Анализы и способы применения биомаркеров

Анализы и способы применения биомаркеров

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США номер 60/708677, поданной 16 августа 2005 года, и предварительной патентной заявки США номер 60/808076, поданной 24 мая 2006 года.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Описанное изобретение относится к способам и аналитическим методикам выявления биомаркеров, предсказывающих чувствительность клеток млекопитающих к Apo2L/TRAIL и/или агонистическим антителам рецепторов (клеточной) смерти. Более детально описанное изобретение относится к способам и аналитическим методикам, которые выявляют молекулы, ассоциированные с семейством белков GalNac-T, которые позволяют прогнозировать чувствительность раковых клеток млекопитающих к Apo2L/TRAIL и/или агонистическим антителам рецепторов (клеточной) смерти, например, к агонистическим антителам DR4 или DR5.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной области техники идентифицированы различные лиганды и рецепторы, принадлежащие суперсемейству фактора опухолевого некроза (TNF). В число таких лигандов входят альфа-фактор опухолевого некроза ("TNF-альфа"), бета-фактор опухолевого некроза ("TNF-бета" или "лимфотоксин-альфа"), лимфотоксин-бета ("LT-бета"), лиганд CD30, лиганд CD27, лиганд CD40, лиганд OX-40, лиганд 4-1BB, LIGHT, лиганд Apo-1 (также называемый лиганд Fas или лиганд CD95), лиганд Apo-2 (также называемый Apo2L или TRAIL), лиганд Apo-3 (также называемый TWEAK), APRIL, лиганд OPG (также называемый лиганд RANK, ODF или TRANCE) и TALL-1 (также называемый BlyS, BAFF или THANK) (см. например, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, страницы 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 (публикация от 16 января 1997 г.); WO 97/25428 (публикация от 17 июля 1997 г.); Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO 98/28426 (публикация от 2 июля 1998 г.); WO 98/46751 (публикация от 22 октября 1998 г.); WO 98/18921 (публикация от 7 мая 1998 г.); Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).

Индукция различных клеточных реакций, опосредованных такими лигандами семейства TNF, как правило, инициируется их связыванием со специфическими клеточными рецепторами. Некоторые, но не все, лиганды семейства TNF индуцируют различные типы биологической активности, связываясь с расположенными на поверхности клеток "рецепторами смерти" и активируя каспазы или ферменты, приводящие в исполнение метаболический путь клеточной смерти или апоптоза (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)). Среди членов суперсемейства рецепторов TNF, идентифицированных к настоящему времени, следует указать TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (также называемый Apo-1 или CD95), DR4 (также называемый TRAIL-R1), DR5 (также называемый Apo-2 или TRAIL-R2), DcR1, DcR2, остеопротегерин (OPG), RANK и Apo-3 (также называемый DR3 или TRAMP) (см., например, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, страницы 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:3127-3131 (1990); EP 417563 (публикация от 20 марта 1991 г.); Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)).

Большинство членов семейства рецепторов TNF имеют общую характерную структуру рецепторов клеточной поверхности, включая внеклеточные, трансмембранные и внутриклеточные области, но некоторые из них находятся в природе в виде растворимых белков, утратившие трансмембранный и внутриклеточный домен. Внеклеточная часть характерных рецепторов TNF содержит рисунок повторяющейся аминокислотной последовательности со множественными доменами, богатыми цистеином (CRD), начиная с NH₂-конца.

Лиганд, известный как Apo-2L или TRAIL, несколько лет назад был идентифицирован как член семейства цитокинов TNF (см., например, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; патент США 5763223, выданный 9 июня 1998 г., патент США 6284236, выданный 4 сентября 2001 г.). Полная длина природной последовательности полипептида человека Apo2L/TRAIL составляет 281 аминокислотный остаток, из которых сформирован трансмембранный белок II типа. Некоторые клетки могут продуцировать природную растворимую форму полипептида, существующую, благодаря ферментативному расщеплению его внеклеточной области (Mariani et al., J. Biol. Chem., 137:221-229 (1997)). Кристаллографические исследования растворимых форм Apo2L/TRAIL отражают гомотримерную структуру, сходную со структурами TNF и других родственных белков (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Однако было обнаружено, что, в отличие от других членов семейства TNF, белок Apo2L/TRAIL имеет уникальный структурный признак, заключающийся в том, что три остатка цистеина (в 230-м положении каждой субъединицы гомотримера) совместно координируют атом цинка, а связывание цинка важно для стабильности и биологической активности тримера (Hymowitz et al., выше; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).

В литературе были опубликованы сведения о том, что Apo2L/TRAIL может играть роль в модулировании иммунной системы, включая аутоиммунные заболевания, например ревматоидный артрит [см., например, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].

Сообщалось также о том, что растворимые формы Apo2L/TRAIL индуцируют апоптоз во многих типах раковых клеток, включая опухоли толстой кишки, легких, молочной железы, простаты, мочевого пузыря, почек, яичников и головного мозга, а также меланому, лейкоз и множественную миелому (см., например, Wiley et al., выше; Pitti et al., выше; патент США 6030945, выданный 29 февраля 2000 г.; патент США 6746668, выданный 8 июня 2004 г.; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Кроме того, исследования in vivo на моделях опухолей у мышей позволили предположить, что Apo2L/TRAIL один или в комбинации с химиотерапией или лучевой терапией может запускать значительные противоопухолевые эффекты (см., например, Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., выше; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); публикация PCT US/00/15512; публикация PCT US/01/23691. В отличие от многих типов раковых клеток большинство клеток нормального типа в организме человека проявляют устойчивость к индуцированию апоптоза определенными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше). Jo et al. сообщили о том, что меченная полигистидином растворимая форма Apo2L/TRAIL индуцирует апоптоз in vitro в нормальных выделенных гепатоцитах человека, но не в гепатоцитах другого биологического происхождения (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); см. также Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Полагают, что некоторые рекомбинантные препараты Apo2L/TRAIL могут изменяться в плане биохимических свойств и биологической активности по отношению к нормальным и патологически измененным клеткам в зависимости, например, от наличия или отсутствия молекулы-метки, от содержания цинка и процентного содержания тримера (см. Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).

Было установлено, что Apo2L/TRAIL может связываться по меньшей мере с пятью разными рецепторами. По меньшей мере два из рецепторов, связывающихся с Apo2L/TRAIL, содержат функциональный цитоплазматический домен клеточной смерти. Один из рецепторов носит название "DR4" (альтернативно он называется TR4 или TRAIL-R1) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); см. также WO 98/32856, опубликованный 30 июля 1998 г.; WO 99/37684, опубликованный 29 июля 1999 г.; WO 00/73349, опубликованный 7 декабря 2000 г.; US 2003/0036168, опубликованный 20 февраля 2003 г.; US 6433147, выданный 13 августа 2002 г.; US 6461823, выданный 8 октября 2002 г., и US 6342383, выданный 29 января 2002 г.).

Другой такой рецептор для Apo2L/TRAIL называется DR5 (альтернативно он называется Apo-2; TRAIL-R или TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPО8, TRICK2 или KILLER) (см., например, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), WO 98/51793, опубликованный 19 ноября 1998 г.; WO 98/41629, опубликованный 24 сентября 1998 г.; Screaton et al., Curr. Biol., 2:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986, опубликованный 20 августа 1998 г.; EP870827, опубликованный 14 октября 1998 г.; WO 98/46643, опубликованный 22 октября 1998 г.; WO 99/02653, опубликованный 21 января 1999 г.; WO 99/09165, опубликованный 25 февраля 1999 г.; WO 99/11791, опубликованный 11 марта 1999 г.; WO 03/042367, опубликованный 22 мая 2003 г.; WO 02/097033, опубликованный 5 декабря 2002 г.; WO 03/038043, опубликованный 8 мая 2003 г.; US 2002/0072091, опубликованный 13 августа 2002 г.; US 2002/0098550, опубликованный 7 декабря 2001 г.; US 6313269, выданный 6 декабря 2001 г.; US 2001/0010924, опубликованный 2 августа 2001 г.; US 2003/01255540, опубликованный 3 июля 2003 г.; US 2002/0160446, опубликованный 31 октября 2002 г., US 2002/0048785, опубликованный 25 апреля 2002 г.; US 2004/0141952, опубликованный 22 июля 2004 г.; US 2005/0129699, опубликованный 16 июня 2005 г.; US 2005/0129616, опубликованный 16 июня 2005 г.; US 6342369, выданный в феврале 2002 г.; US 6569642, выданный 27 мая 2003 г., US 6072047, выданный 6 июня 2000 г., US 6642358, выданный 4 ноября 2003 г.; US 6743625, выданный 1 июня 2004 г.). Сообщалось, что, подобно DR4, DR5 он содержит цитоплазматический домен клеточной смерти и способен передавать сигнал апоптоза при связывании с лигандом (или при связывании с такой молекулой, как агонистическое антитело, которое имитирует активность лиганда). Кристаллическая структура комплекса, образующегося между Apo-2L/TRAIL и DR5, описана в работе Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

При связывании с лигандом как DR4, так и DR5 могут независимым образом запускать апоптоз, привлекая и активируя фактор инициации апоптоза, каспазу-8, через адапторную молекулу, содержащую домен клеточной смерти и известную как FADD/Mort1 [Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)].

Были опубликованы сведения о том, что Apo2L/TRAIL также связывается с рецепторами, известными как DcR1, DcR2 и OPG, которые, по мнению исследователей, действуют скорее как ингибиторы, а не передатчики сигналов (см., например, DCR1 (также называемый TRID, LIT или TRAIL-R3) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); а также Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)]; DCR2 (также имеющий названия TRUNDD или TRAIL-R4) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)], и OPG [Simonet et al., выше]). В отличие от DR4 и DR5 рецепторы DcR1 и DcR2 не передают сигналов апоптоза.

В литературе описаны некоторые антитела, связывающиеся с рецепторами DR4 и/или DR5. Например, анти-DR4 антитела, направленные на рецептор DR4 и проявляющие агонистическую или апоптотическую активность в некоторых клетках млекопитающих, описаны в таких документах, как WO 99/37684, опубликованный 29 июля 1999 г.; WO 00/73349, опубликованный 12 июля 2000 г.; WO 03/066661, опубликованный 14 августа 2003 г. См. также, например, Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); WO 02/097033, опубликованный 2 декабря 2002 г.; WO 03/042367, опубликованный 22 мая 2003 г.; WO 03/038043, опубликованный 8 мая 2003 г.; WO 03/037913, опубликованный 8 мая 2003 г.; US 2003/0073187, опубликованный 17 апреля 2003 г.; US 2003/0108516, опубликованный 12 июня 2003 г. Подобно этому были описаны некоторые анти-DR5 антитела, см., например, WO 98/51793, опубликованный 8 ноября 1998 г.; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "Антитело к DR5 (рецептору TRAIL-2) подавляет рост полученных у больных клеток желудочно-кишечных опухолей у мышей линии SCID", тезисы, 2-й Международный конгресс по моноклональным антителам при раке, 29 августа - 1 сентября 2002 г., Банф, Альберта, Канада; WO 03/038043, опубликованный 8 мая 2003 г.; WO 03/037913, опубликованный 8 мая 2003 г.; US 2003/0180296, опубликованный 25 сентября 2003 г. В дополнение к этому, в литературе описаны некоторые антитела, проявляющие перекрестную реактивность как с рецепторами DR4, так и с рецепторами DR5 (см., например, патент США 6252050, выданный 26 июня 2001 г.).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Раскрытое изобретение относится к способам и аналитическим подходам к исследованию экспрессии одного и более биомаркеров в образцах тканей или клеток млекопитающих, причем экспрессия одного или более таких биомаркеров служит прогностическим индикатором чувствительности указанных образцов клеток и тканей к таким агентам, как Apo2L/TRAIL или агонистические анти-DR5 антитела. В различных вариантах осуществления изобретения указанные способы и аналитические подходы позволяют исследовать экспрессию молекул в семействе белков GalNac-T, в особенности, GalNAc-T14 или GalNAc-T3.

Как обсуждалось выше, большинство здоровых клеток в организме человека проявляют устойчивость к индуцированию апоптоза определенными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше; Walzcak et al., выше). Были также сделаны наблюдения о том, что некоторые популяции клеток человека, пораженных заболеванием (например, некоторые популяции раковых клеток), устойчивы к индуцированию апоптоза определенными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 1999, выше; Walczak et al., Nature Med., 1999, выше). Следовательно, изучая образец ткани или клеток на экспрессию избранных биомаркеров при помощи такого анализа, можно удобным и эффективным образом получить полезную информацию для оценки/выбора подходящих и эффективных методов терапии. Например, информация, полученная из анализа по выявлению экспрессии GalNac-T14 в образце ткани или клеток млекопитающего, может дать врачу полезные сведения, которые можно использовать при выборе оптимальной схемы терапии (с применением Apo2L/TRAIL или агонистических антител рецепторов клеточной смерти) для больных, страдающих раком или заболеванием, связанным с нарушением иммунитета, например аутоиммунным заболеванием.

Изобретение относится к способам прогнозирования чувствительности образцов тканей или клеток млекопитающих (например, раковых клеток) к Apo2L/TRAIL или агонистическим антителам рецепторов клеточной смерти. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные способы включают получение образца ткани или клеток млекопитающего и исследование этого образца ткани или клеток на экспрессию GalNac-T14. Указанные способы можно осуществлять в разнообразных форматах анализа, включая анализы по выявлению экспрессии мРНК и/или белка, анализы на ферментативную активность и другие виды анализов, обсуждаемые в настоящем описании. Определение экспрессии GalNac-T14 в указанных тканях или клетках имеет значение для предсказания чувствительности таких тканей или клеток к индуцирующей апоптоз активности Apo2L/TRAIL и/или к антителам рецепторов клеточной смерти. В некоторых (по выбору) вариантах осуществления изобретения ткани или клетки также можно исследовать на экспрессию рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2.

Дополнительные способы по изобретению включают способы индуцирования апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающие стадии получения образца ткани или клеток, исследования ткани или клеток на экспрессию GalNac-T14 и, при выявлении того, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует GalNac-T14, этап воздействия на этот образец эффективного количества Apo2L/TRAIL или агонистических антител рецепторов клеточной смерти. Указанные этапы способов исследования экспрессии GalNac-T14 можно осуществлять в разнообразных форматах анализа, включая анализы по выявлению экспрессии мРНК и/или белка, анализы на ферментативную активность и другие виды анализов, обсуждаемые в настоящем описании. В некоторых (по выбору) вариантах осуществления изобретения указанные способы также включают исследование образца ткани или клеток на экспрессию рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2. Необязательно, образец ткани или клеток содержит раковую ткань или клетки. Необязательно, образец ткани или клеток содержит клетки немелкоклеточного рака легких, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака молочной железы или клетки неходжкинской лимфомы.

Еще одна серия способов по изобретению включает способы лечения заболевания у млекопитающего, например, рака или заболевания, связанного с нарушением иммунитета, причем указанные способы включают этапы получения образца ткани или клеток, исследования ткани или клеток на экспрессию GalNac-T14 и, при выявлении того, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует GalNac-T14, введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL или агонистических антител рецепторов клеточной смерти. Указанные этапы способов исследования экспрессии одного или более биомаркеров можно осуществлять в разнообразных форматах анализа, включая анализы по выявлению экспрессии мРНК и/или белка, анализы на ферментативную активность и другие виды анализов, обсуждаемые в настоящем описании. В некоторых (по выбору) вариантах осуществления изобретения указанные способы также включают исследование образца ткани или клеток на экспрессию рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2. Необязательно, способы включают лечение рака млекопитающего. Необязательно, способы, кроме ведения эффективного количества Apo2L/TRAIL и/или агонистических антител рецепторов клеточной смерти, включают введение указанному млекопитающему химиотерапевтического средства (средств) или проведение лучевой терапии.

В других вариантах осуществления изобретения вышеуказанные способы могут включать исследование тканей или клеток млекопитающих на экспрессию других молекул GalNac-T, например, GalNac-T3.

Другие варианты осуществления изобретения для примера можно проиллюстрировать в следующих пунктах патентной формулы:

1. Способ предсказания чувствительности образца ткани или клеток млекопитающего к Apo2L/TRAIL, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток с целью выявления экспрессии GalNac-T14, причем экспрессия указанного GalNac-T14 позволяет предсказать, что указанный образец ткани или клеток чувствителен к индуцирующей апоптоз активности Apo2L/TRAIL.

2. Способ по п.1, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют, определяя экспрессию мРНК GalNac-T14.

3. Способ по п.1, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют методами иммуногистохимии.

4. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

5. Способ по п.1, в котором образец ткани или клеток содержит раковую ткань или клетки.

6. Способ по п.5, в котором указанные раковые клетки или ткань представляют собой материал из раковых опухолей поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

7. Способ индуцирования апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток с целью выявления экспрессии GalNac-T14 и, при выявлении такой экспрессии, последующего воздействия на указанный образец ткани или клеток эффективного количества Apo2L/TRAIL.

8. Способ по п.7, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют, определяя экспрессию мРНК GalNac-T14.

9. Способ по п.7, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют методами иммуногистохимии.

10. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

11. Способ по п.7, в котором указанный образец ткани или клеток содержит раковую ткань или клетки.

12. Способ по п.11, в котором указанные раковые клетки или ткань представляют собой материал из раковых опухолей поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

13. Способ по п.7, в котором указанные клетки подвергают воздействию эффективного количества полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281 в соответствии с фиг.1.

14. Способ лечения заболевания у млекопитающего, например, связанного с нарушением иммунитета или ракового, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток от указанного млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток с целью выявления экспрессии GalNac-T14 и, при выявлении такой экспрессии, введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL.

15. Способ по п.14, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют, определяя экспрессию мРНК GalNac-T14.

16. Способ по п.14, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют методами иммуногистохимии.

17. Способ по п.14, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанной ткани или клетках.

18. Способ по п.14, в котором образец ткани или клеток содержит раковую ткань или клетки.

19. Способ по п.18, в котором указанные раковые клетки или ткань представляют собой материал из раковых опухолей поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

20. Способ по п.14, в котором указанному млекопитающему вводят эффективное количество полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281 в соответствии с фиг.1.

21. Способ по п.14, в котором указанному млекопитающему также вводят химиотерапевтическое средство (средства) или назначают лучевую терапию.

22. Способ по п.14, в котором указанному млекопитающему также вводят цитокин, цитотоксический агент или ингибитор клеточного роста.

23. Способ по п.7, в котором указанный полипептид Apo2L/TRAIL соединен с молекулой полиэтиленгликоля.

24. Способ по п.14, в котором указанный полипептид Apo2L/TRAIL соединен с молекулой полиэтиленгликоля.

25. Способ предсказания чувствительности образца ткани или клеток млекопитающего к антителам рецепторов клеточной смерти, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток с целью выявления экспрессии GalNac-T14, причем экспрессия указанного GalNac-T14 позволяет предсказать, что указанный образец ткани или клеток чувствителен к индуцирующей апоптоз активности антител рецепторов клеточной смерти.

26. Способ по п.25, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют, определяя экспрессию мРНК GalNac-T14.

27. Способ по п.25, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют методами иммуногистохимии.

28. Способ по п.25, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

29. Способ по п.25, в котором образец ткани или клеток содержит раковую ткань или клетки.

30. Способ по п.29, в котором указанные раковые клетки или ткань представляют собой материал из раковых опухолей поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

31. Способ по п.25, в котором указанные антитела рецепторов клеточной смерти представляют собой агонистические анти-DR4 и анти-DR5 антитела.

32. Способ индуцирования апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток с целью выявления экспрессии GalNac-T14 и, при выявлении такой экспрессии, последующего воздействия на указанный образец ткани или клеток эффективного количества антител рецепторов клеточной смерти.

33. Способ по п.32, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют, определяя экспрессию мРНК GalNac-T14.

34. Способ по п.32, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют методами иммуногистохимии.

35. Способ по п.32, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

36. Способ по п.32, в котором указанный образец ткани или клеток содержит раковую ткань или клетки.

37. Способ по п.36, в котором указанные раковые клетки представляют собой раковые клетки или ткань поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

38. Способ по п.32, в котором указанные клетки подвергают воздействию эффективного количества агонистических антител DR4 или DR5.

39. Способ по п.38, в котором указанные клетки подвергают воздействию эффективного количества агонистических антител DR5, которые связываются с рецептором DR5, представленным на фиг.3A.

40. Способ лечения заболевания у млекопитающего, например, связанного с нарушением иммунитета или ракового, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток от указанного млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток с целью выявления экспрессии GalNac-T14 и, при выявлении такой экспрессии, последующего введения указанному млекопитающему эффективного количества антител рецепторов клеточной смерти.

41. Способ по п.40, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют, определяя экспрессию мРНК GalNac-T14.

42. Способ по п.40, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют методами иммуногистохимии.

43. Способ по п.40, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанной ткани или клетках.

44. Способ по п.40, в котором образец ткани или клеток содержит раковую ткань или клетки.

45. Способ по п.44, в котором указанные раковые клетки или ткань представляют собой материал из раковых опухолей поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

46. Способ по п.40, в котором указанному млекопитающему вводят эффективное количество анти-DR4 или анти-DR5 антител.

47. Способ по п.40, в котором указанному млекопитающему также вводят химиотерапевтическое средство (средства) или назначают лучевую терапию.

48. Способ по п.40, в котором указанному млекопитающему также вводят цитокин, цитотоксический агент или ингибитор клеточного роста.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность кДНК лиганда Apo-2 человека (SEQ ID NO:2) и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1). Символ "N" в положении нуклеотида 447 используется для того, чтобы указать, что нуклеотидным основанием может быть "T" (тимин) или "G" (гуанин).

На фиг.2A и 2B представлена нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) DR4 человека полной длины и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности DR4 человека также опубликованы в статье Pan et al., Science, 276:111 (1997).

На фиг.3A представлена аминокислотная последовательность из 411 аминокислотных остатков (SEQ ID NO:5) DR5 человека в том виде, как она была опубликована в WO 98/51793 от 19 ноября 1998 г. В данной области известен транскрипционный вариант сплайсинга DR5 человека. Этот вариант сплайсинга DR5 кодирует последовательность из 440 аминокислот (SEQ ID NO:6) DR5 человека, представленную на фиг.3B и 3C в том виде, как она была опубликована в WO 98/35986 от 20 августа 1998 г.

На фиг.3D-1, 3D-2 и 3D-3 представлена нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:7) для DcR1 человека полной длины и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности для DcR1 человека (и их специфические домены) также показаны и описаны в WO 98/58062.

На фиг.3E (3Е-1, 3Е-2) представлена нуклеотидная последовательности кДНК (SEQ ID NO:9) для DcR2 человека полной длины и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:10). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности для DcR2 человека (и их специфические домены) также показаны в WO 99/10484.

На фиг.4A (4А-1-4А-4) представлена нуклеотидная последовательность GalNac-T14 человека (SEQ ID NO:11) и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12). Эти последовательности также описаны Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003).

На фиг.4B (4В-1-4В-4) представлена нуклеотидная последовательность GalNac-T3 человека (SEQ ID NO:13) и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:14). Эти последовательности также описаны Bennett et al., J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996).

На фиг.5 представлена краткая схема IC50 по данным, полученным при анализе клеточных линий немелкоклеточного рака легких ("NSCLC") на чувствительность или устойчивость к апоптотической активности Apo2L (+0,5% фетальной бычьей сыворотки "FBS" или 10% FBS) либо к моноклональным антителам DR5 "DR5 ab", поперечно связанным "XL" или несвязанным (+0,5% фетальной бычьей сыворотки "FBS" или 10% FBS) по результатам измерений в анализах MTT на цитотоксичность.

На фиг.6 представлена краткая схема IC50 по данным, полученным при анализе клеточных линий рака поджелудоыной железы на чувствительность или устойчивость к апоптотической активности Apo2L (+0,5% фетальной бычьей сыворотки "FBS" или 10% FBS) либо к моноклональным антителам DR5 "DR5 ab", поперечно связанным "XL" или несвязанным (+0,5% фетальной бычьей сыворотки "FBS" или 10% FBS) по результатам измерений в анализах MTT на цитотоксичность.

На фиг.7 представлена краткая схема IC50 по данным, полученным при анализе раковых клеточных линий неходжкинской лимфомы ("NHL") на чувствительность или устойчивость к апоптотической активности Apo2L (+10% фетальной бычьей сыворотки "FBS") либо к моноклональным антителам DR5 "DR5 ab", поперечно связанным "XL" или не связанным (+10% фетальной бычьей сыворотки "FBS") по результатам измерений в анализах MTT на цитотоксичность.

На фиг.8 представлено сравнение чувствительности ("sen") или устойчивости ("RES") избранных линий раковых клеток NSCLC, рака поджелудочной железы и NHL к антителам DR5, а также корреляция с экспрессией GalNac-T14 при измерении по экспрессии мРНК GalNac-T14.

На фиг.9 представлен в виде столбчатой диаграммы график, отображающий различные клеточные линии NSCLC, рака поджелудочной железы и NHL, ранжированные (в нисходящем порядке) по уровню экспрессии мРНК GalNac-T14.

На фиг.10A-D проиллюстрирована дифференциальная экспрессия специфических ферментов O-гликозилирования в линиях раковых клеток, чувствительных и устойчивых к Apo2L/TRAIL: (A) Жизнеспособность клеток измеряли после инкубации с разными дозами Apo2L/TRAIL. Показатель IC50 для каждой клеточной линии рассчитывали как концентрацию Apo2L/TRAIL, которая снижает жизнеспособность клеток на 50%. Каждый эксперимент по анализу жизнеспособности клеток повторяли по меньшей мере три раза в присутствии низкой (0,5%) и высокой (10%) концентрации фетальной бычьей сыворотки. Черные, серые или незакрашенные символы отображают клеточные линии, высоко чувствительные, умеренно чувствительные или устойчивые к Apo2L/TRAIL соответственно. (B) Уровень экспрессии мРНК ppGalNAcT-14 (набор зондов 219271_at) в клеточных линиях рака поджелудочной железы и злокачественной меланомы. Клеточные линии упорядочены по типу ткани и чувствительности к Apo2L/TRAIL. Черные, серые или незакрашенные символы отображают клеточные линии в соответствии с фрагментом A. (C) Уровень экспрессии мРНК Fut-6 (верхняя область, набор зондов 211885_x_at) и ppGalNAcT-3 (нижняя область, набор зондов 203397_s_at) в клеточных линиях колоректального (ободочной и прямой кишки) рака. Клеточные линии упорядочены в соответствии с фрагментом B. Значения P в областях B и C основаны на критерии корреляции Фишера по чувствительности клеточных линий (включая высокие и умеренные показатели), а также по экспрессии мРНК выше точки отсечения. (D) Влияние Apo2L/TRAIL на рост доказанных опухолевых ксенотрансплантатов. Бестимусные "голые" мыши (с мутацией по гену nude), несущие GalNAcT-3/Fut-6-позитивные (левая панель) или GalNAcT-3/Fut-6-негативные (правая панель) опухоли, получали пустой вектор или Apo2L/TRAIL (60 мг/кг/день интраперитонеально с 0-го по 4-й день) с мониторингом объема опухоли (средняя±стандартное отклонение, N=10 мышей на группу).

На фиг.11 проиллюстрирована модуляция специфических ферментов O-гликозилирования, изменяющих чувствительность к Apo2L/TRAIL. (A) Клетки Colo205 были предварительно инкубированы с универсальным ингибитором ферментов O-гликозилирования бензил-GalNAc (bGalNAc) и обработаны Apo2L/TRAIL в течение 24 часов, после чего определяли жизнеспособность клеток (ДМСО = контроль с пустым вектором). (B) Клетки PSN-1 (карциномы поджелудочной железы) и Hs294T (меланомы) были трансфицированы siРНК (малыми интерферирующими РНК) каспазы-8 или ppGalNAcT-14 в течение 48 часов, затем инкубированы с Apo2L/TRAIL еще в течение 24 часов, после чего определяли жизнеспособность клеток. В качестве контроля (NTC) были использованы дуплексы siРНК против нецелевой последовательности (Dharmacon). (C) Клетки колоректальной карциномы DLD-1 были трансфицированы siРНК ppGalNAcT-3 или Fut-6 и исследованы в соответствии с пунктом B. (D) Клетки HEK293 были котрансфицированы плазмидами, кодирующими индикаторные гены в комбинации с ppGalNAcT-14 или векторным контролем. Апоптоз оценивали через 24 часа при помощи окрашивания Annexin V (левая панель). Клетки меланомы H1569 были трансдуцированы ретровирусом, управляющим экспрессией ppGalNAcT-14, или контрольным ретровирусом; полученные в результате клеточные пулы обрабатывали Apo2L/TRAIL в течение 24 часов с последующим определением жизнеспособности клеток (правая панель). Для верификации экспрессии ppGalNAcT-14 с меченым эпитопом применяли вестерн-блоттинг с анти-FLAG антителами.

На фиг.12 проиллюстрирован (A) анализ каскада каспазы, индуцированного Apo2L/TRAIL. Клетки PSN-1 и DLD-1 были трансфицированы siРНК ppGalNAcT-14 или Fut-6 соответственно в течение 48 часов. Затем клетки обрабатывали Apo2L/TRAIL в течение 4 или 8 часов, а клеточные лизаты анализировали иммуноблоттингом с антителами, специфичными для каспазы-8, Bid, каспазы-9, каспазы-3 или с актином, использованным в качестве загрузочного контроля. (B) Клетки PSN-1 были трансфицированы siРНК ppGalNAcT-14 в соответствии с пунктом A, затем обработаны Apo2L/TRAIL в течение 4 часов, после чего в клеточных лизатах определяли ферментативную активность каспазы-3/7. (C) Анализ Apo2L/TRAIL по методике DISC. Клетки PSN-1 были трансфицированы siРНК ppGalNAcT-14 в соответствии с пунктом A. Затем к этим клеткам добавляли FLAG-Apo2L/TRAIL (1 мг/мл) на 0-60 минут, клетки лизировали и подвергали иммунопреципитации с анти-FLAG антителами. При помощи иммуноблоттинга определяли DISC-ассоциированный FADD, каспазу-8, DR4. (D) Клетки PSN-1 были трансфицированы, обработаны и подвергнуты иммунопреципитации по методике DISC в соответствии с пунктом C, после чего DISC-ассоциированную ферментативную активность каспазы-8 измеряли так, как это было описано ранее (Sharp et al., J. Biol. Chem., 280:19401 (2005)).

На фиг.13 проиллюстрирован (A) моносахаридный анализ рекомбинантного DR5 человека (длинный вариант сплайсинга), выработанного в клетках CHO, который был проведен по методике HPAEC-PAD (анион-обменная хроматография высокого разрешения с пульсирующим амперометрическим выявлением). (B) Сравнение последовательностей рецепторов Apo2L/TRAIL человека (DR5 человека длиной 440 аминокислот - форма "hDR5L", DR5 человека длиной 411 аминокислот - короткая форма "hDR5S" и hDR4), DR5 мыши (mDR5), Fas человека (hFas) и TNFR1 человека (hTNFR1). Прямоугольники показывают предположительные сайты O-гликозилирования. (C) Анализ методом иммуноблоттинга всех клеточных лизатов, соответствующих пункту D. DR5L-5T и DR5S-5T представляют собой конструкции, содержащие 5 замен треонина на аланин, а DR5L-5T3S и DR5S-5T3S представляют собой конструкции, содержащие 5 замен треонина на аланин и три замены серина на аланин соответственно, в тех аминокислотных остатках, которые, предположительно, являются сайтами O-гликозилирования. (D) Клетки HEK293 были котрансфицированы индикаторными конструкциями DR5 вместе с вектором или плазмидой ppGalNAcT-14 в течение 48 часов, после чего определяли апоптоз окрашиванием Annexin V. (E) Уровень экспрессии мРНК для ppGalNAcT-14 (чип Affymetrix, набор зондов 219271_at) в первичных образцах опухолей человека: рак кожи (SCC = плоскоклеточная карцинома), рак легких, рак поджелудочной железы (Panc), рак молочной железы, рак яичников (Ov), рак эндометрия (Endo), рак мочевого пузыря (Bla, TCC=переходноклеточная карцинома) и NHL (FL=фолликулярная лимфома, DLBCL=диффузная крупная B-клеточная лимфома). Средняя экспрессия в образцах для каждого класса показана серыми горизонтальными полосками. Показано отсечение на уровне 500 и 200 (меланома) в соответствии с данными по клеточной линии из фиг.10B.

На фиг.14 проиллюстрировано (A) снижение экспрессии мРНК ppGalNAcT-14 или ppGalNAcT-3 в клетках PSN-1 или DLD-1 после 48-часового нокдауна siРНК, оцененное в анализе Такмана. (B) Экспрессия GalNAcT-14 в клетках PSN-1 восстанавливается при трансфекции пустой плазмидой (Empty), GalNAcT-14 дикого ти