Способы очистки белков, содержащих область fc

Способы очистки белков, содержащих область fc

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке "СПОСОБЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ ОБЛАСТЬ Fc", поданной 17 июня 2005 г., имеющей серийный номер 60/691821. Содержание данной заявки полностью включено в настоящую заявку.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Антитела являются мощными компонентами иммунной системы многих животных и, в частности, человека. Недавние успехи технологии рекомбинантных ДНК позволяют получать антитела против практически любой мишени, например раковых клеток, бактерий и вирусов. Обычно антитело получают с применением линии клеток, измененной таким образом, чтобы она экспрессировала высокие уровни данного антитела. Затем измененную линию клеток выращивают в культуре, которая содержит сложную смесь сахаров, аминокислот и факторов роста, а также различные белки, включая, например, белки сыворотки. Однако отделение полных антител от побочных продуктов клеток и компонентов культуры до степени чистоты, достаточной для применения в исследованиях или в качестве лекарственных средств, представляет собой сложную задачу. Очистка молекул антител особенно важна, если антитела предполагается использовать в качестве лекарственных средств для введения людям.

Традиционные схемы (или линии) очистки антител часто включают этап хроматографии, использующий способность молекулы антитела предпочтительно связывать твердую фазу или удерживаться твердой фазой (или функционализированной твердой фазой) хроматографической колонки по сравнению со связыванием или удерживанием различных примесей. Были предложены или реализованы схемы очистки антител, в которых белки, содержащие область СН2/СН3, сначала связываются с Белком А, иммобилизованным на твердой фазе, после чего связанные с твердой фазой примеси удаляют путем промывки твердой фазы раствором гидрофобного растворителя-электролита, а за этим следует выделение белков, содержащих область СН2/СН3, из твердой фазы. Однако эти схемы имеют ограничение, связанное с тем, что условия, которые применяют для предпочтительного связывания белков, содержащих область СН2/СН3, способствуют также связыванию примесей (например, антител с неполными областями СН2/СН3). Для разработки лечебных средств для людей такие примеси очень нежелательны.

Соответственно, существует потребность в улучшении очистки белков или полипептидов, обладающих константными областями, в частности белков, обладающих областями Fc (например, антител), продуцируемых в культуре клеток.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В различных аспектах настоящего изобретения предложены способы очистки белка, имеющего область Fc, из исходной жидкости, содержащей этот белок и одну или более примесей. В способах согласно настоящему изобретению белок, имеющий область Fc (целевой белок), адсорбируют на веществе, связывающем Fc, а затем вещество, связывающее Fc, промывают буферным раствором, содержащим соли бивалентных катионов, с целью удаления одной или более примесей. Затем белок отделяют от вещества, связывающего Fc, в растворе для элюции. Способы согласно настоящему изобретению особенно полезны для удаления примесей, таких как разновидности прочтения интронов (intron read through variant species, IRT-варианты), разновидности с пониженным содержанием дисульфидных связей (under disulfide bonded species, UDB-варианты) и/или низкомолекулярные разновидности (low molecular weight variant species, LMW-варианты). Способы согласно настоящему изобретению также эффективны для удаления таких примесей, как белки (НСР) и ДНК клеток-хозяев.

Способы согласно настоящему изобретению включают один или более этапов выделения путем хроматографии и дополнительно могут включать один или более этапов фильтрации. Этапы выделения путем хроматографии могут быть непрерывными или с перерывами (т.е. периодический подход) либо могут представлять собой комбинацию обоих подходов. В различных вариантах реализации способы включают один или более этапов фильтрации, например, для удаления вирусов, концентрирования и буферизации раствора, содержащего целевой белок, а также для удаления загрязняющих примесей (контаминантов) микробиологического происхождения.

В различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, представляет собой антигенсвязывающий полипептид (например, антитело или его фрагмент) или иммуноадгезин (например, иммуноадгезин рецептора к ФНО). В различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, представляет собой содержащий антитело рекомбинантный продукт, антитело мыши, химерное антитело или гуманизированное антитело. В предпочтительном способе реализации белок, содержащий область Fc, представляет собой анти-IL-13 антитело человека (т.е. антитело против интерлейкина IL-13) или гуманизированное анти-IL-13 антитело. В качестве альтернативы в других вариантах реализации белок, содержащий область Fc, способен связывать антиген, такой как Аβ, CD3, CD52, VEGF (фактор роста эндотелии сосудов), EGFR (эпидермальный фактор роста), CD33, CD20, HER-2, ФНОα, CD25, RSV (респираторно-синцитиальный вирус), IgE, gp IIb/IIIa, CD11a или интегрин α4.

В различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, получают по технологии рекомбинантной ДНК. В различных вариантах реализации белок, содержащий область Fc, получают по технологии рекомбинантной ДНК в клетке яичника китайского хомячка (СНО).

В различных вариантах реализации одна или более примесей содержат одно или более из следующего: белок клетки-хозяина, ДНК клетки-хозяина, белок культуры клеток и нежелательные разновидности белков, имеющих область Fc, а также их смеси.

Например, в различных вариантах реализации настоящего изобретения нежелательные разновидности белка, содержащего область Fc, включают одну или более цепей антитела или фрагментов цепей, имеющих последовательность, представляющую собой другой вариант прочитывания интронов, одну или более цепей антитела или фрагментов цепей, имеющих неправильную дисульфидную связь, половинчатое антитело или его фрагмент, димер легкой цепи или его фрагмент, а также димер тяжелой цепи или его фрагмент.

В одном аспекте способами согласно настоящему изобретению белок, имеющий область Fc, очищают от исходной жидкости, содержащей этот белок и одну или более примесей, путем первоначального адсорбирования белка при помощи вещества, связывающего Fc, за которым следует промывка вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующее выделение белка из вещества, связывающего Fc. В различных вариантах реализации этапы адсорбирования белка на веществе, связывающем Fc, и промывки вещества, связывающего Fc буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, выполняют при температуре в диапазоне от приблизительно 2°С до приблизительно 24°С. В различных вариантах реализации этап выделения белка из вещества, связывающего Fc, включает элюирование белка буфером для элюции, имеющим рН в диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 6,5.

В различных вариантах реализации вещество, связывающее область Fc, содержит одно или более из следующих: Белок А и Белок G. В предпочтительном способе реализации вещество, связывающее Fc, иммобилизовано на твердой фазе. Твердая фаза может включать, например, одно или более из следующего: гранула, агарозная матрица, оксид кремния и их смеси.

Соли бивалентных катионов, присутствующие в буфере, который применяют для промывки вещества, связывающего Fc, могут включать, например, хаотропные соли. Соли бивалентных катионов, подходящие для приготовления буферного раствора для промывки, включают, без ограничения, хлорид магния, хлорид кальция, хлорид никеля и их смеси. В различных вариантах реализации соли бивалентных катионов, подходящие для приготовления промывочного буферного раствора, включают, без ограничения, такие соли, как тиоцианат (SCN^-), перхлорат (ClO₄ ^-), нитрат (NO₃ ^-), хлорид и бромид бивалентных катионов II группы (например, магний, кальций, барий и т.д.), катионов бивалентных переходных металлов (например, медь, никель, марганец и т.д.), а также комбинации этих солей.

В различных вариантах реализации значение рН буферного раствора, содержащего соли бивалентных ионов, лежит в диапазоне от приблизительно 4 до приблизительно 8, от приблизительно 4,5 до приблизительно 7,5 или от приблизительно 6 до приблизительно 8. Охваченные значения и диапазоны и/или промежуточные значения или диапазоны в пределах диапазонов, описанных в настоящей заявке, также входят в объем настоящего изобретения. Например, значение рН соли бивалентного 7,1 до приблизительно 7,9, 7,2 до приблизительно 7,9, 7,3 до приблизительно 7,7, 7,4 до приблизительно 7,6, 4 до приблизительно 5, 5 до приблизительно 6, 6 до приблизительно 7 или от приблизительно 8 до приблизительно 9.

Более того, предполагается, что диапазоны, которые включают указанные значения в качестве верхнего или нижнего предела, входят в объем настоящего изобретения. Например, значение рН соли бивалентного катиона составляет по меньшей мере приблизительно (или приблизительно) 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или 8.

В различных вариантах реализации концентрация соли бивалентного катиона в буферном растворе лежит в пределах от приблизительно 0,1 М до приблизительно 5 М, 5 а в некоторых вариантах реализации от приблизительно 0,5 М до приблизительно 3 М, от приблизительно 1,0 М до приблизительно 3 М или от приблизительно 0,6 М до приблизительно 2,5 М. Например, буфер бивалентного катиона может содержать по меньшей мере 0,6 М CaCl₂, или по меньшей мере 2 М MgCl₂, или по меньшей мере 2 М CaCl₂. Охваченные значения и диапазоны и/или промежуточные значения или диапазоны в пределах диапазонов, описанных в настоящей заявке, также входят в объем настоящего изобретения. Например, концентрация соли бивалентного катиона в буферном растворе составляет от приблизительно 0,5 М до приблизительно 0,75 М, от приблизительно 0,5 М до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,5 М до приблизительно 0,9 М, приблизительно от 0,5 М до 1,0 М, приблизительно от 0,5 М до 2 М, от приблизительно 1,5 М до приблизительно 2,0 М, от приблизительно 1,5 М до приблизительно 2,5 М, от приблизительно 1,5 М до приблизительно 3,0 М или от приблизительно 2,5 М до приблизительно 3 М.

Более того, предполагается, что диапазоны, которые включают указанные значения в качестве верхнего или нижнего предела, входят в объем настоящего изобретения. Например, концентрация соли бивалентного катиона в буферном растворе, равная по меньшей мере приблизительно (или приблизительно) 0,6 М, 1 М, 1,5 М, 2 М, 2,5 М или 3 М. В различных вариантах реализации температура буферного раствора, содержащего соль бивалентного катиона, лежит в диапазоне от приблизительно 2°С до приблизительно 24°С.

В различных вариантах реализации этап очистки белка от вещества, связывающего Fc, включает элюирование белка буфером элюции, рН которого лежит в диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 6,5, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 2,0 до приблизительно 4,0, более предпочтительно - в диапазоне от приблизительно 2,5 до приблизительно 3,5. Охваченные значения и диапазоны и/или промежуточные значения или диапазоны в пределах диапазонов, описанных в настоящей заявке, также входят в объем настоящего изобретения. Например, рН буфера элюции составляет от приблизительно 2 до приблизительно 3 или от приблизительно 3 до приблизительно 4.

Более того, предполагается, что диапазоны, которые включают указанные значения в качестве верхнего или нижнего предела, входят в объем настоящего изобретения. Например, рН буфера элюции составляет по меньшей мере приблизительно (или приблизительно) 2, 2,5, 3, 3,5 или 4.

В различных вариантах реализации выделенные белки можно подвергнуть дополнительным этапам очистки либо до, либо после этапа хроматографии с веществом, связывающим Fc. Например, примеры дополнительных этапов очистки включают, без ограничения: анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию, аффинную хроматография с иммобилизованными металлами, хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC), гидроксиапатитную хроматографию, диализ, аффинную хроматографию, осаждение сульфатом аммония, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), хроматофокусирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию, микрофильтрацию и гель-фильтрацию. В различных вариантах реализации за этапом хроматографии с веществом, связывающим Fc, следуют этап анионообменной хроматографии и хроматографии гидрофобного взаимодействия. В различных вариантах реализации за этапом хроматографии следует также этап фильтрации вирусов, этап ультрафильтрации/диафильтрации и/или этап фильтрации микробных контаминантов.

В одном из аспектов настоящее изобретение обеспечивает способы очистки антитела от его раствора, содержащего примеси. В различных вариантах реализации указанный способ включает первоначальную адсорбцию белка на веществе, связывающем Fc, за которой следует промывка вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующее выделение белка из вещества, связывающего Fc, с получением первого объединенного элюента.

В различных вариантах реализации процесс продолжают, подвергая первый объединенный элюент ионообменной хроматографии путем приведения первого объединенного элюента в контакт с ионообменной смолой таким образом, чтобы целевой белок не адсорбировался на смоле, и выделения протекающего через колонку целевого белка с получением второго объединенного элюента. В различных вариантах реализации этап ионообменной хроматографии дополнительно включает промывку ионообменной смолы буферным промывочным раствором с целью выделить по меньшей мере часть адсорбированного целевого белка.

В различных вариантах реализации процесс очистки продолжают, подвергая второй объединенный элюент хроматографии гидрофобного взаимодействия, в процессе которой целевой белок адсорбируют на гидрофобной смоле (например, твердая фаза, функционализированная гидрофобными лигандами), промывают гидрофобную смолу буферным раствором для промывки с ионной силой, которая не способствует существенному элюированию целевого белка, и выделяют очищенный целевой белок (обычно при помощи буфера для элюции, ионная сила которого достаточно низка, чтобы обеспечить десорбцию целевого белка из гидрофобной смолы).

В предпочтительных вариантах реализации различных аспектов настоящего изобретения вещество, связывающее Fc, иммобилизовано на твердой фазе, которую в предпочтительном случае уравновешивают подходящим буфером перед тем, как привести в контакт с исходной жидкостью. Твердая фаза предпочтительно представляет собой колонку, содержащую агарозну, на которой иммобилизовано вещество, связывающее Fc. В различных вариантах реализации колонка покрыта реагентом, таким как глицерин, для предотвращения неспецифического связывания на колонке.

В различных вариантах реализации белки, очищенные способом согласно настоящему изобретению, можно смешать с фармацевтически приемлемым растворителем и применять в диагностических, терапевтических целях или в других целях, известных для таких молекул.

В различных аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы очистки белка, содержащего область Fc, от раствора, содержащего этот белок и ITR-варианты (варианты прочтения интронов) этого белка. В предложенных аспектах способы согласно настоящему изобретению применяют для снижения уровней одной или более разновидностей, представляющих собой варианты прочтения интронов в препарате белка, например в препарате антитела. В различных вариантах реализации уровень вариантов прочтения интронов в белке, выделенном из вещества, связывающего Fc, по меньшей мере в 5 раз ниже уровня вариантов прочтения интронов в исходной жидкости, а в некоторых вариантах реализации - по меньшей мере в 10 раз ниже уровней вариантов прочтения интронов в исходной жидкости. В различных вариантах реализации варианты прочтения интронов в растворе, содержащем указанный белок, выделенный из вещества, связывающего Fc, составляют менее приблизительно 1,0%, 0,8%, 0,5%, 0,2% или 0,1% разновидностей указанного белка.

В различных аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы очистки белка, содержащего область Fc, от раствора, который содержит этот белок и его варианты с низкой молекулярной массой (LMW). В предложенных аспектах способы согласно настоящему изобретению применяют для снижения уровней одного или более разновидностей, представляющих собой варианты с низкой молекулярной массой, в препарате белка, например в препарате антитела. В различных вариантах реализации уровень вариантов с низкой молекулярной массой в белке, выделенном из вещества, связывающего Fc, по меньшей мере в 5 раз ниже уровня вариантов с низкой молекулярной массой в исходной жидкости, а в некоторых вариантах реализации - по меньшей мере в 10 раз ниже уровней вариантов с низкой молекулярной массой в исходной жидкости. В различных вариантах реализации варианты с низкой молекулярной массой в растворе, содержащем указанный белок, выделенный из вещества, связывающего Fc, составляют менее приблизительно 1,0%, 0,8%, 0,5%, 0,2% или 0,1% разновидностей указанного белка.

В различных аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы очистки белка, содержащего область Fc, от раствора, содержащего этот белок и UDB-варианты (варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей) этого белка. В предложенных аспектах способы согласно настоящему изобретению применяют для снижения уровней одной или более разновидностей, представляющих собой варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей, в препарате белка, например в препарате антитела. В различных вариантах реализации уровень вариантов с пониженным содержанием дисульфидных связей в белке, выделенном из вещества, связывающего Fc, по меньшей мере в 5 раз ниже уровня вариантов с пониженным содержанием дисульфидных связей в исходной жидкости, а в некоторых вариантах реализации - по меньшей мере в 10 раз ниже уровней вариантов с пониженным содержанием дисульфидных связей в исходной жидкости. В различных вариантах реализации варианты с пониженным содержанием дисульфидных связей в растворе, содержащем указанный белок, выделенный из вещества, связывающего Fc, составляют менее приблизительно 1,0%, 0,8%, 0,5%, 0,2% или 0,1% разновидностей указанного белка.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает белок, содержащий область Fc, очищенный способом согласно настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает систему для реализации любого из способов согласно настоящему изобретению, которая включает по меньшей мере первый этап адсорбции белка на веществе, связывающем Fc, с последующей промывкой вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующим выделением белка из вещества, связывающего Fc.

В других аспектах настоящее изобретение обеспечивает линию очистки для реализации любого из способов согласно настоящему изобретению, которые содержат по меньшей мере первый этап адсорбции белка на веществе, связывающем Fc, с последующей промывкой вещества, связывающего Fc, буферным раствором, содержащим соль бивалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующим выделением белка из вещества, связывающего Fc.

Различные аспекты настоящего изобретения предусматривают также наборы для применения в реализации способов согласно настоящему изобретению. В различных вариантах реализации набор содержит по меньшей мере один реагент и инструкции по применению набора. Например, набор может содержать один или более таких реагентов, как вещество, связывающее Fc, соль бивалентного катиона и реагенты для приготовления буферного раствора, содержащего соль бивалентного катиона, а также инструкции по применению набора.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перед тем как приступить к более подробному описанию изобретения, полезно уяснить приведенные ниже определения терминов, встречающихся в данной заявке. Приведенные определения объединены в группы для облегчения обращения к ним, а не с целью ограничения.

Определения, относящиеся к белку

В различных аспектах настоящего изобретения предложены способы очистки белка, содержащего область Fc, от раствора, содержащего этот белок и один или более вариантов прочитывания этого белка, таких как, например, варианты прочтения интронов (ITR-варианты). В предложенных аспектах способы согласно настоящему изобретению применяют для снижения уровней одной или более разновидностей, представляющих собой варианты прочтения интронов в препарате белка, например в препарате антитела. В настоящей заявке термины "вариант прочтения интронов" и "разновидность [молекул], представляющая собой вариант прочтения интрона," являются взаимозаменяемыми и относятся к продукту процесса, в котором при синтезе представляющего интерес белка, содержащего область Fc (например, целевого белка), стоп-кодон, расположенный в интроне перед какой-либо кодирующей областью, обуславливает терминацию удлинения цепи полипептида до того, как произойдет транскрипция данной кодирующей области. В результате образуется вариант представляющего интерес белка (т.е. вариант прочтения интрона), у которого один или более доменов являются неполными или отсутствуют. Такие интроны могут содержать более одного стоп-кодона, что обуславливает возможность образования нескольких различных вариантов прочтения интрона.

Термин "вариант с пониженным содержанием дисульфидных связей" или "UDB-вариант" относится к любой молекуле, в которой отсутствует по меньшей мере одна дисульфидная связь. Отсутствовать может либо внутримолекулярная дисульфидная связь, либо межмолекулярная дисульфидная связь, либо комбинация того и другого.

Термин "разновидность с низкой молекулярной массой" или "LMW-разновидность" относится к вариантам белка, содержащего область Fc, включая молекулу белка, которая состоит из свободной тяжелой цепи, свободной легкой цепи, молекулу IRT, половину молекулы и три четверти молекулы, а также их смеси.

Белок А представляет собой белок клеточной стенки массой около 42 кДа, обнаруженный в большинстве штаммов Staphylococcus aureas, который с высокой аффинностью связывает область Fc антител (около 10^-8 М для IgG человека). В настоящем описании термин "Белок А" охватывает Белок А, выделенный из природного источника. Белок А, полученный путем синтеза (например, путем синтеза пептидов или по технологии рекомбинантной ДНК и т.д.), а также его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, обладающие областью СН2/СН3.

Белок G - это белок клеточной стенки стрептококков группы G. Белок G представляет собой рецептор к Fc III типа, который с высокой аффинностью связывает область Fc антител, в частности антител класса IgG. В настоящем описании термин "Белок G" охватывает Белок G, выделенный из природного источника, Белок G, полученный путем синтеза (например, путем синтеза пептидов или по технологии рекомбинантной ДНК и т.д.), а также его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, обладающие областью Fc.

Термин "антитело" или "иммуноглобулин" (которые в настоящем описании являются взаимозаменяемыми) относится к антигенсвязывающему белку, обладающему базовой структурой из четырех цепей полипептидов, включающей две тяжелые и две легкие цепи, где указанные цепи стабилизированы, например, межмолекулярной дисульфидной связью, который обладает способностью специфическим образом связывать антиген. И тяжелая, и легкая цепи упакованы (сложены) с образованием доменов.

Термин "домен" относится к глобулярной области тяжелой или легкой цепи полипептида, содержащего пептидные петли (например, содержащего от 3 до 4 пептидных петель), стабилизированный, например, посредством β-складчатого листа и/или дисульфидными связями в пределах одной цепи. Далее в настоящей заявке домены относят к «константным» или «вариабельным» на основании сравнительного отсутствия вариаций последовательности в пределах домена в случае «константного» домена или существенных различий в пределах домена в случае «вариабельного» домена. "Константные" домены легкой цепи могут называться "константными областями легкой цепи", "константными доменами легкой цепи", областями "CL" или доменами "CL", причем все указанные термины равнозначны. "Константные" домены тяжелой цепи могут называться "константными областями тяжелой цепи", "константными доменами тяжелой цепи", областями "СИ" или доменами "СН", причем все указанные термины равнозначны. "Вариабельные" домены легкой цепи могут называться "вариабельными областями легкой цепи", "вариабельными доменами легкой цепи", областями "VL" или доменами "VL", причем все указанные термины равнозначны. "Вариабельные" домены тяжелой цепи могут называться "вариабельными областями тяжелой цепи", "вариабельными доменами тяжелой цепи", областями "VH" или доменами "VH", причем все указанные термины равнозначны.

Термин "фрагмент" относится к части или участку белка антитела или цепи антитела, которые содержат меньше остатков аминокислот, чем интактные или полные антитело или цепь антитела. Фрагменты можно получить посредством обработки интактного или полного антитела или цепи антитела химическим веществом или ферментом. Фрагменты можно также получить рекомбинантными средствами. Примеры фрагментов включают фрагменты Fab, Fab′, F(ab′)2, Fabc и/или Fv. Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к фрагменту полипептида иммуноглобулина или антитела, который связывает антиген или конкурирует за специфическое связывание антигена с интактным антителом, из которого он был получен.

Термины "гибридный белок, содержащий антитело" или "слитая конструкция, содержащая антитело" относится к рекомбинантному белку, который содержит целое антитело или его часть, присоединенные к по меньшей мере одному участку белка или полипептида, не являющемуся антителом. Присоединение (слияние) обычно осуществляют посредством генно-инженерных манипуляций с геном, кодирующим указанный белок. Дополнительные примеры гибридных белков, содержащих антитело, включают участок антитела, связывающий клеточный рецептор (включая область Fc), присоединенный к другому цельному растворимому или клеточному биологическому белку или его части, например к рецептору (клеточному или растворимому или его части, цитокину или его части ферменту или его части, и т.д). Такие гибридные антитела, содержащие антитело, которые содержат область Fc антитела, присоединенную к другому белку, называют также гибридными белками, содержащими Fc.

Термин "вещество, связывающее Fc," относится к молекуле, которая способна связывать область Fc антитела (например, антитела класса IgG), включая, без ограничения, белок комплемента, рецептор к Fc или белок бактериального происхождения, такой как Белок А или Белок G, которые обладают высокой аффинностью к области Fc антитела.

Термин "область Fc" относится к С-концевой области антитела класса IgG, в частности к С-концевой области тяжелой цепи (цепей) указанного антитела класса IgG. Хотя границы области Fc тяжелой цепи IgG могут слегка варьировать, область Fc обычно определяют как область, простирающуюся от приблизительно остатка аминокислоты Cys226 до карбоксильного конца тяжелой цепи (цепей) IgG.

Определения, связанные с хроматографией

Термин "исходная жидкость" в настоящем описании относится к жидкости, содержащей по меньшей мере одно целевое вещество, которое необходимо очистить от других веществ, также находящихся в данной жидкости. Исходная жидкость может представлять собой, например, водный раствор, систему органических растворителей или смесь водных/органических растворителей или растворов. Исходные жидкости часто являются сложными смесями или растворами, содержащими много биологических молекул (таких, как белки, антитела, гормоны и вирусы), низкомолекулярных молекул (таких, как соли, сахара, жиры, и т.д.) и даже твердые частицы. Хотя типичная исходная жидкость биологического происхождения может изначально представлять собой водный раствор или суспензию, она может также содержать органические растворители, которые применяли на предшествующих этапах выделения, таких как осаждение растворителя, экстракция и т.п. Примеры исходных жидкостей, которые могут содержать ценные биологические вещества, поддающиеся очистке различными вариантами реализации настоящего изобретения, включают, без ограничения, супернатант культуры из биореактора, суспензию гомогенизированных клеток, плазму, фракции плазмы и молоко.

Термин "целевое вещество" или "целевой белок" относится в настоящем описании к одному или более желательным белкам, содержащим область Fc, которые следует очистить от исходной жидкости. Целевое вещество может присутствовать в исходной жидкости в форме суспензии или раствора.

Термин "примеси" относится к материалам в исходной жидкости, которые отличаются от целевого вещества (веществ) и которые желательно исключить из конечного продукта, содержащего целевое вещество (вещества). Типичные примеси включают нуклеиновые кислоты, белки (включая молекулы, являющиеся вариантами прочтения интронов, вариантами с низкой молекулярной массой и вариантами с пониженным содержанием дисульфидных связей), пептиды, эндотоксины, вирусы и низкомолекулярные молекулы.

В настоящем описании термин "твердая фаза" относится к неводной матрице, с которой целевое вещество взаимодействует в процессе очистки или на которой может быть закреплено вещество, связывающее Fc. Подходящие материалы твердой фазы включают, без ограничения, стекло, кремний (например, силикагель), полисахариды (например, полисахаридная матрица), такие как агароза и целлюлоза, органические полимеры, такие как сополимеры полиакриламида, метилметакрилата и полистирол-дивинилбензола, такие как смола Amberlite™ (можно приобрести в Rohm & Haas Chemical Co., Филадельфия, Пенсильвания, США). Твердую фазу можно выбрать из любой группы смол, обычно относимых к аффинным, ионообменным и ионофиксирующим смолам. Твердая фаза может представлять собой, например, колонку для очистки, дисперсную фазу или дискретные частицы либо комбинацию перечисленного. Твердая фаза может быть пористой или не пористой, сжимаемой или несжимаемой. В различных вариантах реализации твердая фаза представляет собой полимерную матрицу либо частицы или гранулы из агарозы. В различных вариантах реализации твердая фаза может быть покрыта каким-либо реагентом (таким, как глицерин), например, для предотвращения неспецифического налипания примесей на твердую фазу. Единственное требование к твердой фазе: она должна обладать химическим свойством или обладать присоединенным лигандом, которые обеспечивают фиксацию вещества, связывающего Fc, на поверхности твердой фазы. Предпочтительные материалы для твердой фазы могут быть физически и химически приспособленными к условиям, применяемым в процессе очистки, включая работу насоса и проточную фильтрацию, а также к температуре, рН и другим характеристикам применяемых жидкостей.

"Аффинный лиганд" относится к элементу, который селективно или предпочтительно связывает компонент исходной жидкости посредством специфического взаимодействия с сайтом связывания указанного компонента. В настоящем изобретении аффинный лиганд (например, вещество, связывающее Fc) обычно иммобилизован на твердой фазе, например на смоле. Примеры аффинных лигандов, которые можно связать с подложкой (смолой), чтобы получить смолу для хроматографии, которую можно применять в способах согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, Белок А, Белок G и их аналоги, которые специфичным образом связывают область Fc белка. Способы связывания аффинных лигандов с материалами твердой подложки хорошо известны в области очистки. См., например, Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Editor), Irl Pr: 1997; и Affinity Chromatography, Herbert Schott, Marcel Dekker, New York: 1997.

Термин "смола для аффинной хроматографии" или "аффинная смола" относится к смоле для хроматографии, которая содержит твердую фазу или субстрат, на поверхности которых закреплен аффинный лиганд.

Термин "смола для ионообменной хроматографии" или "ионообменная смола" относится к твердой подложке, к которой ковалентно присоединен лиганд, несущий положительный или отрицательный заряд, и которая, следовательно, содержит свободные противоионы для обмена с ионами в растворе, с которым контактирует ионообменная смола.

Термин "катионообменные смолы" относится к ионообменной смоле, к которой ковалентно присоединены отрицательно заряженные лиганды и которая, следовательно, содержит свободные катионы для замены на катионы в растворе, с которым эта смола контактирует. В данной области известны разнообразные смолы, например смолы, в которых ковалентно связанные группы представляют собой карбоксилат или сульфонат. Коммерчески доступные смолы включают CMC-cellulose (карбоксиметилцеллюлоза), SP-Sephadex™ и Fast S-Sepharose™ (две последние можно приобрести в Pharmacia).

Термин "анионообменные смолы" относится к ионообменной смоле, к которой ковалентно присоединены положительно заряженные группы, такие как группы четвертичного амина. Коммерчески доступные анионообменные смолы включают DEAE cellulose (диэтиламиноэтилцеллюлоза), ТМАЕ (триметиламиноэтил), QAE Sephadex™ и Fast Q Sepharose™ (две последние можно приобрести в Pharmacia).

В настоящем описании термин "хаотропная соль" относится к соли, которая содержит один или более ионных компонентов, которые относятся к низшим членам лиотропного ряда и способны проникать в гидратную оболочку белка и связываться непосредственно с его поверхностью. Это нарушает гидратную ассоциацию, способствуя солюбилизации белка. Примеры хаотропных солей включают, без ограничения, соли элементов II группы с галогенами (например, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид бария, бромид кальция, бромид магния, бромид бария, йодид кальция, йодид магния, йодид бария).

Примеры подходящих солей бивалентных катионов включают, без ограничения, соли Mn²⁺, Ni²⁺ или Cu²⁺, Mg²⁺, Са²⁺ и Ва²⁺ с тиоцианатом (SCN^-), перхлоратом (ClO₄ ^-), нитратом (NO₃ ^-), хлором (Cl^-) и бромом (Br^-), а также их комбинации.

В некоторых вариантах реализации соли бивалентных катионов содержат бивалентный катион (например, Mg²⁺, Са²⁺, Ni²⁺ или Ba²⁺). Предпочтительными хаотропными солями для применения в предложенных процессах являются MgCl₂, NiCl₂ и CaCl₂. После этапа промывки солью бивалентного катиона целевой белок элюируют из матрицы для аффинной хроматографии.

"Буфер" представляет собой вещество, которое, присутствуя в растворе, увеличивает количество соли или щелочи, которое необходимо добавить, чтобы изменить значение рН на одну единицу. Буферный раствор противостоит изменениям рН благодаря действию входящих в него компонентов, представляющих собой конъюгат кислоты и основания. Буферные растворы для применения с биологическими компонентами обычно способны поддерживать постоянную концентрацию ионов водорода, что обеспечивает нахождение рН раствора в физиологических пределах. Термин "физиологический рН" относится к рН крови млекопитающих (т.е. 7,38 или приблизительно 7,4). Таким образом, физиологический диапазон рН составляет приблизительно от 7,2 до 7,6. Стандартные компоненты буфера включают, без ограничения, органические и неорганические соли, кислоты и основания. Примеры буферов для применения в очистке биологических молекул (например, молекул белка) включают буферы на основе цвиттер-ионов или «буферы Гуда», см., например, Good et al. (1966) Biochemistry 5:467 и Good and Izawa (1972) Methods Enzymol. 24:62. Примеры буферов включают, без ограничения, TES, MES, PIPES, HEPES, MOPS, MOPSO, TRICINE и BICINE.

Термин "уравновешивающий буфер" в настоящем описании относится к буферу, который применяют для подготовки реагента, связывающего Fc, твердой фазы или обоих к загрузке исходной жидкости, содержащей целевой белок. Уравновешивающий буфер предпочтительно является изотоническим и обычно имеет рН в диапазоне от приблизительно 6 до приблизительно 8. "Буфер за