратную соль в концентрации от 0,05 до 2,0% (вес./об.).

В соответствии с восемнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с пятнадцатым аспектом, в котором жидкая среда далее содержит фосфатную соль.

В соответствии с девятнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с восемнадцатым аспектом, в котором жидкая среда содержит фосфатную соль в концентрации от 0,05 до 1,0% (вес./об.).

В соответствии с двадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с восемнадцатым аспектом, в котором жидкая среда далее содержит сульфатную соль.

В соответствии с двадцать первым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с двадцатым аспектом, в котором жидкая среда содержит сульфатную соль в концентрации от 0,01 до 0,5% (вес./об.).

В соответствии с двадцать вторым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором фермент включает один или два или более из группы, состоящей из амилолитического фермента, целлюлолитического фермента и протеолитического фермента.

В соответствии с двадцать третьим аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором зерно включает рис, пшеницу, ячмень, гречку, японское просо, итальянское просо, просо, сорго или кукурузу.

В соответствии с настоящим изобретением, специфическое органическое и/или неорганическое вещество в качестве источника азота добавляется в жидкую среду, содержащую в качестве культурального сырьевого материала зерно, поверхность которого полностью или частично покрыта шелухой, далее туда добавляется сульфатная соль и фосфатная соль, и плесень коджи выращивается в жидкой среде, что приводит не только к заметному улучшению производительности амилолитических ферментов в жидком коджи, но также обеспечивает получение жидкого коджи, содержащего большие количества целлюлолитических и протеолитических ферментов. В дополнение к этому, считается, что производительность ферментов, производимых плесенью коджи, обычно улучшается, даже если это не вышеупомянутые ферменты.

Когда ферментированные пищевые продукты и напитки, такие, как шочу, производятся с использованием жидкого коджи, полученного в соответствии с настоящим изобретением, хорошее ферментирование имеет место благодаря понижению вязкости каши в силу высокой активности целлюлолитических ферментов, по причине чего может ожидаться повышение выхода алкоголя. В дополнение к этому, по причине высокой активности протеолитических ферментов, повышается производство аминокислот, благодаря чему можно производить ферментированные пищевые продукты и напитки с великолепным привкусом.

Далее, по сравнению с твердым культивированием, жидкое культивирование строго управляется, так что можно дешево производить жидкий коджи, отличающийся стабильным качеством.

Кроме того, зерновые, используемые в настоящем изобретении, являются неочищенными или очищенными до такой степени, что, по меньшей мере, шелуха остается на поверхности. Таким образом, можно ожидать улучшение ситуации в плане доступности сырья и выхода продукта.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием нитрата калия в качестве источника азота. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.2 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием соединения с неорганическим азотом и неорганической соли. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.3 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием дрожжевых клеток и дрожжевого лизата в качестве источника азота. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.4 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием комбинации соединения с неорганическим азотом, неорганической соли и дрожжевых клеток. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.5 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием комбинации ячменных отрубей, дрожжевых клеток и соединения с неорганическим азотом в качестве источника азота. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.6 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием комбинации ячменной шелухи и дрожжевых клеток в качестве источника азота. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.7 иллюстрирует активность различных ферментов культур плесени коджи, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием сульфатной соли, соли нитрата и фосфатной соли. Панели от (А) до (D) иллюстрируют активности (ед./мл) глюкоамилазы (GA), кислотоустойчивой α-амилазы (ASAA), целлюлазы (CEL) и кислотной карбоксипептидазы (ACP).

Ниже подробно описаны предпочтительные варианты выполнения.

Способ получения жидкого коджи в соответствии с настоящим изобретением включает стадию культивирования плесени коджи в жидкой среде, приготовленной путем добавления в нее сырья, такого, как зерно, и источников азота, что приводит к получению жидкого коджи с повышенной ферментативной активностью.

В более частном случае, в настоящем изобретении плесень коджи выращивается с помощью жидкой среды, которая содержит зерна, поверхность которых полностью или частично покрыта шелухой, и, таким образом, требуется определенное время на засахаривание крахмалов в зернах, скорость выхода сахаридов в культуру понижается, в силу чего ферментативная активность жидкого коджи повышается. Далее, различные ферменты производятся плесенью коджи в больших количествах, потому что жидкая среда содержит специальные источники азота.

Здесь примеры ферментов, которые могут производиться плесенью коджи, включают (но без ограничения этим) амилолитический фермент, такой, как глюкоамилаза и α-амилаза, целлюлолитический фермент, такой, как целлюлаза и β-глюкозидаза, и протеолитические ферменты, такие, как кислотная карбоксипептидаза или кислотная протеаза.

В настоящем изобретении примеры зерна, которые могут использоваться как сырье для культуры, включают ячмень, рис, пшеницу, гречку, японское просо, итальянское просо, просо, сорго, кукурузу и т.п. Каждый из материалов, используемых в качестве культурального сырьевого материала, должен быть в форме, поверхность которой полностью или частично покрыта шелухой. Может использоваться необработанный материал или материал, имеющий равный или больший показатель обработки, при котором он был обработан, так что шелуха, по меньшей мере, осталась на поверхности зерен; также могут использоваться сырой рис, сырой ячмень, и т.п. В случае риса, может использоваться сырой рис, рис со всей чешуей и рис с частью чешуи.

Например, когда зерном является ячмень, может использоваться необработанный материал с показателем обработки в 100%, либо при условии, что показатель обработки необработанного материала определяется как 100%, а материал имеет показатель обработки, полученный вычитанием процента шелухи ячменя (обычно 7-8%) из показателя обработки необработанного материала, то есть показатель обработки не менее примерно 92-93%.

Здесь термин «показатель обработки» обозначает процент того, что осталось после обработки зерна. Например, термин «показатель обработки в 90%» означает, что 10% шелухи и прочего из части, соответствующей поверхностному слою, было удалено. В настоящем изобретении, более того, термин «сырой ячмень» включает все, от необработанного ячменя до обработанного ячменя, имеющего оставшуюся на поверхности зерен шелуху, то есть материал с показателем обработки в 90% или более. В дополнение к этому, термин «шелуха» относится к внешней части, которая покрывает поверхности зерна.

Любой из вышеупомянутых типов культурального сырьевого материала используется сам по себе, либо два или более типа используются в сочетании для приготовления последующей жидкой среды. Другими словами, для приготовления жидкой среды зерно в качестве культурального сырьевого материала смешивают с водой в комбинации с описанным здесь источником азота. Значение показатель смешивания зерна устанавливается таким, чтобы ферменты, такие, как амилолитический фермент, целлюлолитический фермент и протеолитический фермент, избирательно генерировались и накапливались в выращиваемой культуре плесени коджи.

Например, когда в качестве культурального сырьевого материала используется ячмень, жидкая среда приготовляется путем добавления в воду от 1 до 20% (вес./об.) сырого ячменя. Когда в качестве сырого ячменя используется необработанный ячмень, более предпочтительно, жидкая среда приготовляется путем добавления от 8 до 10% (вес./об.). Когда используется ячмень с показателем обработки в 95%, более предпочтительно, жидкая среда приготовляется путем добавления от 1 до 4% (вес./об.).

В дополнение к этому, когда в качестве культурального сырьевого материала используется рис, у которого была удалена чешуя, жидкая среда приготовляется путем добавления в воду от 1 до 20% (вес./об.) сырого риса, предпочтительно от 5 до 13% (вес./об.), более предпочтительно от 8 до 10% (вес./об.).

Когда используются другие зерновые, жидкая среда приготовляется таким же образом - путем добавления в воду от 1 до 20% (вес./об.) зерновых.

При таком подходе наиболее пригодное для смешивания количество варьируется в зависимости от степени очистки используемых сырья, штаммов коджи, вида сырья и тому подобного, так что с учетом этих факторов оно может быть выбрано подобающим образом.

Когда количество культурального сырьевого материала превышает верхнее пороговое значение, вязкость среды возрастает, и приток кислорода или воздуха, требуемый для аэробного культивирования плесени коджи, становится недостаточным для того, чтобы культура развивалась, и такой случай не является желательным. С другой стороны, когда количество культурального сырьевого материала не отвечает нижнему пороговому значению, необходимые ферменты не могут быть произведены в больших количествах.

Крахмалы, включаемые в сырье для культуры, могут быть желатинированы перед культивированием. Способов желатинирования крахмалов не особо мало, так что оно может быть осуществлено в соответствии с любым их общеупотребительных методов, включая паровой метод и метод поджарки. На стадии стерилизации жидкой среды (как будет описано далее), если крахмалы нагреваются до температуры гелеобразования или выше, когда осуществляется стерилизация при высоких температурах и высоких давлениях, желатинирование крахмалов происходит одновременно со стерилизацией.

В жидкой среде органическое вещество, неорганическое вещество и тому подобные включаются в качестве источника азота в дополнение к вышеупомянутому сырью для культуры. Источники азота не очень малочисленны, коль скоро плесень коджи растет и в достаточном количестве производит требуемые ферменты. Примеры органического вещества включают дрожжевые клетки или продукты их обработки (такие, как разложившиеся дрожжевые клетки, дрожжевые экстракты и т.п.), шелуха, отруби зерновых и т.п.. Пример неорганического вещества включает нитратную соль.

Нитратная соль включает нитрат калия, нитрат натрия и т.п., и нитрату калия отдается особое предпочтение.

Любой из источников азота может использоваться сам по себе, либо же два или более органических вещества и/или неорганические вещества могут использоваться одновременно.

Количество дополнительного источника азота особо не ограничено, коль скоро росту плесени коджи оказывается содействие, однако для органического вещества - от 0,1 до 2% (вес./об.), предпочтительно, от 0,5 до 1,0% (вес./об.); количество же дополнительной соли нитрата как неорганического вещества - 0,05 до 2,0% (вес./об.), предпочтительно, от 0,1 до 2,0% (вес./об., более предпочтительно 0,2 до 1,5% (вес./об.).

Добавление источника азота в количестве, превышающем верхнее пороговое значение, нежелательно, поскольку этим подавляется рост плесени коджи. С другой стороны, количество добавляемого источника азота ниже нижнего порогового значения также нежелательно, постольку не будет поддерживаться производство ферментов.

Примеры дрожжей, которые могут использоваться в качестве одного из видов источника азота, в настоящем изобретении включают пивные дрожжи, винные дрожжи, дрожжи для виски, дрожжи для шочу, дрожжи для сакэ и хлебные дрожжи, которые используются в процессах сбраживания или производства пищевых продуктов, и дрожжевые клетки родов Saccharomyces, Candida, Torulopsis, Hanseniaspora, Hansenula, Debaryomyces, Saccharomycopsis, Saccharomycodes, Pichia, Pachysolen и подобные.

Клетки дрожжей сами могут использоваться в качестве источника азота, и также могут использоваться в форме разложившихся дрожжей или дрожжевого экстракта. Разложившиеся дрожжевые клетки или дрожжевой экстракт могут быть получены, если дрожжи подвергнуть обработке, такой, как метод автолиза (метод повышения растворимости клеток с использованием протеолитических ферментов, которые от природы присутствуют в дрожжевых клетках), метод ферментативного расщепления (метод повышения растворимости путем добавления ферментного препарата или ему подобного, взятого из микроорганизмов или растений), метод экстракции в горячей воде (метод повышения растворимости путем погружения дрожжевых клеток в горячую воду на определенное время), метод кислотного или щелочного разложения (метод повышения растворимости путем добавления различных кислот или щелочей), метод физического разрушения (метод разрушения с помощью ультразвукового воздействия, или метод гомогенизации под высоким давлением, или смешивание с твердым телом, таким, как стеклянные бусины, и взбалтывание), и метод замораживания-размораживания (метод разрушения путем, по меньшей мере, однократного замораживания и размораживания).

В дополнение к этому, отруби зерновых, такие, как рисовые отруби, являющиеся побочным продуктом обработки зерна, мошут также быть использованы в качестве источника азота. Зерно состоит из оболочки, зародышевой части, эндосперма и шелухи, которая все это защищает. Отруби - это часть, состоящая из зародыша и оболочки.

Далее, в настоящем изобретении, зерновая шелуха, то есть его наружная оболочка, может использоваться как источник азота, и обычно используется шелуха зерновых того же типа, что и зерна, используемые в качестве культурального сырьевого материала. Эти отруби и шелуха могут использоваться в комбинации с другими источниками азота.

В жидкой среде, которая используется в настоящем изобретении, сульфатную соль и фосфатную соль могут быть включены в дополнение к сырью для культуры и источникам азота, как описано выше. При использовании этих неорганических солей в комбинации становится возможным повысить активность фермента - амилолитического фермента, целлюлолитического фермента, протеолитического фермента и им подобных.

Примеры сульфатных солей включают сульфатированный гептагидрат магния, сульфатированный гептагидрат железа и сульфат аммония, но сульфатированному гептагидрату магния отдается особое предпочтение. Примеры фосфатных солей включают первичный кислый фосфористокислый калий и фосфат аммония, но первичному кислому фосфористокислому калию отдается особое предпочтение.

Любая из этих неорганических солей может использоваться сама по себе, либо две из них или более могут использоваться в комбинации.

В дополнение к этому, концентрация неорганических солей в жидкой среде устанавливается такой, чтобы ферменты, такие, как амилолитический фермент, целлюлолитический фермент и протеолитический фермент, избирательно генерировались и накапливались выращиваемой культуре плесени коджи. Например, концентрация сульфатной соли - от 0,01 до 0,5%, предпочтительно от 0,02 до 0,1%, а концентрация фосфатной соли - от 0,05 до 0,1%, предпочтительно от 0,1 до 0,5%, при том условии, что каждое значение выражено в единицах вес./об..

Вышеупомянутые неорганические соли могут использоваться сами по себе, либо две из них или более могут использоваться в комбинации.

В жидкую среду могут при желании быть добавлены органическое вещество и неорганическая соль, не в качестве вышеупомянутых источника азота и неорганической соли как источника питательных веществ. Добавки особо не ограничиваются, коль скоро они являются веществами, обычно используемыми для выращивания плесени коджи. Примеры органического вещества включают пшеничные отруби, кукурузный экстракт, соевый жмых и обезжиренные соевые бобы.

Примеры неорганической соли включают растворимые в воде соединения, такие, как соль аммония, соль калия, соль кальция, соль магния и т.п.. Два или более органических вещества

и/или неорганические соли могут использоваться одновременно.

Их количество в качестве добавки особо не ограничивается, коль скоро этим облегчается рост плесени коджи. Количество добавляемого органического вещества - предпочтительно порядка от 0,1 до 5% (вес./об.), а количество добавляемой неорганической соли - предпочтительно порядка от 0,1 до 1% (вес./об.).

Добавление источника питательных веществ в количестве, превышающем верхнее пороговое значение, нежелательно, поскольку этим подавляется рост плесени коджи. С другой стороны, количество добавляемого источника азота ниже нижнего порогового значения также нежелательно, постольку не будет поддерживаться производство ферментов.

Жидкая среда для плесени коджи, полученная путем смешивания вышеупомянутого культурального сырьевого материала и источника азота с водой, может по желанию быть подвержена стерилизации, и способ стерилизации особо не ограничен никакими рамками. Пример такого способа включает стерилизацию при высокой температуре и под высоким давлением, и в этом случае стерилизация может осуществляться при 121°С в течение 15 минут.

Стерилизованная жидкая среда охлаждается до температуры, при которой осуществляется культивирование, после чего белая плесень коджи и/ли черная плесень коджи высаживается в жидкую среду.

Примеры плесеней коджи, используемых в настоящем открытии, предпочтительно включают плесени коджи, которые способны производить амилолитические ферменты, такие, как глюкоамилаза, кислотоустойчивая a-амилаза и a-амилаза, целлюлолитические ферменты, такие, как целлюлаза и b-глюкозидаза, и протеолитические ферменты, такие, как кислотная карбоксипептидаза и кислотная протеаза. Специфические примеры плесеней коджи включают белые плесени коджи, такие, как Aspergillus kawachii, и черные плесени коджи, такие, как Aspergillus awamori и Aspergillus niger.

Форма плесени коджи, высаживаемая в среду, произвольна, и любые споры и грибницы плесени коджи могут быть для этого использованы.

Эти плесени коджи могут быть использованы для культуры, соответствующей одному штамму, или для смешанной культуры с двумя или более гомологичными или гетерологичными штаммами. Позволительно использовать любую форму спор или грибниц, полученных при предварительном выращивании. Однако, предпочтительно использовать грибницы, поскольку в этом случае на фазу логарифмического роста требуется меньше времени.

Количество плесени коджи, высаживаемого в жидкую среду, особо не ограничивается, но число спор может находиться примерно в пределах от 1×10⁴ до 1×10⁶ на миллилитр жидкой среды. В случае грибниц, предварительно высадить порядка от 0,1 до 10% предварительной культуры.

Температура, при которой выращивается плесень коджи, - предпочтительно от 25 до 45°С, более предпочтительно от 30 до 40°С, но особо она не ограничивается, коль скоро это пагубным образом не влияет на рост. Если температура культивирования низка, то культура зачастую оказывается зараженной микробами, и рост плесени коджи замедляется. Таким образом, времени культивирования подобает варьироваться от 24 до 72 часов.

Установка для культивирования может быть любой, какая способна осуществлять жидкое выращивание. Плесень коджи должна выращиваться в аэробных условиях. Таким образом, выращивание должно осуществляться в аэробных условиях при которых в среду могут подаваться кислород или воздух. В дополнение к этому, является предпочтительным, чтобы среда перемешивалась, так, чтобы сырье, кислород и плесень коджи равномерно распределялись по объему установки во время культивирования. Характеристики процесса перемешивания и подачи воздуха могут быть произвольными, коль скоро поддерживается аэробная среда, и могут, таким образом, правильно выбираться с учетом установки, в которой осуществляется выращивание, вязкости среды и тому подобного.

При выращивании вышеописанным способом, ферменты, такие, как амилолитический фермент, целлюлолитический фермент и протеолитический фермент могут производиться в больших количествах. Как результат, по