Способ анализа кормовых дрожжей на содержание нуклеотидной фракции

Способ анализа кормовых дрожжей на содержание нуклеотидной фракции

Реферат

Изобретение относится к сфере экоаналитического контроля качества кормовых дрожжей - целевой продукции крупнотоннажных предприятий микробиологического синтеза кормового белка из растительной клетчатки или из парафинов нефти и газа.

Основным показателем качества указанной белковой продукции является массовая доля простых протеинов, хорошо усвояемых сельскохозяйственными животными и птицей. Применяемые в контроле качества кормовых дрожжей методы определения массовой доли «сырого протеина» (по Кьельдалю) и «истинного белка» (по Барнштейну)) не удовлетворяют современным требованиям рутинного контроля биопроизводства как в отношении их достоверности и селективности, так и в отношении контроля экологической чистоты и безопасности выпускаемой биопродукции (Востоков В.М., Ивашкин Е.Г., Карташов В.Р. // Аналитический контроль содержания протеинов в продукции предприятий микробиологического синтеза кормового белка / Заводская лаборатория. Диагностика материалов. - 2007, Т.73. - Вып.3. - С.21-24.) В обоих случаях анализа массовую долю белка оценивают по содержанию общего азота, входящего в состав всех белковых и небелковых соединений. Одни белки являются полезными нутриентами, другие могут нанести вред живому организму, например генетически неадекватные нуклеотиды и нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК), которые способствуют мутагенезу, вызывают аллергические и астмоидные заболевания, становятся опасными загрязнителями биосферы.

Эти методы не являются достоверными, т.к. в анализируемых веществах может быть азот небелковой природы. Известны и другие недостатки метода Кьельдаля, снижающие его практическую значимость: продолжительность, сложность работы с горячей концентрированной серной кислотой и др.

В качестве прототипа принят способ количественного определения истинного белка в кормовых дрожжах (см. авт. свид. СССР №1401380, G01N 33/48, опубл. 07.06.1988), основанный на способе Лоури и предусматривающий осаждение белка сульфатом меди в щелочной среде, отделение осадка с последующей оценкой результатов, с целью повышения достоверности и сокращения времени определения, после отделения осуществляют солюбилизацию белка путем выделения его в медно-белковый комплекс и разрушение при нагревании в течение 30 мин на водяной бане в 0,25 М растворе комплексона 111 с последующим разбавлением раствора дистиллированной водой, а оценку результатов осуществляют спектрофотометрически.

В указанном авторском свидетельстве была также заложена предпосылка о содержании в кормовых дрожжах нуклеотидов на основании анализа модельных смесей из белка и нуклеиновых кислот и указано, что при использовании способа по авт. свид. №1401380 небелковые азотсодержащие соединения (нуклеиновые кислоты) искажают результат измерения истинного белка в кормовых дрожжах, а по способу Барнштейна значительно завышают результаты измерения истинного белка. Содержание нуклеотидов в кормовых дрожжах в данном способе не определяют.

Задачей предлагаемого изобретения является расширение технологических возможностей известного способа.

Технический результат - осуществление экспресс-оценки массовой доли экологически опасных геномодифицированных нуклеотидов в промышленной продукции микробиологического синтеза кормового белка. Этот технический результат достигается тем, то в способе анализа кормовых дрожжей при контроле их качественного и количественного состава, включающем определение истинного белка путем его осаждения из навески сульфатом меди в щелочной среде, выделение его в медно-белковый комплекс, который разрушают при нагревании в растворе комплексона 111 с последующим спектрофотометрированием и определение массовой доли простых истинных белков по оптической плотности селективно окрашенного белка с реактивом Фолина, одновременно в одинаковых условиях анализируют две одинаковые навески анализируемой пробы кормовых дрожжей, из второй навески выделяют все простые и сложные белки, осуществляя отгонку аммиака из медно- белкового комплекса, определяя общую массу азота и по ней вычисляя массовую долю белка по формуле:

m_Б=m_Nk100/а(1-ω/100),

где m_N - общая масса азота, г,

k - коэффициент пересчета на белок,

а - масса навески, г,

ω - массовая доля влаги в кормовых дрожжах, %

и оценивают массовую долю нуклеотидов как разность содержания белков во второй и первой навесках.

Предлагаемый способ является комбинационным решением, где сочетаются два известных и независимых способа определения массовой доли белка: по авт. свид. №1401380 на основе метода Лоури и по Барнштейну, которые значительно отличаются друг от друга по выполнению и по селективности. Белок, определенный методом Барнштейна по общему содержанию азота, по составу отличается от белка, найденного фотометрическим методом на основе специфической реакции Лоури. В первом случае в состав «истинного белка» входят все белковые соединения, включая протеины и нуклеотиды. Во втором случае нуклеотиды не определяются, не дают характерного окрашивания с реактивом Фалина. Предлагается по разности результатов оценить массовую долю нуклеотидов в кормовых дрожжах.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут одновременно две одинаковые навески из одной анализируемой пробы кормовых дрожжей и анализируют их в одинаковых условиях. Подготовку обеих проб до выделения медно-белкового комплекса осуществляют одинаково, а непосредственное определение белков - по-разному: в первой навеске - по способу-прототипу, во второй - по методу Барнштейна и определяют количество нуклеотидов как разность содержания белков во второй и первой навесках.

Пример осуществления способа.

Берут точную навеску пробы кормовых дрожжей массой 0,4 г, помещают ее в стакан вместимостью 200 см³, добавляют доведенную до кипения дистиллированную воду, 10 см³ 2%-ного раствора сульфата меди и по каплям, при перемешивании, 10 см³ 2,5%-ного раствора гидроксида натрия. После отстаивания осадка его отделяют путем фильтрования через бумажный фильтр, одновременно промывая его методом декантации двумя порциями (по 20 см³) дистиллированной воды. Промытый осадок медно-белкового комплекса, выделенный на бумажном фильтре, возвращают в исходный стакан вместе с фильтром и добавляют туда при перемешивании 20 см³ 0,25 М раствора комплексона 111 и 60 см³ 1 М раствора едкого натра. Содержимое стакана нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Раствор переносят в мерную колбу на 500 см³, оставляя фильтр в стакане, промывая его небольшими порциями горячей воды и сливая все промывные воды в мерную колбу с анализируемым раствором. После охлаждения до комнатной температуры раствор в колбе доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Аликвоту 100 см³ полученного раствора переносят в мерную колбу на 250 см³, раствор доводят до метки водой и перемешивают. Для удаления взвешенных частиц около 20 см³ раствора фильтруют в сухой стакан через фильтр с синей лентой, отбрасывая первую порцию фильтрата. С помощью пипетки отбирают 5 см³ фильтрата, помещают его в мерную колбу на 25 см³. Добавляют туда 15 см³ свежеприготовленной смеси растворов, содержащей гидроксид и карбонат натрия, калий-натрий винно-кислый и сульфат меди. После 10 мин перемешивания в мерную колбу добавляют 1,5 см³ свежеприготовленного раствора Фолина, доводят раствор до метки водой, перемешивают и дают ему постоять около 30 мин. Указанные растворы готовят известными методами, которые описаны, например, в авт. свид. №1401380. Полученный окрашенный раствор синего цвета фотометрируют в кювете на 1 см при длине волны λ=690 нм. В качестве нулевого используют раствор «холостого опыта», в котором отсутствует белок. По величине оптической плотности исследуемого раствора, используя метод градуировочного графика, находят содержание белка в анализируемой навеске (γ мкг) и вычисляют массовую долю «истинного белка» (m_Л) по формуле:

m_Л=γ·0,025/а(1-ω/100),

где 0,025 - коэффициент, учитывающий разбавление и соотношение размерностей;

а - масса навески дрожжей, г;

ω - массовая доля влаги в кормовых дрожжах, %.

Берут вторую такую же навеску кормовых дрожжей массой 0,4 г из той же пробы. Подготавливают ее так же, как и навеску 1. Затем осуществляют «мокрое сожжение» выделенного медно-белкового комплекса и производят отгонку аммиака в стандартный раствор серной кислоты. Методом обратного титрования полученных аммонийных солей определяют общую массу азота (m_N, г) и вычисляют массовую долю белка (m_Б) по формуле:

m_Б=m_Nk100/а(1·ω/100),

где m_N - общая масса азота, г,

k - коэффициент пересчета на белок,

а - масса навески, г,

ω - массовая доля влаги в кормовых дрожжах, %.

Массовую долю нуклеотидов в кормовых дрожжах оценивают по разности

m_М=m_Б-m_Л.

Проведены испытания предлагаемого способа в лабораторных (табл.1) и производственных условиях (табл.2).

Экспериментальное подтверждение, когда предлагаемым способом были исследованы модельные белковые смеси, состоящие их чистого альбумина ("бычьего белка") и стандарта ДНК, приведено и табл.1.

1. В модельной смеси без добавки ДНК («холостой опыт») оба метода показывают одинаковое содержание белка.

2. Анализ модельной смеси, составленной из чистого альбумина и ДНК, дал разные результаты: фотометрическим методом определен лишь простой протеин, а методом Барнштейна определяется суммарное содержание обоих компонентой модельной смеси - альбумина и ДНК.

3. Сравнение результатов анализа модельных смесей, имитирующих белковый состав кормовых дрожжей микробиологического производства, разными способами подтверждает возможность определения предлагаемым способом массовой доли нуклеотидной фракции в кормовых дрожжах.

Таблица 2
Заводы БВК	Среднее значение массовой доли белка, %	Массовая доля нуклеотидов
По прототипу	По Барнштейну
Астраханский ГДЗ	48,94	52,54	3,60
Волжский ГДЗ	30,02	33,36	3,34
Кировский БХЗ	35,94	40,40	4,46

Способ анализа кормовых дрожжей на содержание нуклеотидной фракции, включающий осаждение белка сульфатом меди в щелочной среде, выделение его в медно-белковый комплекс и последующее определение количества белка в двух одинаковых навесках одной анализируемой пробы, причем в первой навеске определяют массовую долю белков по оптической плотности селективно окрашенного белка реактивом Фолина, из второй навески выделяют белки, осуществляя отгонку аммиака из медно-белкового комплекса, определяя общую массу азота и по ней вычисляя массовую долю белка, а массовую долю нуклеотидной фракции оценивают как разность содержания белков во второй и первой навесках.