Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение

Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биоорганической химии, а именно к новым производным гемина общей формулы I

где

R₁=OH,

R₂=-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH₂CH₂OH, где Х=Trp, или Phe, или

или

к способу синтеза этих соединений, композиции, в том числе фармацевтической, дезинфицирующей, антисептической композиции, средству для лечения и биомедицинскому применению новых и известных производных гемина формулы I в качестве антимикробных - антибактериальных и противогрибковых, а также вирулицидных агентов. Как известно, многие опасные заболевания человека вызываются бактериями. К ним относятся заболевания эпидемического характера, такие как холера, брюшной тиф, паратифы, чума, дифтерия, туляремия, бруцеллез, а также туберкулез, заражение крови (сепсис), проказа, сифилис и др. У животных бактерии вызывают сап, сибирскую язву, туберкулез и др. Борьба с болезнетворными бактериями основывается на применении дезинфецирующих и антисептических средств, бактериостатических и бактерицидных агентов. У бактерий быстро развивается резистентность по отношению к существующим антибактериальным средствам, главным образом к антибиотикам, поэтому проблема поиска новых нетоксичных, биосовместимых антибактериальных агентов, применение которых не приводило бы к резистентности, весьма актуальна [J.-Y.Maillard. Bacterial resistance to biocides in the healthcare environment: should it be of genuine concern // Journal of Hospital Infection, 2007, V.65(S2) p.60-72].

В последнее время особое внимание уделяется дизайну новых антимикробных агентов на основе антимикробных пептидов (АМП) [А.Giuliani, G.Pirri, S.F.Nicoletto. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics// Central European Journal of Biology, 2007, V.2(1), p.1-33]. Резистентность в отношении АМП у микроорганизмов развивается довольно редко [M.N.Melo, D.Dugourd, M.A.Castanho // Recent Patents Anti-Infect Drug Disc, 2006, V.1(2), p.201-207], по-видимому, вследствие того, что основным механизмом действия АМП является деструкция липидной мембраны бактерий, микроскопических грибов и вирусов [Н.Jenssen, P.H., and R.E.W. Hancock. Peptide Antimicrobial Agents // Clin. Microbiol. Rev., 2006, 19(3): 491-511]. В связи с этим антимикробные пептиды рассматриваются как перспективный класс новых антибиотиков [M.R.Yeaman, N.Y.Yount. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance // Pharmacol. Rev., 2003, 55(1) p.27-55, A.Giuliani, G.Pirri, S.F.Nicoletto. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics. // Central European Journal of Biology, 2007, V.2(1) p.1-33]. Антимикробные пептиды эндогенного происхождения являются частью наиболее древней системы защиты организмов от патогенов. Они обнаружены практически у всех живых организмов - от бактерий до человека [M.R.Yeaman, N.Y.Yount. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance // Pharmacol. Rev., 2003, V.55(1) p.27-55]. В процессе эволюции многоклеточные организмы умножали и развивали арсенал АМП, защищающих их от широкого спектра патогенов, в том числе грамположительных и грамотрицательных бактерий [M.R.Yeaman, N.Y.Yount. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance // Pharmacol. Rev., 2003, 55(1):27-55], ДНК и РНК-содержащих вирусов [A.Bastian, and H.Schafer. Human alpha-defensin 1 (HNP-1) inhibits adenoviral infection in vitro// Regul. Pept., 2001, V.101, p.157-161. Home, W.S., С.M.Wiethoff, С.Cui, et al. Antiviral cyclic D,L-alpha-peptidestargeting a general biochemical pathway in virus infections// Bioorg. Med. Chem., 2005, V.13, p.5145-5153], микроскопических грибов [De Lucca, A.J., and T.J.Walsh. Antifungal peptides: novel therapeutic compounds against emerging pathogens // Antimicrob. Agents Chemother., 1999, V.43, p.1-11] и простейших [J.Alberola,, A.Rodriguez, O.Francino, et al. Safety and efficacy of antimicrobial peptides against naturally acquired leishmaniasis // Antimicrob. Agents Chemother., 2004, V.48, p.641-643].

Антимикробные пептиды, как правило, являются амфифильными соединениями с ярко выраженными гидрофильной и гидрофобной частями. За редкими исключениями молекулы АМП содержат несколько остатков лизина и/или аргинина и при физиологических значениях рН несут большой положительный заряд. По структуре АМП можно разделить на две большие группы: циклические пептиды, как правило, содержащие цистеиновый мостик, и линейные пептиды [Н.Jenssen, P.Hamill, R.E.W. Hancock. Peptide Antimicrobial Agents// Clinical Microbiology Reveiws, 2006, Vol.19, No.3, p.491-511].

Понимание механизмов узнавания и деструкции мембран клеток патогенов антимикробными пептидами является необходимым условием для создания лекарств на их основе. Наиболее важным фактором селективности действия АМП на бактерии, грибы и вирусы при отсутствии их воздействия на эукариотические клетки является различие в составе и строении мембран [Н.Jenssen, P.Hamill, R.E.W. Hancock. Peptide Antimicrobial Agents// Clinical Microbiology Reveiws, 2006, Vol.19, No.3, p.491-511]. Внешняя поверхность эукариотической мембраны состоит из цвиттер-ионных фосфолипидов, в то время как мембраны бактериальных клеток содержат большое количество отрицательно заряженных фосфолипидов как на внутренней, так и на внешней поверхности липидного бислоя. Кислотный характер внешней стороны прокариотической мембраны обуславливает ее взаимодействие преимущественно с положительно заряженными АМП [M.R. Yeaman, N.Y.Yount. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance // Pharmacol. Rev.,2003, Vol.55, p.27-55]. Вторым фактором, обуславливающим селективность АМП, является отсутствие холестерина в мембранах бактериальных клеток. Вследствие этого липидный бислой бактериальных мембран более гибок, и образование пор антимикробными пептидами в нем происходит легче, чем в мембранах эукариотических клеток [Н.Jenssen, P.Hamill, R.E.W. Hancock. Peptide Antimicrobial Agents // Clinical Microbiology Reveiws, 2006, Vol.19, No.3, p.491-511. 3. О.Токе. Antimicrobial Peptides: New Candidates in the Fight Against Bacterial Infections // Biopolymers (Peptide Science), 2005, Vol.80, p.717-735]. При деструкции молекулами АМП мембраны бактерии последняя погибает вследствие утечки ионов и метаболитов, деполяризации мембраны, угнетения клеточного дыхания бактерий и синтеза в них биополимеров [M.R.Yeaman, N.Y.Yount. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance // Pharmacol. Rev., 2003, Vol.55, p.27-55]. По последним данным, гибель клеток под действием АМП может происходить и по другим причинам, например в результате взаимодействия антимикробных пептидов с внутриклеточными мишенями [J.-P.S.Powers, R.E.W. Hancock. The relationship between peptide structure and antibacterial activity // Peptides, 2003, V.24, p.1681-1691]. По схожим механизмам АМП воздействуют и на мембраны вирусов, приводя к их дезактивации [Н.Jenssen, P.Hamill, R.E.W. Hancock. Peptide Antimicrobial Agents// Clinical Microbiology Reveiws, 2006, Vol.19, No.3, p.491-511. 3].

Основными препятствиями к применению АМП в клинической практике являются их сравнительно высокая стоимость, чувствительность к действию протеолитических ферментов, а также присущий многим АМП гемолитический эффект [A.Giuliani, G.Pirri, S.F.Nicoletto. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics. // Central European Journal of Biology, 2007, V.2(1) 1-33]. Например, антимикробные пептиды грамицидин D и грамицидин S вызывают 100% гемолиз в концентрациях 5 мкМ [С.Н.Rammelkamp and L.Weinstein. Toxic Effects of Tyrothricin, Gramicidin, and Tyrocidine // Jour. Infect. Dis., 1942, V.71, №2, p.166-173] и 62,5 мкМ [G.M.Grotenbreg, M.D.Witte, P.A.V. van Hooft, et al. Synthesis and biological evaluation of gramicidin S dimers // Org. Biomol. Chem., 2005, V.3, p.233-238] соответственно. По-видимому, вследствие этого на рынке пока отсутствуют препараты на основе АМП, состоящие исключительно из аминокислот L-ряда. Большинство АМП отсеиваются на ранних стадиях клинических испытаний. И лишь некоторые препараты на основе АМП в настоящее время проходят завершающие этапы клинических испытаний, например, Омиганан (Omiganan) и соединение MX594AN. Действующее начало этих препаратов представляет собой синтетические аналоги антимикробного пептида индолицидина с измененной аминокислотной последовательностью. В ходе фазы III клинических испытаний в качестве препарата, понижающего колонизацию венозных катетеров микроорганизмами, вызывающими заболевания кровеносной системы в разных группах пациентов, омиганан продемонстрировал эффекты, не позволяющие сделать однозначный вывод о возможности его применения в клинической практике [Y.J.Gordon, A.M.McDermott. A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs // Curr Eye Res., 2005, V.30(7), p.505-515]. Соединение MX594AN прошло клинические испытания фазы IIb, и в настоящее время проходит клинические испытания фазы III в качестве средства для лечения угревой сыпи [Обзор по АМП - Гордон]. Кроме того, несколько препаратов на основе АМП находятся на более ранних стадиях клинических испытаний [Y.J. Gordon, A.M. McDermott. A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs // Curr Eye Res., 2005, V.30(7), p.505-515. A.Giuliani, G.Pirri, S.F.Nicoletto. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics. // Central European Journal of Biology, 2007, V.2(1) 1-33].

В настоящее время антимикробные пептиды и их аналоги получают в основном твердофазным синтезом, что делает эти вещества чрезвычайно дорогостоящими, а их применение экономически нецелесообразным.

В последнее время все большее внимание уделяется другим стратегиям дизайна модифицированных АМП [D.Knappe, A.Nimptsch, A.Jr. Kolobov, et al. Chemical modifications of short antimicrobial peptides from insects and vertebrates to fight multi-drug resistant bacteria // Adv. Exp. Med. Biol., 2009, V.611, p.395-396], лишенных перечисленных выше недостатков. Основными стратегиями оптимизации структуры АМН с целью получения новых биоцидных агентов являются следующие.

- Синтез циклических аналогов АМП. В ряде случаев [A.Wessolowski, М.Bienert and M.Dathe. Antimicrobial activity of arginine-and tryptophan-rich hexapeptides: the effects of aromatic clusters, D-amino acid substitution and cyclization. J. Pept. Res., 2004, V.64, p.159-169. M.Dathe, H.Nikolenko, J.Klose, et al. Cyclization Increases the Antimicrobial Activity and Selectivity of Arginine- and Tryptophan-Containing Hexapeptides // Biochemistry, 2004, V.43(28), p.9140-9150] циклизация АМП приводит к увеличению антибактериальной активности и повышению устойчивости к протеиназам [A.Rozek, J-P.S.Powers, C.L.Friedrich, et al. Structure-Based Design of an Indolicidin Peptide Analogue with Increased Protease Stability // Biochemistry, 2003, V.42 (48), p.14130-14138], однако при этом может значительно (в 4 раза) возрастать гемолитический эффект [A.Wessolowski, M.Bienert and M.Dathe. Antimicrobial activity of arginine-and tryptophan-rich hexapeptides: the effects of aromatic clusters, D-amino acid substitution and cyclization // J. Pept. Res., 2004, V.64, p.159-169]. Кроме того, циклизация приводит к заметному повышению себестоимости продукта.

- Введение в молекулу АМП атома фтора или трифторметильной группы. Этот подход приводит к снижению МБК (минимальной бактерицидной концентрации) антимикробных пептидов, однако при этом увеличивается время воздействия на микроорганизм, необходимое для проявления бактерицидного действия [D.Gimenez, С.Andreu, M. del Olmo, et al. The introduction of fluorine atoms or trifluoromethyl groups in short cationic peptides enhances their antimicrobial activity // Bioorg. Med. Chem., 2006, V.14, p.6971-6978].

- Иммобилизация АМП на различных полимерных матрицах [М.Bagheri, М.Beyermann, M.Dathe. Immobilization reduces the activity of surface-bound cationic antimicrobial peptides with no influence upon the activity spectrum // Antimicrob Agents Chemother., 2009, V.53(3), p.1132-41]. Этот сравнительно новый подход пока не привел к успешным результатам, т.к. активность иммобилизованных на полимерах пептидов оказалась существенно ниже, чем у свободных АМП. Кроме того, авторами [М.Bagheri, M.Beyermann, M.Dathe. Immobilization reduces the activity of surface-bound cationic antimicrobial peptides with no influence upon the activity spectrun // Antimicrob Agents Chemother., 2009, V.53(3), p.1132-41] не установлено, какое влияние оказывает иммобилизация на гемолитический эффект пептидов.

Таким образом, химическая модификация антимикробных пептидов является перспективным путем получения новых, более эффективных антимикробных агентов без побочных эффектов с антибактериальным, противогрибковым и вирулицидным действием. При этом остается актуальным поиск новых подходов к модификации АМП, позволяющих повысить возможности их практического применения.

Известны антимикробные пептиды - линейный грамицидин D (II),

представляющий собой смесь пептидов формулы:

Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-TrpNHCH₂CH₂OH, где X=Trp, Tyr, Phe

[W.E.Herrelland D.Heilman. Experimental and Clinical Studies on Gramicidin // J.Clin. Invest., 1941, V.20, 583-591. Annual Reports on NMR Spectroscopy, Volume 60, p 215 London, Academic Press, 2007], циклический грамицидин S (III) [G.Nagamurthi and S.Rambhav. Gramicidin-S: Structure-activity relationship // J.Biosci., 1985, V.7, №3-4, p.323-329], содержащие D-аминокислоты, непротеиногенные аминокислоты (Orn). Соединение II эффективно против грамположительных бактерий [W.E.Herrell and D.Heilman. Experimental and Clinical Studies on Gramicidin // J. Clin. Invest., 1941, V.20, №583] и некоторых вирусов, в частности герпеса [US Patent 6001808, 1999]. Соединение III эффективно главным образом против грамположительных бактерий в концентрациях 5-15 мкМ [Jingbo Xiao, Bernard Weisblum, and Peter Wipf. Electrostatic versus Steric Effects in Peptidomimicry: Synthesis and Secondary Structure Analysis of Gramicidin S Analogues with (E)-Alkene Peptide Isosteres //J. Am. Chem. Soc, 2005, 127 (16), рр 5742-5743]. Соединения II и III используются в медицинской практике только для наружного применения [М.Д.Машковский. Лекарственные средства, 15 изд. Москва, изд-во «Новая волна», 2005, с.822. J.R.Gibson. Trimethoprin-polymyxin В ophthalmic solution in the treatment of presumptive bacterial conjunctivitis-A multicentre trial of its efficacy versus neomycin-polymyxin B-gramicidin and chloramphenicol ophthalmic solutions // J.Antimicrob. Chemother., 1983, V.11, p.217-221]. Недостатками этих антимикробных препаратов являются относительно большая длина этих пептидов и соответственно сравнительно высокая стоимость, недостаточная широта антибактериального, противогрибкового и вирулицидного действия (активность лишь в отношении грамположительных бактерий и вируса герпеса). Но главными их недостатками являются побочные эффекты при применении, в основном гемолиз эритроцитов и аллергические реакции [Heilman, D., and Herrell, W.E.: "Hemolytic Effect of Gramicidin," Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., 46: 182 (Jan.) 1941. М.Д.Машковский. Лекарственные средства, 15 изд. Москва, изд-во «Новая волна», 2005, с.822].

Известный пептид в настоящее время исследуется в различных направлениях. В частности, он представляет интерес для создания средств для лечения инфекционных заболеваний [A.J.Kastin. Handbook of biologically active peptides // Elsevier, Academic Press, USA, 2006, p.576]. Пептид IV является фрагментом антимикробных пептидов семейства цекропинов, многих микробных белков и фибронектина поверхности клеток млекопитающих [M.Naito, N.Ohara, S.Matsumoto, T.Yamada. The novel fibronectin binding motif and key residues of micobacteria //J. Biol. Chem., 1998, V.273, p.2905-9].

Известно, что гемин обладает антимикробной активностью, в частности, в отношении золотистого стафилококка. Авторами [Y.Nitzan, H.Ladan, S.Gozansky, Z.Malik. Characterization of hemin antibacterial action on Staphylococcus aureus // FEMS Microbiol. Lett. V.48(3), p.401-406] было показано, что гемин в концентрации 20·10^-5 М оказывает сильное, не зависящее от света воздействие на S.aureus, в то время как другие металлопорфирины не проявляли антибактериального эффекта в темноте. Заметное воздействие гемина на инактивацию S.aureus проявилось в немедленной индукции потоков ионов, что было определено рентгеновским микроанализом быстрозамороженных клеток. Авторы [Y.Nitzan, H.Ladan, S.Gozansky, Z.Malik. Characterization of hemin antibacterial action on Staphylococcus aureus // FEMS Microbiol. Lett. V.48(3), p.401-406] полагают, что такое выраженное антибактериальное действие гемина обусловлено тем, что в S.aureus находится множество клеточных мишеней для окислительного воздействия гемина. Однако использование гемина в качестве антибактериального средства затруднено вследствие его нерастворимости в воде, гемолитической активности, а также кратковременности антибактериального эффекта.

Для некоторых пептидных производных гемина общей формулы I, a именно при R₁=OH или установлена нуклеазная (нуклеолитическая) активность, проявляющаяся в способности разрушать плазмидную ДНК [Желтухина Г.А., Небольсин В.Е., Лобанова Т.Н // Патент РФ №2250906; Желтухина Г.А., Лобанова Т.Н., Небольсин В.Е., М.О.Галлямов, Драницына С.М., Костанян И.А. // Биоорган, химия. 2006. Т.32, №2, С.198-210]. Отдельные аминокислотные и пептидные производные гемина общей формулы I, а именно при R₁=OH, или способны ингибировать протеиназу ВИЧ и оказывать вследствие этого противовирусное анти-ВИЧ действие [Р.П.Евстигнеева, Г.А.Желтухина, Т.В.Зарубина, В.Е.Небольсин, Д.Н.Носик, Н.Н.Носик // Патент РФ №2238950].

Показано, что некоторые известные производные гемина общей формулы I, а именно обладают вирулицидной активностью [заявка на изобретение RU 2007125604/04(027891)], однако антибактериальная, антигрибковая активности для них не были известны.

Композиции для предотвращения бактериальных и грибковых инфекций, включающие конъюгаты гемина с аминокислотами, пептидами и пептидомиметиками, неизвестны.

Нами предложено провести конъюгацию двух природных соединений (гемина и антимикробного пептида), обладающих антимикробной активностью с различным механизмом действия с целью повышения эффективности действия, снижения токсичности и приобретения новых полезных свойств, в частности водорастворимости и устойчивости к протеолизу.

Задачей настоящего изобретения является создание новых биосовместимых мембраноактивных конъюгатов гемина с АМП общей формулы I, и их фармацевтически приемлемых солей, обладающих деструктирующим действием по отношению к липидной мембране, эффективных против бактерий, микроскопических грибов и вирусов, при этом нетоксичных, без гемолитической активности и без побочных эффектов; создание на их основе противоинфекционного лекарственного средства, обладающего антибактериальной, противогрибковой и вирулицидной активностью; композиций, в том числе фармацевтических, дезинфецирующих и антисептических, а также способов, позволяющих получать заявленные соединения с достаточными выходами и чистотой.

Еще одной задачей настоящего изобретения является способ синтеза соединения включающий получение входящего в его состав трипептида с более высоким выходом, по более простой и экономически целесообразной методике. Известен [Patent GB 2207922А. Tripeptides with pharmacological properties. В.Brunetti, M.Prada, 1989] способ синтеза пептида IV по схеме [1+2] с использованием дикарбобензокси-аргинина и дибензилового эфира аспарагиновой кислоты. Недостатком метода является применение в качестве исходного реагента указанного производного аргинина. Известно, что в таком производном гуанидиновая группа защищена недостаточно, что может приводить к образованию побочных продуктов в синтезах с его использованием [Дж.Гринштейн, М.Виниц. Химия аминокислот и пептидов // М: Мир, 1966, с.558]. Выход целевого трипептида IV, полученного этим способом, был достаточно низким и составил 21%, считая на исходный реагент.Известен другой способ синтеза этого трипептида в растворе [М.Abo-Ghalia, S.Abd El-Rahman, A.El-Kafrawy, and A.Kalomuch. Optimized conventional synthesis of "RGD" and "RGDS" peptides and their sarcosine mimics as integrin GP IIb/IIIa antagonists // Amino Acids, 2003, V.24, p.405-411] по схеме [2+1] с использованием исходных реагентов H-Gly-OEt, Z-Arg(NO₂)-OH и Н-Asp(OBzl)-OBzl. Данный подход позволил повысить суммарный выход целевого пептида до 41%. В то же время, существенным недостатком этого метода является использование производного аргинина, известного неполным блокированием гуанидиновой функции аргинина нитрогруппой. Кроме того, известно, что отщепление гидрогенолизом N^G-нитрогруппы не всегда бывает удовлетворительным [Дж.Гринштейн, М.Виниц. Химия аминокислот и пептидов // М: Мир, 1966, с.555]. Предусмотренное в данной схеме синтеза омыление Z-Arg(NO₂)-GlyOEt представляет собой нежелательное жесткое воздействие на дипептид, которое может приводить к рацемизации и частичной деструкции пептидной связи. Применение переносного гидрирования в присутствии палладиевой черни по данному способу удлиняет и удорожает стадию конечного деблокирования целевого трипептида IV.

Поставленная задача решается новыми соединениями общей формулы I, где R₁=OH,

R₂=-Val-Gly-Ala-(D-Leu)-Ala-(D-Val)-Val-(D-Val)-Trp-(D-Leu)-X-(D-Leu)-Trp-(D-Leu)-Trp-NHCH₂CH₂OH, где Х=Trp, или Phe, или

или

и/или их фармацевтически приемлемыми солями, обладающими способностью деструктировать липидную мембрану;

- средством, обладающим антибактериальной активностью, в том числе против резистентных бактерий, противогрибковой и вирулицидной активностью, представляющим собой новое соединение общей формулы I;

- средством, обладающим антибактериальной активностью, в том числе против резистентных бактерий, и противогрибковой активностью, представляющим собой известное соединение общей формулы I;

- фармацевтической, дезинфицирующей и антисептической композицией, включающей соединения общей формулы I для профилактики и/или лечения у человека и животных различных заболеваний, вызванных бактериями, в том числе резистентными, микроскопическими грибами или вирусами с использованием их антибактериальных, противогрибковых и вирулицидных свойств и содержащей одно или несколько из соединений общей формулы I в эффективном количестве;

- способами синтеза новых производных гемина общей формулы I или их фармацевтически приемлемых солей, включающими ацилирование аминогруппы аминокомпонентов бис-N-оксисукцинимидным эфиром гемина, или включающими ацилирование α-аминогруппы пептида 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидным эфиром гемина, или включающими ацилирование аминогруппы пептида активированным по одной карбоксильной группе производным гемина, причем в качестве активирующего агента используют ди-трет-бутилпирокарбонат в присутствии пиридина;

- способом получения конъюгата гемина с Arg-Gly-Asp, включающим синтез трипептида Arg-Gly-Asp. В соответствии с настоящим изобретением, способ синтеза Arg-Gly-Asp в растворе включает получение дипептида Z₃Arg-Gly-ОН методом смешанных ангидридов с использованием силилированного производного глицина с последующим присоединением к упомянутому дипептиду H-Asp(OtBu)₂ также методом смешанных ангидридов; далее деблокирование защищенного трипептида проводится в 2 стадии - сначала трет-бутильных защит - действием трифторуксусной кислоты, с последующим отщеплением Z-групп гидрогенолизом над 10÷20% палладием на угле. Предложенный способ позволяет повысить выход целевого продукта - трипептида до 57%, упростить процесс, в частности исключить стадию жесткого воздействия - омыления дипептида, уменьшить время гидрогенолиза и сделать процесс более экономически целесообразным в результате замены палладиевой черни на 10÷20% палладий на угле.

Список сокращений

DCC - N,N′-дициклогексилкарбодиимид

DMSO - диметилсульфоксид

DOPC - диолеоилфосфатидилхолин

GrD - грамицидин D

НА - гистамин

Hem - остаток гемина

МеОН - метиловый спирт

MES - 2-(N-морфолино)этансульфокислота

МН - среда Mueller-Hilton

ОМе - метиловый эфир

ONb - N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидный эфир

O^tBu - трет-бутиловый эфир

Z - карбобензоксигруппа

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФА-N,N′ - диметилформамид

ИК - инфракрасная спектроскопия

ИР - ингибирование роста

КФ - карбоксифлуоресцеин

МБК - минимальная бактерицидная концентрация

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

ОФ-ВЭЖХ - обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография

Tris - трис-(гидроксиметил)аминометан

ТСХ - хроматография в тонком слое

ХЛФ - хлороформ

ЭА -этилацетат

Следующие примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.

В работе использовались аминокислоты и их производные L-ряда фирмы «Bachem» (Германия), «Reanal» (Венгрия), DOPC (Sigma-Aldrich), карбоксифлуоресцеин (Fluka, Германия), MES (Sigma-Aldrich), Tris (Sigma-Aldrich), грамицидин D (Sigma-Aldrich), грамицидин S (Красфарма, Россия) хлорид калия ч.д.а. (Химмед, Россия)

Все растворители безводные, за исключением тех, которые использовались для экстракции из водных растворов. Индивидуальность полученных соединений проверяли методом ТСХ на пластинах Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия) в системах: хлороформ - метанол 9:1 (1), хлороформ -метанол 8:2 (2), хлороформ - метанол 5:3 (3), хлороформ - метанол - уксусная кислота 5:3:1 (4), метанол - уксусная кислота - вода 4:1:1 (5), бутанол - уксусная кислота - вода 4:1:1 (6). Хроматограммы проявляли хлортолидиновым реактивом, нингидрином, по свечению в УФ-свете.

Масс-спектры высокого разрешения получали на время-пролетном масс-спектрометре «Ultraflex» («Bruker», Германия) методом матриксной лазерно-десорбционной ионизации (TOF MALDI), в качестве матрицы использовалась 2,5-дигидроксибензойная кислота.

ИК-спектры регистрировали на Фурье-спектрометре: «Magna 750» («Nicolet», США).

Электронные спектры снимали на спектрофотометре «Jasco» модель UV/VS 7800 (Япония).

ОФ-ВЭЖХ проводили на приборе Gilson 305 (Gilson, Франция).

Препаративную ОФ-ВЭЖХ проводили на колонке Luna 10 µ, обращенная фаза С5, размеры 250×21.2 мм, (Phenomenex, США) в следующих условиях.

Изократическая элюция 0.1% раствором TFA в воде, скорость потока 4 мл/мин. Поглощение регистрировали при длине волны 220 нм (7).

Динамику выхода КФ из липосом контролировали на флуориметре Сагу Eclipse (Varian, США).

Липосомы получали с помощью мини-экструдера Avanti (Avanti Polar Lipids, США)

Пример 1

6,7-бис-(метиловый эфир N^α-глицил)-протогемина (IX) (XV)

К суспензии 0.030 г (0.236 ммоль) H-GlyOMe·HCl в 1.5 мл DMF прибавляли 0.033 мл (0.236 ммоль) Et₃N и перемешивали при комнатной температуре 3 мин. К полученному раствору прибавляли раствор 0.100 г (0.118 ммоль) 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 5 мл DMF и перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (1) и (2). Раствор концентрировали в вакууме до 0.5 мл и прибавляли 6 мл диэтилового эфира. Полученный остаток растворяли в ХЛФ, при этом наблюдалось выпадение белых кристаллов Et₃N·HCl, от которых избавлялись декантацией раствора. Растворитель удаляли в вакууме. Для введения противоиона Cl^- остаток растворяли в 15 мл смеси ХЛФ-МеОН (8:2), два раза встряхивали с 7.5 мл 0.5 N раствора соляной кислоты и промывали водой до нейтральной реакции. Растворитель удаляли в вакууме. Вещество очищали на колонке (20×2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН (8:2). Фракцию, содержащую вещество с Rf 0.71 (2), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0.063 г (67%), Rf 0.26 (1), 0.71 (2). Электронный спектр, λ_max, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε·10^-3): 400 (115.9), 508 (9.38), 640 (3.81). ИК-Фурье спектр, ν, см^-1, таблетка KBr: 1737 (СО сл.эф.), 1648 (амид I), 1539 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 758.5.

Пример 2

6,7-бис-гистаминил протогемин (IX) (XIX)

К раствору 0.026 г (0.236 ммоль) гистамина в 1.5 мл DMF прибавляли раствор 0.100 г (0.118 ммоль) 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 4 мл DMF и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (2) и (3). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона Cl^- остаток растворяли в 4 мл МеОН и прибавляли 0.093 мл (0.354 ммоль) 3.8N HCl/МеОН до достижения рН 4. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Вещество очищали на колонке (31×2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН (5:3). Фракцию, содержащую вещество с Rf 0.64 (3), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0.049 г (51%), Rf 0.25 (2), 0.64 (3). Электронный спектр, λ_max, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε·10^-3): 388 (49.1), 508 (4.18), 640 (1.76). ИК-Фурье спектр, ν, см^-1, таблетка KBr: 1644 (амид I), 1543 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 802.3.

Пример 3

6,7-бис-[(бис-метиловый эфир N^α-L-аргинил)-L-глутамил]-протогемина IX (XVIII)

1. Бис-(метиловый эфир N^α-аргинил)-L-глутаминовой кислоты

К суспензии 0.069 г (0.266 ммоль) H-ArgOMe·2 HCl в 2 мл DMF прибавляли 0.074 мл (0.531 ммоль) Et₃N и перемешивали при комнатной температуре 5 мин. К полученному раствору прибавляли 0.077 г (0.133 ммоль) бис-пентафторфенилового эфира Вос-глутаминовой кислоты, полученного ранее, и перемешивали 4 часа при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (5). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Маслообразный осадок отделяли от растворителя декантированием, остатки растворителя удаляли в вакууме. Вещество очищали на колонке (23×1 см) с силикагелем Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), элюировали смесью метанол - уксусная кислота - вода 4:0.5:0.5. Фракцию, содержащую вещество с Rf 0.67 (5), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0.073 г (77%), Rf 0.67 (5). [α]_D ²⁵ - 8.53° (С 0.38; МеОН). ИК-Фурье спектр, ν, см^-1, таблетка KBr: 1735 (СО сл.эф.), 1653 (амид I), 1542, 1558 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 588.31.

К 0.073 г (0.0946 ммоль) бис-(метилового эфира N^α-аргинил)-Boc-L-глутаминовой кислоты (V) приливали 6 мл ~ 3 н. HCl/MeOH. Полученную суспензию перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Контроль процесса осуществляли ТСХ в условиях (6). После достижения полной конверсии в аминосвободный дипептид растворитель удаляли в вакууме при 30°С. Маслообразный остаток кристаллизовали под безводным диэтиловым эфиром, растворитель отделяли декантацией.

2. 6,7-бис-[(бис-метиловый эфир N^α-L-аргинил)-L-глутамил]-протогемина IX (XVIII)

К суспензии полученного H-Glu(ArgOMe)₂-3 HCl в 1.5 мл DMF прибавляли 0.047 мл (0.335 ммоль) Et₃N и перемешивали при комнатной температуре 2 мин. Наблюдали выпадение осадка Et₃N·HCl. К полученной суспензии прибавляли раствор 0.047 г (0.0558 ммоль) 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 2 мл DMF и перемешивали 22 часа при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли ТСХ в условиях (6). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона Cl^- остаток растворяли в 4 мл МеОН и прибавляли 3.8 N HCl/МеОН до достижения рН 4. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Вещество трижды очищали на колонке (13×1 см) с сефадексом LH-20, элюировали МеОН. Фракцию, содержащую вещество с Rf 0.07 (6), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0.030 г (34%). Rf 0.07 (6), Rf_{(на окиси алюминия)} 0.70 (6). Электронный спектр, λ_max, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε·10^-3): 400 (92.2), 508 (6.31), 636 (2.39). ИК-Фурье спектр, ν, см^-1, таблетка KBr: 1737 (СО сл.эф.), 1649 (амид I), 1528 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 1554.97.

Пример 4

6,7-бис-N-(2-гидроксиэтил)амид-протогемина (IX) (XIV)

К раствору 0.050 г (0.0591 ммоль) 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 3 мл DMF прибавляли 0.010 мл (0.118 ммоль) аминоэтанола и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (2) и (3). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона Cl^- остаток растворяли в 3 мл МеОН и прибавляли 3.8 N HCl/МеОН до достижения рН 4. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Вещество очищали на колонке (24×1 см) с силикагелем Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН (5:3). Фракцию, содержащую вещество с Rf 0.52 (3), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0.036 г (82.5%), Rf 0.35 (2), 0.52 (3). Электронный спектр, λ_max, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε·10^-3): 400 (183.0), 508 (5.23), 640 (2.08). ИК-Фурье спектр, ν, см^-1, таблетка KBr: 1632 (амид I), 1549 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 702.5.

Пример 5

6,7-бис-N-(1,3-дигидроксипропан-2-ил)амид протогемина (IX) (XVI)

К раствору 0.050 г (0.0591 ммоль) 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 3 мл DMF прибавляли раствор 0.012 г (0.118 ммоль) 2-амино-1,3-пропандиола в 0.5 мл DMF и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (4). Раствор концентрировали в вакууме до 0.5 мл и прибавляли 6 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона Cl^- остаток растворяли в 9 мл смеси ХЛФ-МеОН (8:2), один раз встряхивали с 4 мл 0.06 N раствора соляной кислоты, насыщенного NaCl, и промывали водой до нейтральной реакции. Растворитель удаляли в вакууме. Вещество очищали на колонке (21×2 см) с сефадексом LH-20, элюировали МеОН. Фракцию, содержащую вещество с Rf 0.56 (4), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0.018 г (36%), Rf 0.56 (4). Электронный спектр, λ_max, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε·10^-3): 400 (40.5), 508 (2.68), 640 (1.02). ИК-Фурье спектр, ν, см^-1, таблетка KBr: 1629 (амид I), 1550 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 762.0.

Пример 6

6,7-бис-N-(2,3-дигидроксипропил)амид протогемин (IX) (XVII)

К раствору 0.050 г (0.0591 ммоль) 6,7-бис-N-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 3 мл DMF прибавляли 0.009 мл (0.118 ммоль) 3-амино-1,2-пропандиола и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (3) и (4). Раствор концентрировали в вакууме до 0.5 мл и прибавляли 6 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона Cl^- остаток растворяли в 3 мл МеОН и прибавляли 3.8 N HCl/МеОН до достижения рН 4. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Вещество очищали на колонке (30×2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН:АсОН (5:3:0.5). Фракцию, содержащую вещество с Rf 0.69 (4), собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0.023 г (46%), Rf 0.33 (3), 0.69 (4). Электронный спектр, λ_max, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (ε·10^-3): 396-400 (24.2), 488 (2.14), 600 (1.40). ИК-Фурье спектр, ν, см^-1, таблетка KBr: 1634 (амид I), 1565 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 762.0.

Пример 7

6(7)-Монометиловый эфир протогемина (IX) (XX)

К раствору 50 мг (0.077 ммоль) гемина в 0.5 мл ДМФА прибавляли 100 мкл пиридина и 17 мг (0.077 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната и перемешивали 30 мин. К полученному смешанному ангидриду добавляли 2,5 мкл (0.077 ммоль) безводного метанола и перемешивали 6 часов. Растворитель удаляли в вакууме при 30°С. Остаток растворяли в хлороформе. Вещество очищали флэш-хроматографией на колонке (10×2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН 9:1. Выход 36 мг (65%). Электронный спектр, λ_max, нм, хлороформ, (ε·10^-3): 387 (130), 511 (2.6) 540 (2.4), 640 (0.11). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 666.0.

Пример 8

6,7-Диметиловый эфир протогемина (IX) (XXI)

К раствору 50 мг (0.077 ммоль) гемина в 0.5 мл ДМФА прибавляли 100 мкл пиридина и 92 мг (0.420 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната и перемешивали 30 мин. К полученному смешанному ангидриду добавляли 10 мкл (0.308 ммоль) безводного метанола и перемешивали 6 часов. Растворитель удаляли в вакууме при 30°С. Остаток растворяли в хлороформе. Вещество очищали флэш-хроматографией на колонке (10×2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН 9:1. Выход 31 мг (60%). Электронный спектр, λ_max, нм, хлороформ, (ε·10^-3): 387 (125), 538 (1.74), 640 (0.74). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 680.0.

Пример 9

6(7)-моно-(-Val-Gly-Ala-D-Leu-Ala-D-Val-Val-D-Val-Trp-D-Leu-X-D-Leu-Trp-D-Leu-Trp-NH-CH₂CH₂OH)амид протогемина (IX) (XII),

где Х=Trp, Tyr, Phe

К раствору 32 мг (0.017 ммоль) грамицидина D в 0.650 мл сухого ДМФА прибавляли 48 мкл 1 н. HCl в метаноле. Реакционную смесь перемешивали 72 ч в темноте при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме при 30°С. Выход 30 мг (98%). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 1854.0

К раствору 30 мг (0.016 ммоль) деформилированного грамицидина D в 0.2 мл ДМФА прибавляли 13.2 мг (0.016 ммоль) 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира гемина и перемешивали 1,5 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме при 30°С. Остаток растворяли в хлороформе. Остаток очищали на колонке (30×2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F₂54 (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН 9:1. Выход 23.5 мг (59%). ИК-Фурье спектр, ν, см^-1, таблетка KBr: 1634 (амид I), 1565 (амид II). Rf 0.65 (1)

Пример 10

6(7)-моно-[цикло-(Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)₂])амид протогемин (IX) (XIII)

К раствору 50 мг (0.077 ммоль) гемина в 0.5 мл сухого ДМФА прибавляли 1 мл пиридина и 25,3 мг (0.116 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната и перемешивали 15 мин при комнатной температуре. Одновременно к суспензии 93.5 мг (0.077 ммоль) дигидрохлорида грамицидина S в 0.5 мл ДМФА прибавляли 22 мкл (0,154 ммоль) триэтиламина и перемешивали 2 мин.

К полученному смешанному ангидриду гемина прибавляли раствор аминосвободного грамицидина S и перемешивали 3 ч. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Остаток растворяли в хлороформе. Остаток очищали на колонке (30×2 см) с силикагелем Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Германия), элюировали смесью ХЛФ-МеОН 12:1. Выход 20 мг (15%). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 1739.5. Электронный спектр, λ_max, нм, хлороформ:метанол (4:1), (ε·10^-3): 400 (105), 492 (10,6), 640 (6).

Пример 11

Arg-Gly-AspCH₃COOHCF₃COOH (IV)

а) синтез трикарбобензокси-аргинин-глицина

Смесь 0.043 г (0.573 ммоль) глицина, 0.4 мл (1.6 ммоль) бис-(O,N-триметилсилил)ацетамида и 1 мл сухого хлористого метилена интенсивно перемешивали в плотно