Способы и композиции для модуляции и обнаружения активности wisp

Способы и композиции для модуляции и обнаружения активности wisp

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для модуляции активности полипептидов WISP, в частности полипептидов WISP-1. Настоящее изобретение относится также к способам и композициям для диагностики и/или лечения in vitro, in situ и/или in vivo клеток или патологических состояний у млекопитающих, обусловленных полипептидами WISP.

Уровень техники

Фактор роста соединительной ткани (CTGF) является фактором роста, индуцируемым в фибробластах многими факторами, включая TGF-β, и имеет важное значение для способности TGF-β вызывать свободный рост клеток (AIG), что является отличительным признаком трансформированных клеток. CТGF оказывает также митогенное и хемотаксическое действие на клетки, поэтому считается, что факторы роста, относящиеся к данному семейству, играют определенную роль в нормальном развитии, росте и восстановлении ткани человека. Были выделены, клонированы, секвенированы и исследованы пять белков, относящихся к CТGF, включая Cyr61, Nov, WISP-1, WISP-2 и WISP-3, при этом была установлена их принадлежность к семейству генов CCN (Oemar and Luescher, Arterioscler. Тhromb. Vasc. Biol., 17:1483-1489 (1997); Brigstock, Endocrine Rev., 20:189-206 (1999)). Установлено, что ген, кодирующий Cyr61, стимулирует развитие кровеносных сосудов, рост опухоли и васкуляризацию (Babic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6355-6360 (1998)). Ген Nov экспрессируется в почке в основном на эмбриональной стадии, и изменение экспрессии гена Nov по отношению к нормальной почке было обнаружено в аденосаркомах почек у птиц и опухолях Вильмаса у человека (Martinerie et al., Oncogene, 9:2729-2732 (1994)). Wt1 уменьшает экспрессию гена Nov у человека, что может иметь важное значение для нормального и опухолевого нефрогенеза (Martinerie et al., Oncogene, 12: 1479-1492 (1996)).

Разные члены семейства CCN взаимодействуют с разными растворимыми или ассоциированными с матриксом макромолекулами в определенных сульфатированных гликоконъюгатах (Bork, FEBS Letters, 327:125-130). Указанное взаимодействие было использовано для очистки Cyr61 и CTGF методом аффинной хроматографии на гепарин-агарозе (Frazier et al., J. Invest. Dermatol., 107:404-411 (1996); Kireeva et al., Mol. Cell. Biol., 16:1326-1334 (1996)). Секретированный белок Cyr61 ассоциирован как с внеклеточным матриксом, так и с поверхностью клетки благодаря его сродству к сульфату гепарина (Yang et al., Cell. Growth Diff., 2:351-357 (1991)). Недавно было установлено, что WISP-1 взаимодействует с декорином и бигликаном, двумя секретируемыми протеогликанами сульфата дерматана (Desnoyers et al., J. Biol. Chem., 276:47599-47607 (2001)).

Белок ELM1 мышей недавно был идентифицирован в слабо метастазирующих клетках (Hashimoto et al., J. Exp. Med., 187:289-296 (1998)). Ген elm1, мышиный ортолог описанного ниже WISP-1, является еще одним членом семейства генов CNN. Указанный ген подавляет in vivo рост опухоли и метастазирование клеток меланомы К-1735 у мышей. В недавно опубликованной статье, посвященной rCop-1, крысиному ортологу описанного ниже WISP-2, представлены данные об отсутствии экспрессии данного гена после трансформации клетки (Zhang et al., Mol. Cell. Biol., 18:6131-6141 (1998)).

Wnt кодированы большим семейством генов, члены которого обнаружены у круглых червей, насекомых, хрящевых рыб и позвоночных (Holland et al., Dev. Suppl., 125-133 (1994)). Считается, что Wnt участвуют в разных процессах развития и физиологии, так как разнообразные виды имеют много консервативных генов Wnt (McMahon, Trends Genet., 8:236-242 (1992); Nusse and Varmus, Cell, 69:1073-1087 (1992)). Гены Wnt кодируют секретируемые гликопротеины, которые, как считается, действуют в качестве паракринных или аутокринных сигналов, активных в первичных клетках нескольких типов (McMahon, см. выше (1992); Nusse and Varmus, см. выше (1992)). Семейство факторов роста Wnt включает более десяти генов, идентифицированных у мышей (Wnt-1, -2, -3A, -3B, -4, -5A, -5B, -6, -7A, -7B, -8A, -8B, -10B, -11, -12 и -13) (см., например, Gavin et al., Genes Dev., 4:2319-2332 (1990); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:2268-2272 (1995); Christiansen et al., Mech. Dev., 51:341-350 (1995)), и, по крайней мере, девять генов, идентифицированных у человека (Wnt-1, -2, -3, -5A, -7A, -7B, -8B, -10B и -11) методом клонирования кДНК (см., например, Vant Veer et al., Mol. Cell. Biol., 4:2532-2534 (1984)).

Протоонкоген Wnt-1 (int-1) был первоначально идентифицирован в опухолях молочной железы, индуцированных вирусом опухоли молочной железы мышей (MMTV) путем введения последовательности вирусной ДНК (Nusse and Varmus, Cell, 31:99-109 (1982)). У взрослых мышей экспрессия мРНК Wnt-1 обнаружена только в яичках на более поздних стадиях развития сперматозоидов. Белок Wnt-1 имеет молекулярную массу, равную примерно 42 кДа, и содержит аминоконцевую гидрофобную область, которая может функционировать в качестве сигнальной последовательности для секреции (Nusse and Varmus, см. выше, 1992). Экспрессия Wnt-2 обнаружена в тканях плода и взрослых мышей, и его распространение не перекрывает паттерн экспрессии Wnt-1. Wnt-3 ассоциирован с онкогенезом молочной железы у мышей. Экспрессия Wnt-3 у эмбрионов мышей обнаружена в нервных трубках и зачатках конечностей. Транскрипты Wnt-5А обнаружены в развивающихся передних и задних конечностях в период с 9,5 до 14,5 дня, при этом наибольшие уровни экспрессии сконцентрированы в апикальной эктодерме дистальной части конечностей (Nusse and Varmus, см. выше (1992)). В научной литературе недавно был описан фактор роста Wnt, получивший название Wnt-х, (WO95/17416), экспрессия которого была обнаружена в костных тканях и клетках, выделенных из кости. Кроме того, были представлены данные о роли Wnt-x в сохранении зрелых остеобластов и использовании фактора роста Wnt-x в качестве терапевтического средства или при создании других терапевтических средств для лечения костных заболеваний.

Wnt могут играть определенную роль в локальной передаче сигналов в клетки (Peifer and Polakis, Science, 287:1606-1609 (2000)). Биохимические исследования показали, что большая часть секретируемого белка Wnt может быть обнаружена связанной с поверхностью клеток или внеклеточным матриксом, а не в свободно диффундированной форме в среде (Papkoff and Schryver, Mol. Cell. Biol., 10: 2723-2730 (1990)); Bradley and Brown, EMBO J., 9:1569-1575 (1990).

Исследования мутаций в генах Wnt позволили выявить роль Wnt в регулировании роста и образовании ткани. У дрозофилы ген бескрылости (wg) кодирует Wnt-родственный ген (Rijsewik et al., Cell, 50:649-657 (1987)), и мутации гена wg изменяют структуру эмбриональной эктодермы, развитие нервных клеток и рост имагинального диска (Morata and Lawerence, Dev. Biol., 56:227-240 (1977); Bаker, Dev. Biol., 125:96-108 (1988); Kligensmith and Nusse, Dev. Biol., 166:396-414 (1994)). У Caenorhabditis elegans lin-44 кодирует гомолог Wnt, который необходим для асимметричного деления клеток (Herman and Horvitz, Development, 120:1035-1047 (1994)). Мутации с выключением генов у мышей показали, что Wnt имеют важное значение для развития головного мозга (McMahon and Bradley, Cell, 62:1073-1085 (1990); Thomas and Cappechi, Nature, 346:847-850 (1990)), роста зачатков почек у эмбриона (Stark et al., Nаture, 372:679-683 (1994)), зачатка хвоста (Takada et al., Genеs Dev., 8:174-189 (1994)) и зачатков конечностей (Parr and McMahon, Nature, 374:350-353 (1995)). Сверхэкспрессия Wnt-1 в молочной железе может вызвать гиперплазию молочной железы (McMahon, см. выше (1992); Nusse and Varmus, см. выше (1992)), ускоренное развитие альвеол (Bradbury et al., Dev. Biol., 170:553-563 (1995)) и аденокарциномы молочной железы (Li et al., Oncogene, 19:1002-1009 (2000)).

Wnt-5A и Wnt-5B экспрессированы в задней и боковой мезодерме, а также во внезародышевой мезодерме на 7-8 день развития эмбриона мыши (Gavin et al., см. выше (1990)). Вышеуказанные эмбриональные домены способствуют образованию области AGM и тканей желточного мешка, из которых образуются многие предшественники гемопоэтических клеток и HSC (Dzierzak and Medvinsky, Trends Genet., 11: 359-366 (1995)); Zon et al., in Gluckman and Coulombel, ed., Collogue, INSERM, 235: 17-22 (1995), presented at the Joint International Workshop on Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failure, Paris France, April 3-6, 1995; Kanatsu and Nishikawa, Development, 122: 823-830 (1996)). Wnt-5A, Wnt-10B и другие Wnt были обнаружены в зачатках конечностей, что свидетельствует о возможной роли указанных генов в развитии и паттерне микроокружения на ранней стадии образования костей, как показано для Wnt-7B (Gavin et al., см. выше (1990); Christiansen et al., Mech. Devel., 51:341-350 (1995); Parr and McMahon, см. выше (1995)).

Для ознакомления с генами Wnt см. публикацию Cаdigan and Nusse, Genes & Dev., 11:3286-3305 (1997).

В публикации Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998), описано клонирование и исследование двух генов, WISP-1 и WISP-2, содержание которых повышено в линии эпителиальных клеток молочной железы C57MG у мышей, трансформированных Wnt-1, и третьего родственного гена, WISP-3. (См. также WO 99/21998, опубликованную 6 мая 1999 г.; WO 99/21999, опубликованную 6 мая 1999 г.). В публикации Pennica et al. отмечено, что указанные гены WISP могут находиться внизу (даунстрим) от пути передачи сигналов Wnt-1, и что аберрантные уровни экспрессии WISP в случае рака ободочной кишки могут играть определенную роль в онкогенезе ободочной кишки. WISP-1 недавно был идентифицирован в качестве гена, регулируемого β-катенином, и исследование его онкогенной активности показало, что WISP-1 может способствовать онкогенезу, опосредованному β-катенином (Xu et al., Gene & Develop., 14:585-595 (2000)). Сверхэкспрессия WISP-1 в нормальных клетках почки крысы (NRK-49F) вызывает морфологическую трансформацию, ускоренный рост клеток и повышенную плотность насыщения. Кроме того, указанные клетки легко образуют опухоли при инъецировании “голым” мышам, из чего следует, что WISP-1 может играть определенную роль в онкогенезе (Xu et al., см. выше, 2000). WISP-1 сверхэкспрессирован также в трансформированных линиях раковых клеток молочной железы человека и примерно в 47% первичных раковых клеток молочной железы человека, характеризующихся некоторыми прогрессирующими признаками (Xie et al., Cancer Res., 61:8917-8923 (2001); Saxena et al., Mol. Cell Biochem., 228:99-104 (2001); Michaelson et al., Oncogene, 20:5093-5099 (2001)). В научной литературе были также представлены данные о сверхэкспрессии определенного варианта WISP-1 примерно в 86% клеток фиброзного рака желудка у человека (Tanaka et al., Oncogene, 20:5525-5532 (2001)).

В публикации Hurvitz et al., Nature Genetics, 23:94-97 (1999), описано исследование WISP-3, при выполнении которого было установлено, что девять разных мутаций WISP-3 у неродственных субъектов ассоциированы с аутосомным рецессивным заболеванием скелета, прогрессирующей псевдоревматоидной дисплазией (PPD). Экспрессия WISP-3 была выявлена методом RT-PCR Хурвицем и др. в синовиоцитах человека, хондроцитах суставного хряща и мезенхимных клетках-предшественниках, выделенных из костного мозга.

В заявке на патент РСТ WO 98/21236, опубликованной 22 мая 1998 г., описан ген-3 фактора роста соединительной ткани человека (CTGF-3), кодирующий член надсемейства факторов роста с молекулярной массой 26 кДа. В публикации WO 98/21236 указано, что аминокислотная последовательность CTGF-3 была получена из клона кДНК остеобластов человека, и что CTGF-3 был экспрессирован во многих тканях, таких как яичник, яички, сердце, легкое, скелетные мышцы, мозговое вещество надпочечника, корковое вещество надпочечника, тимус, предстательная железа, тонкий кишечник и ободочная кишка.

В научной литературе отмечено, что гиалуроновая кислота (определяемая также как НА, гиалуронат или гиалуронан) является важным компонентом внеклеточного матрикса (см., например, публикации Hardingham et al., FASEB J., 6:861-870 (1992); Lаurent et al., FASEB J., 6:2397-2404 (1992)). Гиалуроновая кислота является компонентом кожи и мезенхимных тканей, где она облегчает миграцию клеток в процессе заживления ран, воспаления и эмбрионального морфогенеза (Knudson et al., FASEB J., 7:1233-1241 (1993); Knudson et al., CIBA Found. Symp., 143:150-169 (1989)). Кроме того, известно, что гиалуроновая кислота играет определенную роль в некоторых типах метастазов (Naor et al., CD44: Structure, Function and Association with the Malignant Process, Advances in Cancer Research, Academic Press (1997), pages 241-319). Наибольшие концентрации гиалуроновой кислоты обнаружены в коже и скелетно-мышечной системе, где она составляет более 50% общего содержания в организме (Banerji et al., J. Cell Biol., 144:789-801 (1999)).

Разные исследователи занимались изучением рецепторов, связывающих гиалуроновую кислоту. Одним из идентифицированных рецепторов гиалуроновой кислоты является белок CD44. (См., например, публикации Culty et al., J. Cell Biology, 111:2765-2774 (1990); Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990); Naor et al., CD44: Structure, Function, and Association with the Malignant Process, Advances in Cancer Research, Academic Press (1997), pages 241-319), Ropponen et al., Cancer Res., 58:342-347 (1998); Masaki et al., Cancer, 92:2539-2546 (2001)). CD44 представляет собой семейство гликопротеинов на поверхности клетки, образуемых из одного гена в результате альтернативного сплайсинга и дифференциального гликозилирования (Wielenga et al., Am. J. Pathology, 154:515-523 (1999)). Считается, что CD44 действует в качестве рецептора клеточной адгезии, связывающего внеклеточные молекулы, в частности гиалуронат, с клеткой и цитоскелетом (Wielenga et al., см. выше). CD44 экспрессирован на эпителиальных, мезенхимных и лимфоидных клетках (Lesley et al., Adv. Immunol., 54:271-335 (1994)). В публикации Wielenga et al. отмечено, что, на основании определенных экспериментов, позволяющих проанализировать экспрессию CD44 в слизистой оболочке тонкого кишечника мышей и человека с генетическими дефектами АРС или Tcf-4, был сделан вывод о возможности регулирования экспрессии CD44 при помощи пути передачи сигналов WNT (Wielenga et al., см. выше).

Другие рецепторы гиалуроновой кислоты (НА), исследованные до настоящего времени, включают RHAMM (определяемый также как рецептор подвижности, опосредуемой гиалуроновой кислотой), внутриклеточный белок с молекулярной массой 58 кДа, временно экспрессируемый на поверхности трансформированных лимфоцитов (Hardwick et al., J. Cell Biol., 117:1343-1350 (1992); Turley et al., Exp. Cell Res., 207:277-282 (1993)). Установлено, что экспрессия RHAMM в фибробластах стимулирует метастазы и играет важную роль в трансформации H-Ras (Hall et al., см. ниже).

Другой рецептор, связывающий гиалуроновую кислоту, описан в публикации Banerji et al. (см. выше). В публикации Banerji et al. рассмотрен рецептор, присутствующий в стенках лимфатических сосудов и именуемый “LYVE-1”, который является встроенным в мембрану полипептидом типа I, состоящим из 322 остатков и обладающим 41% сходством с рецептором CD44. В отличие от рецептора CD44 гиалуроновой кислоты белок LYVE-1 отсутствует в кровеносных сосудах. Кроме того, в качестве рецепторов НА были описаны также лайилин (Bono et al., Mol. Biol. Cell, 12:891-900 (2001)) и HARE (Zhou et al., J. Biol. Chem., 275:37733-37741 (2000)).

Сущность изобретения

Автор настоящей заявки весьма неожиданно обнаружил, что WISP-1 может индуцировать экспрессию мРНК HAS2 (гиалуронан-синтазы 2), CD44 и RHAMM, синтез белка CD44 и секрецию гиалуроновой кислоты (НА). Индукция или секреция таких молекул может стимулировать или усиливать рост, подвижность и/или способность к метастазированию раковых клеток. Таким образом, настоящее изобретение относится, например, к антагонистам WISP-1 и способам применения таких антагонистов. Антагонисты, рассмотренные в настоящем описании изобретения, могут быть использованы, среди прочего, для диагностики или лечения in vitro, in situ или in vivo раковых клеток или других патологических состояний у млекопитающих, обусловленных индукцией или секрецией HAS2, HA, CD44 или RHAMM.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к выделенным антагонистам WISP-1. Такие антагонисты могут включать антитела, в частности антитела против WISP-1. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные антагонисты могут блокировать или нейтрализовать индукцию или секрецию HAS2, HA, CD44 или RHAMM, вызываемую WISP-1. Такие антитела-антагонисты могут быть, например, моноклональными антителами, химерными антителами, гуманизированными антителами или человеческими антителами. Антагонисты WISP-1, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают иммуноадгезины WISP-1, варианты WISP-1, их ковалентно модифицированные формы или слитые белки. В качестве примера можно отметить, что такие антагонисты могут включать пегилированный WISP-1 или WISP-1, слитый с гетерологичными последовательностями, такими как эпитопные метки или лейциновые зипперы. Способы по настоящему изобретению относятся к использованию молекулы антагониста одного типа или комбинации антагонистов двух или более типов.

Способы по настоящему изобретению включают способы лечения патологических состояний или заболеваний у млекопитающих, обусловленных или являющихся следствием индукции или секреции HAS2, HA, CD44 или RHAMM, вызываемой WISP-1. При осуществлении способов лечения антагонисты WISP-1 могут быть введены млекопитающему, страдающему таким патологическим состоянием или заболеванием. Например, настоящее изобретение относится к способу воздействия на клетки млекопитающего, в частности раковые клетки, одного или нескольких антагонистов WISP-1 в количестве, достаточном для уменьшения, нейтрализации или блокирования индукции или секреции HAS2, HA, CD44 или RHAMM, вызываемой WISP-1. Клетка может находиться в культуре клеток или в организме млекопитающего, например млекопитающего, страдающего раком.

Настоящее изобретение относится также к композициям, содержащим один или несколько антагонистов WISP-1. Композиции по настоящему изобретению необязательно содержат фармацевтически приемлемые носители или разбавители. Указанные композиции предпочтительно содержат один или несколько антагонистов WISP-1 в количестве, которое является терапевтически эффективным для лечения патологического состояния или заболевания.

Настоящее изобретение относится также к изделиям и наборам, включающим один или несколько антагонистов WISP-1.

Настоящее изобретение относится также к способам выполнения скрининговых анализов для идентификации молекул-кандидатов, таких как низкомолекулярные соединения, полипептиды или антитела, действующих в качестве антагонистов, блокирующих или нейтрализующих индукцию или секрецию HAS2, HA, CD44 или RHAMM, вызываемую WISP-1.

Более конкретные варианты осуществления изобретения относятся к выделенным антагонистам WISP-1, которые ингибируют или нейтрализуют индукцию или секрецию HAS2, HA, CD44 или RHAMM, вызываемую нативным полипептидом WISP-1, по крайней мере, в клетке млекопитающего одного типа, причем указанный антагонист выбирают из группы, включающей антитело против WISP-1, иммуноадгезин WISP-1, вариант WISP-1 и их слитые белки. Антагонист может включать антитело против WISP-1, связывающее нативный полипептид WISP-1 человека, включающий аминокислоты 23-367, показанные на фиг.9А-9С, либо один или несколько доменов WISP-1, содержащих аминокислоты, кодируемые последовательностями SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 по настоящему изобретению. Антитело против WISP-1 может быть химерным, гуманизированным или человеческим антителом.

Настоящее изобретение относится также к композициям, содержащим антагонисты, представленные в настоящем описании изобретения, и носитель, причем носитель необязательно является фармацевтически приемлемым носителем.

Настоящее изобретение относится также к способам ингибирования или нейтрализации индукции или секреции HAS2, HA, CD44 или RHAMM, вызываемой WISP-1, в клетках млекопитающего, которые включают воздействие на указанные клетки млекопитающего эффективным количеством антагониста WISP-1, выбираемого из группы, состоящей из:

а) иммуноадгезина WISP-1;

b) полипептида WISP-1, связанного с небелковым полимером, выбираемым из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и полиоксиалкилена;

с) антитела против WISP-1;

d) варианта WISP-1.

Иммуноадгезины WISP-1, используемые в способах по настоящему изобретению, могут включать последовательность WISP-1, слитую с Fc-областью иммуноглобулина. Антитела против WISP-1, используемые в способах по настоящему изобретению, могут связываться с нативным WISP-1 человека, содержащим аминокислоты 23-367, показанные на фиг.9А-9С, либо с одним или несколькими доменами WISP-1, описанными в приведенных ниже примерах. При осуществлении способов по настоящему изобретению клетки млекопитающего могут содержать раковые клетки, причем указанные клетки необязательно содержат раковые клетки ободочной кишки или прямой и ободочной кишки, раковые клетки молочной железы, раковые клетки легкого или раковые клетки головного мозга (такие как глиома или глиобластома).

Другие варианты осуществления изобретения относятся к способам лечения рака у млекопитающего, которые включают введение указанному млекопитающему эффективного количества антагониста WISP-1. При осуществлении указанных способов антагонист может необязательно ингибировать или нейтрализовать индукцию или секрецию HAS2, HA, CD44 или RHAMM, вызываемую нативным полипептидом WISP-1 человека, по крайней мере, в клетках млекопитающего одного типа, при этом указанный антагонист выбирают из группы, состоящей из антитела против WISP-1, иммуноадгезина WISP-1 и варианта WISP-1. Антагонист может необязательно ингибировать рост или метастизирование раковых клеток. Рак у млекопитающего может включать раковые клетки ободочной кишки или прямой и ободочной кишки, раковые клетки молочной железы, раковые клетки легкого или раковые клетки головного мозга (такие как глиома или глиобластома). Антагонисты, используемые при осуществлении способов по настоящему изобретению, необязательно ингибируют или уменьшает рост или метастазирование раковых клеток. При осуществлении указанных способов млекопитающее может быть также подвергнуто воздействию химиотерапии, лучевой терапии, пролекарства, цитотоксического агента, ингибитора роста или цитокина.

Более конкретные варианты осуществления изобретения относятся к антителам, которые специфически связываются с одним или несколькими доменами полипептида WISP-1 (описанными в приведенных ниже примерах), включающего аминокислоты, кодируемые последовательностями SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 по настоящему изобретению. Антитело необязательно является моноклональным антителом. Моноклональное антитело необязательно включает антитело 3D11, 11C2, 9C10, 5D4 или 9С11, секретируемое гибридомой, депонированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС) соответственно под номером доступа РТА-4624, РТА-4628, РТА-4626, РТА-4625 или РТА-4627.

Настоящее изобретение относится также к антителам, которые связываются с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело 3D11, 11C2, 9C10, 5D4 или 9С11, продуцируемое линией клеток гибридомы, депонированной в АТСС соответственно под номером доступа РТА-4624, РТА-4628, РТА-4626, РТА-4625 или РТА-4627.

Другие конкретные варианты осуществления изобретения относятся к линии клеток гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело 3D11, 11C2, 9C10, 5D4 или 9С11, депонированной в АТСС соответственно под номером доступа РТА-4624, РТА-4628, РТА-4626, РТА-4625 или РТА-4627, и к моноклональному антителу 3D11, 11C2, 9C10, 5D4 или 9С11, секретируемому гибридомой, депонированной в АТСС соответственно под номером доступа РТА-4624, РТА-4628, РТА-4626, РТА-4625 или РТА-4627.

Настоящее изобретение относится также к выделенным моноклональным антителам против WISP-1, содержащим антитела, которые связываются с полипептидом WISP-1 и конкурентно ингибируют связывание моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, депонированной в АТСС под номером доступа РТА-4624, РТА-4628, РТА-4626, РТА-4625 или РТА-4627, с указанным полипептидом WISP-1.

Настоящее изобретение относится также к химерным или гуманизированным антителам против WISP-1, которые специфически связываются с полипептидом WISP-1 и включают (а) последовательность, выделенную из антитела 3D11, 11C2, 9C10, 5D4 или 9С11, секретируемого гибридомой, депонированной в АТСС соответственно под номером доступа РТА-4624, РТА-4628, РТА-4626, РТА-4625 или РТА-4627. Такие антитела могут необязательно включать тяжелую цепь, легкую цепь или вариабельные области, выделенные из антитела 3D11, 11C2, 9C10, 5D4 или 9С11.

Антитела против WISP-1 могут быть связаны с одним или несколькими небелковыми полимерами, выбираемыми из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и полиоксиалкилена, а также с цитотоксическим агентом или ферментом, радиоактиваным изотопом, флуоресцентным соединением или хемилюминесцентным соединением.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А-1F показана стимуляция WISP-1 продуцирования гиалуронана. Анализ методом исключения частиц показывает наличие пленки из гиалуронана на поверхности NRK/WISP-1H (A) и NRK/WISP-1L (B), которая отсутствует на NRK/контрольных клетках (С). NRK/WISP-1H (D) и NRK/контрольные клетки (Е) окрашивали bHABP с целью обнаружения гиалуронана. На фиг.(F) показано время накопления гиалуроновой кислоты (НА) в средах с NRK/WISP-1H и NRK/контрольными клетками.

На фиг.2А-2С показано увеличение экспрессии мРНК HAS2, CD44 и RHAMM и экспрессии белка CD44, вызываемое WISP-1. На фиг.(А) показан анализ методом RT-PCR в реальном времени экспрессии мРНК HAS1, HAS2, HAS3, CD44, RHAMM и гиалуронидазы (Hyal) в NRK/WISP-1H, NRK/WISP-1L и NRK/контрольных клетках. Результаты представлены в виде кратного увеличения индукции по сравнению с экспрессией в NRK/контрольных клетках. На фиг.(В) показан анализ методом проточной цитометрии экспрессии CD44 в NRK/WISP-1H и NRK/контрольных клетках. Заштрихованный участок представляет интенсивность флуоресценции только вторичного антитела. На фиг.(С) показан анализ методом вестерн-блоттинга белка CD44 в NRK/WISP-1H и NRK/контрольных клетках. В качестве нагрузочного эталона было использовано окрашивание актина.

На фиг.3А-3G показано увеличение подвижности и изменение морфологии клеток вследствие экспрессии WISP-1. NRK/контрольные клетки (А) образовывали четко выраженные колонии при культивировании с низкой плотностью, в то время как клетки NRK/WISP-1L (B) и NRK/WISP-1H (С) рассеивались. Клетки NRK/WISP-1H (E) характеризовались дифференцированной веретенообразной морфологией с расслоением по сравнению с NRK/контрольными клетками (D). На фиг.(F) показана произвольная миграция NRK/WISP-1H и NRK/контрольных клеток, измеренная в течение 15 часов при помощи микроскопии с замедленной съемкой при увеличенных интервалах времени между кадрами. Результаты показывают типичное среднее расстояние миграции клеток в одном поле. На фиг.(G) показана подвижность NRK/WISP-1H и NRK/контрольных клеток, определенная при помощи клеточного анализа заживления раны и измеренная через 15 часов при помощи микроскопии с замедленной съемкой при увеличенных интервалах времени между кадрами. Приведенные данные представляют собой результаты типичного эксперимента.

На фиг.4А-4С показана экспрессия мРНК HAS2 и гаптотаксическая миграция клеток NRK, вызываемые добавлением WISP-1. На фиг.(А) представлены результаты анализа методом RT-PCR в реальном времени экспрессии HAS2 и CD44 в клетках NRK, посеянных на поверхность с покрытием. В некоторых случаях субстраты с покрытием подвергали дальнейшей инкубации с WISP-1 (обработка). Результаты выражены в виде кратного значения индукции по сравнению с экспрессией в клетках NRK, культивируемых на непокрытой, не подвергнутой обработке поверхности. Покрывали нижнюю сторону фильтров модифицированной камеры Бойдена и в верхнюю камеру вводили клетки NRK (B) или клетки SW480 (C). В некоторых случаях клетки вводили непосредственно в нижнюю камеру. Подвижность клеток определяли путем подсчета клеток, переместившихся на нижнюю сторону перегородки.

На фиг.5А-5Е показана сверхэкспрессия WISP-1, HAS2 и CD44 и повышенная подвижность клеток C57MG/Wnt-1 и MMTV-Wnt-1 в опухолях молочной железы у трансгенных мышей. На фиг.(А) показан анализ методом RT-PCR в реальном времени экспрессии WISP-1, HAS2 и CD44 в клетках C57MG/Wnt-1 и C57MG/контрольных клетках. Результаты выражены в виде кратного значения индукции по сравнению с экспрессией в C57MG/контрольных клетках. На фиг.(В) показан анализ методом вестерн-блоттинга содержания CD44 в С57MG/Wnt-1 и C57MG/контрольных клетках. В качестве нагрузочного эталона использовали окрашивание актина. На фиг.(С) показано образование C57MG/контрольными клетками четко выраженных колоний при культивировании с низкой плотностью, в то время как клетки C57MG/Wnt-1 рассеивались. Полуколичественный анализ методом RT-PCR был выполнен для определения HAS2 (D) и CD44 (E) в опухолях молочной железы у трансгенных мышей MMTV-Wnt-1. Результаты выражены в виде относительного кратного значения индукции по сравнению с экспрессией в нормальной ткани молочной железы.

На фиг.6А-6Н показана экспрессия WISP-1, HAS2 и CD44 и накопление гиалуроновой кислоты в опухолях молочной железы у трансгенных мышей MMTV-Wnt-1. Гибридизация in situ WISP-1 (A, B), НAS2 (C, D) и CD44 (E, F), иммуногистохимический анализ CD44 (G) и флуоресцентное окрашивание bHABP гиалуронана (Н) в опухолях молочной железы у трансгенных мышей MMTV-Wnt-1 (t, опухоль; s, строма.)

На фиг.7А-7L показано образование колоний метастатических клеток в легком и рост опухоли, стимулируемые экспрессией WISP-1. Действие WISP-1 анализировали путем инъецирования NRK/контрольных клеток, клеток NRK/WISP-IL или NRK/WISP-1H в хвостовую вену “голым” мышам. Через разные промежутки времени после инъекции легкие визуализировали при помощи ЯМР-томографии (A, D, G, J), иссекали и регистрировали макроскопическую картину (В, Е, Н, К) и гистологические признаки (C, F, I, L). Тяжесть поражения легкого опухолями классифицировали как нормальное (А, В, С), степень I (D, E, F), степень II (G, H, I) или степень III (J, K, L).

На фиг.8А-В показано предотвращение антителом против CD44 метастазирования клеток NRK/WISP-1H. Клетки NRK/WISP-1H (2,5×10⁵ клеток) инъецировали в хвостовую вену “голым” мышам. Мышам дважды в неделю вводили 10 мг/кг антитела против CD44, изотипически сходное контрольное антитело или только буфер (PBS). Легкие иссекали через четыре недели для выполнения макроскопического морфологического анализа. Для сравнения показано изображение нормального легкого.

На фиг.9А-9С показана нуклеотидная (SEQ ID NO:2) и предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1) нативного полипептида WISP-1 человека.

На фиг.10 показано влияние экспрессии WISP-1 на способность к метастазированию клеток NRK.

На фиг.11А-В показаны свойства связывания антител против WISP-1 с разными конструкциями и препаратами на основе WISP-1.

На фиг.12А-G изображены схемы разных доменов полипептида WISP-1 и показаны результаты анализов, выполненных для идентификации эпитопов, узнаваемых антителами против WISP-1 соответственно 11С2, 5D4, 9C11 и 3D11. На фиг.12С показана аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:20.

На фиг.13 показаны результаты анализа, выполненного для идентификации эпитопа, узнаваемого антителом против WISP-1 9С10.

На фиг.14 показаны результаты анализа ELISA, свидетельствующие об обнаружении WISP-1 антителами против WISP-1.

На фиг.15 показаны результаты анализа связывания ELISA, свидетельствующие о том, что антитела против WISP-1, узнающие вариабельную область WISP-1, могут ингибировать связывание WISP-1 с гепарином.

На фиг.16А-В показаны результаты анализа обнаружения ингибирования гаптотаксиса клеток NRK антителами против WISP-1 (16А) и приведена таблица, в которой суммированы свойства и характеристики антител против WISP-1 (16В).

На фиг.17А-Е показаны результаты исследования in vivo действия антител против WISP-1. Тяжесть поражений у животных, которых подвергали воздействию антитела против WISP-1, через 3 недели была значительно ослаблена по сравнению с контрольными животными (фиг.17A, B). У мышей, которым вводили антитела против WISP-1 (n=5), сократилось число узелков и средняя площадь метастатических очагов по сравнению с животными, которым вводили контрольное антитело (фиг.17C, D). Общая площадь поражений в легких сократилась на 82-97% по сравнению с животными, которым вводили изотипически сходное контрольное антитело (фиг.17E).

На фиг.18 изображена столбчатая диаграмма, показывающая экспрессию WISP-1 в линиях 4Т1/контрольных клеток, 4Т1/WISP-1L, 4T1/WISP-1H, NRK/контрольных клеток, NRK/WISP-1L и WISP-1H, измеренную полуколичественным методом RT-PCR (Taqman).

На фиг.19 показаны результаты анализа колониеобразования in vitro линий 4Т1/контрольных клеток, 4Т1/WISP-1L и 4T1/WISP-1H.

На фиг.20 показаны результаты анализа измерения индекса инвазии in vitro с использованием модифицированной системы камер Бойдена с матригелем и линий 4Т1/контрольных клеток, 4Т1/WISP-1L и 4Т1/WISP-1H.

На фиг.21А-В показано воздействие экспрессии WISP-1 на онкогенез эпителиальных клеток молочной железы. Воздействие WISP-1 анализировали путем инъецирования мышам Balb/C 4Т1/контрольных клеток 1, 4Т1/контрольных клеток 2, 4Т1/WISP-1L или 4Т1/WISP-1H. Указаны объем опухоли (21А) и масса опухоли (21В).

На фиг.22 изображена столбчатая диаграмма, показывающая относительную экспрессию HAS2 и CD44 в опухолях, образованных инокулированными 4Т1/контрольными клетками, клетками 4T1/WISP-1L и 4Т1/WISP-1H.

На фиг.23А-F показано воздействие WISP-1 на метастазирование эпителиальных клеток молочной железы, определенное in vivo путем инокуляции клеток 4Т1 в жировые тела молочной железы мышей и исследования степени распространения метастазов при помощи микрокомпьютерной томографии и гистологии. Через 31 день у мышей, которым инокулировали клетки 4T1/WISP-1L или 4T1/WISP-1H, наблюдалось обширное метастазирование легкого (фиг.23B и 23D) по сравнению с мышами, которым инъецировали 4Т1/контрольные клетки (фиг.23A и 23C). В результате выполнения иммуногистохимического анализа было также установлено, что в метастатических очагах легкого, вызванных 4Т1/WISP-1, был экспрессирован CD44 в высокой концентрации (фиг.23E). В указанных опухолях CD44 был локализован в плазматической мембране клеток 4Т1/WISP-1 (фиг.23F).

На фиг.24А показана экспрессия WISP-1 в NRK/контрольных клетках, NRK/WISP-1_1234, NRK/WISP-1_134, NRK/WISP-1_234, NRK/WISP-1_123 и NRK/WISP-1_124, измеренная полуколичественным методом RT-PCR (Taqman); результаты выражены в виде значения, кратного экспрессии WISP-1 в клетках NRK/WISP-1_1234. На фиг.24В показано воздействие указанных конструкций на онкогенез in vivo; результаты выражены в виде воздействия на объем опухоли.

На фиг.25 представлен гистологический анализ иссеченных опухолей, изображенных на фиг.24, который показал, что опухолевые клетки из опухолей NRK/WISP-1_234 были фенотипически подобны опухолевым клеткам из опухолей NHR/WISP-1_1234. В указанных опухолях клетки представляли собой дифференцированные и веретенообразные фибробласты. Опухолевые клетки из опухолей NRK/WISP-1_134 отличались фенотипически, были менее дифференцированными, часто многоядерными и характеризовались высокой скоростью митоза, о чем свидетельствует присутствие многочисленных митотических фигур (стрелки).

На фиг.26 представлен гистологический анализ иссеченных опухолей в ксенотрансплантате NRK/WISP-1_134, показанном на фиг.24, из которого следует, что опухолевые клетки проникли в несколько кровеносных сосудов, расположенных рядом с опухолью.

На фиг.27 показаны результаты анализа экспрессии в виде кратного значения инвазии по сравнению с контрольными клетками, при выполнении которого клетки НЕК 293, трансфицированные пустым вектором, культивировали в модифицированной системе камер Бойдена. Клетки 4Т1 характеризовались 4-кратным увеличением инвазии, когда клетки НЕК 293, экспрессирующие конструкции WISP-1_1234, WISP-1_134 или WISP-123, высевали в нижнюю камеру.

На фиг.28А-28В показано воздействие растворимого полипептида WISP-1-домен-1 на стимулированную WISP-1 инвазию клеток 4Т1 при определении с использованием модифицированной системы камер Бойдена, покрытых матригелем. Результаты выражены в виде относительного кратного значения инвазии по сравнению с 4Т1/контрольными клетками. WISP-1-домен-1-His и WISP-1-домен-1-Fc оказывали антагонистическое действие на стимулированную WISP-1 инвазицию клеток 4Т1 в зависимости от дозы.

На фиг.29 показан анализ гибридизации in situ тканей из модели ксенотрансплантата НРАС аденокарциномы поджелудочной железы человека, выполненный для оценки экспрессии WISP-1.

На фиг.30 изображен график, показывающий воздействие конструкций WISP-1 на объем опухоли в модели с использованием “голых” мышей.

На фиг.31 показаны анализы гибридизации in situ, выполненные для оценки экспрессии WISP-1 в первичной аденокарциноме поджелудочной железы человека.

На фиг.32 показано иммуногистохимическое окрашивание для оценки экспрессии WISP-1 в первичной аденокарциноме ободочной кишки.

Подробное описание изобретения

I. Определения терминов

Термин “полипептид WISP” означает семейство белков WISP человека и мыши с нативной последовательностью и их вариантов, расcмотренных в настоящем описании изобретения, гены которых индуцированы, по крайней мере, Wnt-1. В определение данного термина входит WISP-1 и его варианты. Такие белки WISP-1 описаны ниже, а также в заявке РСТ WO 99/21998, опубликованной 6 мая 1999 г., патенте США № 6387657 В1, выданном 14 мая 2002 г., и публикации Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998).

Термины “полипептид WISP-1”, “гомолог WISP-1” и их грамматические варианты в значении, использованном в настоящем описании изобретения, означают белок WISP-1 с нативной последовательностью и его варианты (которые определены ниже). Полипептид WISP-1 может быть выделен из разных источников, например из тканей человека разных типов или других источников, или получен методами рекомбинантных ДНК, методами синтеза, любыми комбинациями указанных методов и подобными методами.

Термин “полипептид WISP-1 с нативной последовательностью” означает полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и полипептид WISP-1, существующий в природе. Такие полипептиды WISP-1 с нативной последовательностью могут быть выделены из природного источника или получены методами рекомбинантных ДНК или методами синтеза. Термин “полипептид WISP-1 с нативной последовательностью”, в частности, означает существующие в природе пр