Антитела против dll4 и способы их применения

Антитела против dll4 и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

В общих чертах, настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Более конкретно настоящее изобретение относится к анти-DLL4-антителам и к их применению.

Предшествующий уровень техники

Обеспечение кровоснабжения является основной потребностью для многих физиологических и патологических процессов. Для активного роста тканей, таких как эмбрионы и опухоли, необходимо адекватное кровоснабжение. Такое кровоснабжение обеспечивается благодаря продуцированию проангиогенных факторов, стимулирующих образование новых кровеносных сосудов в процессе, называемом ангиогенезом. Образование сосудов является сложным, но планомерным биологическим процессом, включающим в себя все или многие из следующих стадий: a) пролиферацию эндотелиальных клеток (EC) из существующих EC или их дифференцировку из клеток-предшественников; b) миграцию и коалесценцию EC с образованием канатико-подобных структур; c) тубулогенез сосудистых канатиков с образованием сосудов, имеющих центральный просвет; d) разрастание существующих канатиков или сосудов с образованием вторичных сосудов; e) последующее ремоделирование и образование новых форм из первичного сосудистого сплетения; и f) рекрутинг периэндотельальных клеток в эндотелиальные сосуды, что сообщает этим сосудам поддерживающие и модуляторные функции, где указанными клетками являются перициты для небольших капилляров, клетки гладких мышц для более крупных сосудов и клетки миокарда в сердце. Hanahan, Science 277:48-50 (1997); Hogan & Kolodziej, Nat. Rev. Genet. 3:513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112:19-28 (2003).

В настоящее время хорошо известно, что ангиогенез участвует в патогенезе различных заболеваний. Такими заболеваниями являются солидные опухоли и метастазы, атеросклероз, ретролентальная фиброплазия, гемангиомы, хроническое воспаление, внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как пролиферативные ретинопатии, например диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), неоваскулярная глаукома, иммунное отторжение имплантированной ткани роговицы и других тканей, ревматоидный артрит и псориаз. Folkman et al., J. Biol. Chem. 267:10931-34 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); и Garner A., “Vascular diseases,” In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp.1625-1710.

В случае роста опухоли ангиогенез, очевидно, играет решающую роль в переходе от гиперплазии к неоплазии и в обеспечении поступления питательных элементов, необходимых для роста опухолей и образования метастазов. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). Неоваскуляризация способствует преимущественному росту опухолевых клеток и приобретению ими пролиферативной автономии по сравнению с нормальными клетками. Развитие опухоли обычно начинается с одной аберрантной клетки, которая может пролиферироваться только до размера в несколько кубических миллиметров, что обусловлено определенным расстоянием от доступного капиллярного ложа, и такая клетка может оставаться «спящей», то есть она может не подвергаться дальнейшему росту и диссеминированию в течение длительного периода. Затем некоторые опухолевые клетки приобретают ангиогенный фенотип с активацией эндотелиальных клеток, которые после пролиферации и созревания образуют новые капиллярные кровеносные сосуды. Эти новообразованные сосуды не только способствуют продолжению роста первичной опухоли, но также диссеминированию и реколонизации метастатических опухолевых клеток. В соответствии с этим наблюдается корреляция между плотностью микрососудов в опухолевых срезах и выживаемостью пациентов, страдающих раком молочной железы и некоторыми другими опухолями. Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-24 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-46 (1992). Точные механизмы, регулирующие переключение ангиогенеза, пока еще не установлены, хотя и вероятно, что неоваскуляризация опухолевой массы является результатом общего соотношения множества стимуляторов и ингибиторов ангиогенеза (Folkman, Nat. Med. 1(1):27-31 (1995)).

Процесс развития сосудов строго регулируется. В настоящее время уже известно, что большое число молекул, главным образом секретируемых факторов, продуцируемых окружающими клетками, регулируют дифференцировку, пролиферацию, миграцию и коалесценцию ЕС с образованием канатико-подобных структур. Так, например, васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF) был идентифицирован как ключевой фактор, участвующий в стимуляции ангиогенеза и в индуцировании проницаемости сосудов. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). Обнаружение того факта, что потеря даже одного аллеля VEGF приводит к гибели эмбриона, указывает на незаменимую роль, которую играет этот фактор в развитии и дифференцировке сосудистой системы. Кроме того, было показано, что VEGF является ключевым медиатором неоваскуляризации, ассоциированной с развитием опухолевых и внутриглазных заболеваний. Ferrara et al., Endocr. Rev. см. выше. мРНК VEGF сверхэкспрессируется большинством исследуемых человеческих опухолей. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-59 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-35 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-34 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-39 (1995).

Кроме того, уровни концентрации VEGF во внутриглазной жидкости в значительной степени коррелируют с активной пролиферацией кровеносных сосудов у пациентов с диабетической ретинопатией и другой ассоциированной с ишемией ретинопатией. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-87 (1994). Кроме того, были проведены исследования, которые выявили локализацию VEGF в хороидальных неоваскулярных мембранах у пациентов, страдающих AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-68 (1996).

Нейтрализующие анти-VEGF-антитела подавляют рост различных человеческих опухолевых клеточных линий у «голых» мышей (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995); Borgstrum et al., Cancer Res. 56:4032-39 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-24 (1996)), также ингибируют внутриглазной ангиогенез в моделях ишемических заболеваний сетчатки (Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). Поэтому моноклональные анти-VEGF-антитела или другие ингибиторы действия VEGF являются перспективными кандидатами на их применение для лечения опухолевых и различных внутриглазных неоваскулярных заболеваний. Такие антитела описаны, например, в EP 817648, опубликованном 14 января 1998; в заявках WO 98/45331 и WO 98/45332, опубликованных 15 октября 1998. Одно из анти-VEGF-антител, бевацизумаб, было разрешено Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) к его применению в комбинации с химиотерапией для лечения конкретных раковых заболеваний, фрагмент анти-VEGF-антитела, ранибизумаб, был разрешен FDA к применению для лечения возрастной (мокрой) дегенерации желтого пятна. В настоящее время оба этих лекарственных средства проходят клинические испытания.

Очевидно, что необходимость получения агентов, которые обладают клиническими признаками, являющимися оптимальными для разработки терапевтических средств, остается актуальной. Изобретение, описанное в настоящей заявке, удовлетворяет этим требованием и имеет другие преимущества.

Все цитируемые здесь работы, включая патентные заявки и публикации, во всей их полноте включены в настоящее описание посредством ссылки.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение частично основано на идентификации различных DLL4-связывающих агентов (таких как иммуноконъюгаты, антитела и их фрагменты). DLL4 представляет собой важную и предпочтительную терапевтическую мишень, и настоящее изобретение относится к композициям и к способам, основанным на связывании с DLL4. Описанные здесь DLL4-связывающие агенты согласно изобретению представляют собой важные терапевтические и диагностические средства, которые могут быть использованы для лечения патологических состояний, ассоциированных с экспрессией и/или активностью каскада реакций DLL4-рецептора Notch. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способам, композициям, наборам и промышленным изделиям, ассоциированным с DLL4-связыванием.

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются (например, специфически связываются) с DLL4.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному анти-DLL4-антителу, где полноразмерная IgG-форма антитела специфически связывается с человеческим DLL4 с аффинностью связывания примерно 1 нМ или более или примерно 500 пМ или более. Как хорошо известно специалистам, аффинность связывания лиганда с его рецептором может быть определена с помощью различных анализов и выражена различными количественными величинами. В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения аффинность связывания выражена величинами Kd и представляет собой природную аффинность связывания (например, с минимальными эффектами авидности). Обычно и предпочтительно аффинность связывания измеряют in vitro в бесклеточной или в клеточной среде. Для измерения аффинности связывания может быть использован любой из известных анализов, включая описанные здесь анализы, например Biacore®, радиоиммуноанализ (РИА) и ELISA. В некоторых вариантах изобретения выделенное анти-DLL4-антитело связывается с человеческим и мышиным DLL4 с аналогичной аффинностью, то есть аффинность связывания с человеческим DLL4 превышает аффинность связывания с мышиным DLL4 не более чем в 100 раз или менее. В некоторых вариантах изобретения аффинность связывания с человеческим DLL4 превышает аффинность связывания с мышиным DLL4 не более чем в 10 раз или менее. В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с мышиным DLL4 с аффинностью связывания примерно 1 нМ или более или примерно 500 пМ или более.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному анти-DLL4-антителу, где полноразмерная IgG-форма антитела специфически связывается с человеческим DLL4 с k_on примерно 2×10⁵ или более или примерно 1×10⁵ или более. Как хорошо известно специалистам, k_on связывания лиганда с его рецептором может быть определена с помощью различных анализов и выражена различными количественными величинами.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое связывается с лиганд-связывающей областью DLL4. В некоторых вариантах изобретения, выделенное антитело связывается с полипептидом, включающим внеклеточный домен DLL4 или состоящим, или, в основном, состоящим из этого домена. В некоторых вариантах изобретения выделенное антитело связывается с полипептидом, включающим, состоящим или, в основном, состоящим из них, аминокислоты 252-282, 1-252, 1-286, 1-324 и/или 219-286 человеческого DLL4.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному анти-DLL4-антителу, которое конкурирует с рецептором Notch за связывание с DLL4.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенному анти-DLL4-антителу, которое ингибирует, снижает и/или блокирует биологическую активность DLL4.

В одном из аспектов изобретения анти-DLL4-антитело согласно изобретению включает:

(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей гипервариабельных областей (HVR), выбранных из группы, состоящей из:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A11, где A1-A11 представляет собой RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:10);

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой SASFLYS (SEQ ID NO:11);

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSYNGPST (SEQ ID NO:15);

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GFTFTDNWIS (SEQ ID NO:1);

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GVINPNSGATEYADSVKG (SEQ ID NO:5) и

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F15, где F1-F15 представляет собой VYYCARDNFGGYFDY (SEQ ID NO:9); и

(b) по меньшей мере один вариант HVR, где указанный вариант последовательности HVR имеет модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленной в SEQ ID NO:1-18.

В одном из аспектов изобретения анти-DLL4-антитело согласно изобретению включает:

(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре или пять последовательностей гипервариабельных областей (HVR), выбранных из группы, состоящей из:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A11, где A1-A11 представляет собой RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:10);

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой SASFLYS (SEQ ID NO:11);

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSVNGPAT (SEQ ID NO:14);

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GFSFRDNWIS (SEQ ID NO:2);

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GVINPNSGSTDYADSVKG (SEQ ID NO:3);

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F15, где F1-F15 представляет собой VYYCARDNFGGYFDY (SEQ ID NO:9); и

(b) по меньшей мере один вариант HVR, где указанный вариант последовательности HVR имеет модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленной в SEQ ID NO:1-18.

В одном из аспектов изобретения анти-DLL4-антитело согласно изобретению включает:

(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре или пять последовательностей гипервариабельных областей (HVR), выбранных из группы, состоящей из:

(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A11, где A1-A11 представляет собой RASQDVSTAVA (SEQ ID NO:10);

(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой SASFLYS (SEQ ID NO:11);

(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSYTGTVT (SEQ ID NO:18);

(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GFTFTDNWIS (SEQ ID NO:1);

(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GYISPNSGFTYYADSVKG (SEQ ID NO:8) and

(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F15, где F1-F15 представляет собой VYYCARDNFGGYFDY (SEQ ID NO:9); и

(b) по меньшей мере один вариант HVR, где указанный вариант последовательности HVR имеет модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленной в SEQ ID NO:1-18.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, где каждая HVR включает последовательность или состоит, или, в основном, состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-18, и где SEQ ID NO:10 соответствует HVR-L1, SEQ ID NO:11 соответствует HVR-L2, SEQ ID NO:12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 соответствуют HVR-L3, SEQ ID NO:1 или 2 соответствуют HVR-H1, SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 или 8 соответствуют HVR-H2, SEQ ID NO:9 соответствует HVR-H3. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 12, 1, 3, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 13, 1, 4, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 14, 2, 3, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 15, 1, 5, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 16, 1, 6, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 17, 1, 7, 9. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из этих областей включает в указанном порядке SEQ ID NO:10, 11, 18, 1, 8, 9.

Варианты HVR в антителе согласно изобретению могут иметь модификации в одном или нескольких (например, в двух, трех, четырех, пяти или более) остатках в HVR.

В одном из вариантов изобретения вариант HVR-L3 содержит 1-6 (1, 2, 3, 4, 5 или 6) замен в любой комбинации в нижеследующих положениях: 91 (S или W), 92 (Y или F), 93 (T, N или S), 94 (T или G), 95 (P, Q, A или T) и/или 96 (P, S, A или V).

В одном из вариантов изобретения вариант HVR-H2 содержит 1-4 (1, 2, 3 или 4) замен в любой комбинации в нижеследующих положениях: 50 (V, L или Y), 52 (N или S), 52a (P или S) или 53 (N, Q, T или I).

Буквы в скобках после каждого положения указывают на репрезентативное замещение (то есть репрезентативную замену) аминокислот; и как очевидно специалисту в данной области, допустимость замены одной аминокислоты другой аминокислотой в соответствии с описанным здесь изобретением может быть оценена рутинными известными и/или описанными здесь методами.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-H1, содержащую последовательность SEQ ID NO:1 или 2. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-H2, содержащую последовательность SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 или 8. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-H3, содержащую последовательность SEQ ID NO:9. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-L1, содержащую последовательность SEQ ID NO:10. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-L2, содержащую последовательность SEQ ID NO:11. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к антителу, включающему область HVR-L3, содержащую последовательность SEQ ID NO:12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три нижеследующие последовательности:

(i) последовательность HVR-H1, содержащую последовательность SEQ ID NO:1;

(ii) последовательность HVR-H2, содержащую последовательность SEQ ID NO:5;

(iii) последовательность HVR-H3, содержащую последовательность SEQ ID NO:9.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три нижеследующие последовательности:

(i) последовательность HVR-L1, содержащую последовательность SEQ ID NO:10;

(ii) последовательность HVR-L2, содержащую последовательность SEQ ID NO:11;

(iii) последовательность HVR-L3, содержащую последовательность SEQ ID NO:15.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три нижеследующие последовательности:

(i) последовательность HVR-H1, содержащую последовательность SEQ ID NO:1;

(ii) последовательность HVR-H2, содержащую последовательность SEQ ID NO:8;

(iii) последовательность HVR-H3, содержащую последовательность SEQ ID NO:9.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три нижеследующие последовательности:

(i) последовательность HVR-L1, содержащую последовательность SEQ ID NO:10;

(ii) последовательность HVR-L2, содержащую последовательность SEQ ID NO:11;

(iii) последовательность HVR-L3, содержащую последовательность SEQ ID NO:18.

Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-18 пронумерованы для каждой отдельной HVR (то есть H1, H2 или H3), как показано на фигурах 1a и 1b, где указанная нумерация соответствует системе нумерации Кэбата, описанной ниже.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителам, включающим последовательности HVR тяжелой цепи, как показано на фигурах 1a и 1b.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителам, включающим последовательности HVR легкой цепи, как показано на фигурах 1a и 1b.

Некоторые варианты антител согласно изобретению включают вариабельный домен легкой цепи гуманизованного антитела 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN^®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также описанного в патенте США № 6407213 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93)), представленного ниже в SEQ ID NO:52.

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:52) (остатки HVR подчеркнуты).

В одном из вариантов изобретения последовательность вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 модифицирована в одном или нескольких положениях 30, 66 и 91 (Asn, Arg и His указаны выше жирным шрифтом/курсивом соответственно). В одном из вариантов изобретения модифицированная последовательность huMAb4D5-8 содержит Ser в положении 30, Gly в положении 66 и/или Ser в положении 91. В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, имеющий последовательность, представленную ниже в SEQ ID NO:53:

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:53) (остатки HVR подчеркнуты).

Замененные остатки в huMAb4D5-8 указаны выше жирным шрифтом/курсивом.

Антитела согласно изобретению могут содержать любую подходящую последовательность каркасного домена в вариабельной области при условии, что активность связывания с DLL4 будет, в основном, сохраняться. Так, например, в некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасных областей содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител, в положении 71 присутствует A, в положении 73 присутствует T и/или в положении 78 присутствует A. В одном из вариантов изобретения указанные антитела включают каркасные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также описанного в патентах США №№ 6407213 и 5821337 и в публикации Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93). В одном из вариантов изобретения эти антитела также включают консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи κI. В одном из вариантов изобретения указанные антитела включают последовательности HVR легкой цепи huMAb4D5-8 (описанные в патентах США №№ 6407213 и 5821337). В одном из вариантов изобретения указанные антитела включают последовательности вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также описанного в патентах США №№ 6407213 и 5821337 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93).

В одном из вариантов изобретения указанное антитело согласно изобретению включает вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 и/или 37, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:1, 5 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению включает вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:38, 39, 40 и/или 41, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 15 соответственно.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 и/или 37, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:2, 3 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:38, 39, 40 и/или 41, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 14 соответственно.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 и/или 37, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:1, 8 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:38, 39, 40 и/или 41, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 18 соответственно.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:46, 47, 48 и/или 49, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:1, 5 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:42, 43, 44 и/или 45, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 15 соответственно.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:46, 47, 48 и/или 49, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:2, 3 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:42, 43, 44 и/или 45, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 14 соответственно.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:46, 47, 48 и/или 49, последовательности HVR H1, H2 и H3 представляют собой SEQ ID NO:1, 8 и/или 9 соответственно. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:42, 43, 44 и/или 45, последовательности HVR L1, L2 и L3 представляют собой SEQ ID NO:10, 11 и/или 18 соответственно.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению подвергают аффинному созреванию с достижением нужной аффинности связывания с мишенью. В одном из примеров аффинно зрелое антитело согласно изобретению содержит замену в одном или нескольких положениях аминокислот H28, H30, H31, H32, H33, L91, L92, L93, L94, L95 и/или L96. В одном из примеров аффинно зрелое антитело согласно изобретению содержит одну или несколько из нижеследующих замен: (a) в тяжелой цепи, V50L, V50Y, N52S, P52aS, N53Q, N53T, N53I, S56A, S56F, T57S, D58E, D58I, D58A, D58Y, или (b), в легкой цепи, S91W, Y92F, T93N, T93S, T94G, P95Q, P95A, P95T, P96S, P96A, P96V.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:54. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:55. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:54, и вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:55.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:56. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:57. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:56, и вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:57.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:58. В одном из вариантов изобретения, антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:59. В одном из вариантов изобретения, антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:58, и вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID NO:59.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое конкурирует с любыми вышеупомянутыми антителами за связывание с DLL4. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с таким же эпитопом на DLL4, с которым связывается любое из вышеупомянутых антител.

Как известно специалистам и как подробно описано ниже, положения/границы аминокислот, определяющие гипервариабельную область антитела, могут варьироваться в зависимости от окружающих аминокислот и от различных дефиниций, известных специалистам (описанных ниже). Некоторые положения в вариабельном домене могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения, где эти положения, очевидно, могут присуствовать в гипервариабельной области в соответствии с одним рядом признаков, могут присуствовать и вне гипервариабельной области в соответствии с другим рядом признаков. Одно или несколько из этих положений может также находиться в удлиненных гипервариабельных областях (как подробно определено ниже).

В некоторых вариантах изобретения указанным антителом является моноклональное антитело. В некоторых вариантах изобретения указанным антителом является поликлональное антитело. В некоторых вариантах изобретения указанное антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, аффинно зрелого антитела, гуманизованного антитела и человеческого антитела. В некоторых вариантах изобретения указанным антителом является фрагмент антитела. В некоторых вариантах изобретения указанным антителом является Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ или scFv.

В одном из вариантов изобретения указанным антителом является химерное антитело, например антитело, включающее антигенсвязывающие последовательности, происходящие от не-человеческого донора и присоединенные к гетерологичной не-человеческой, человеческой или гуманизованной последовательности (например, последовательностям каркасного и/или константного домена). В одном из вариантов изобретения указанным не-человеческим донором является мышь. В одном из вариантов изобретения, антигенсвязывающая последовательность является синтетической, например, она может быть получена посредством мутагенеза (например, путем скрининга методом фагового представления и т.п.). В одном из вариантов изобретения химерное антитело согласно изобретению имеет мышиные V-области и человеческую С-область. В одном из вариантов изобретения мышиная V-область легкой цепи присоединена к человеческой легкой цепи каппа. В одном из вариантов изобретения мышиная V-область тяжелой цепи присоединена к человеческой С-области IgG1.

Гуманизованными антителами согласно изобретению являются антитела, имеющие аминокислотные замены в FR и аффинно зрелые варианты с заменами в присоединенных CDR. Замененные аминокислоты в CDR или FR не ограничиваются аминокислотами, присутствующими в антителе-доноре или реципиенте. В других вариантах изобретения антитела согласно изобретению также содержат замены аминокислотных остатков в Fc-области, которые улучшают эффекторную функцию, включая улучшение CDC- и/или ADCC-функции и усиление цитолиза B-клеток. Другими антителами согласно изобретению являются антитела, имеющие специфические замены, повышающие стабильность. В других вариантах изобретения антитела согласно изобретению содержат замены аминокислотных остатков в Fc-области, которые ослабляют эффекторную функцию, включая ослабление CDC- и/или ADCC-функции и/или ослабление цитолиза B-клеток. В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению характеризуются пониженным уровнем связывания (например, отсутствием связывания) с фактором C1q человеческой системы комплемента и/или с человеческим Fc-рецептором на природных клетках-киллерах (NK). В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению характеризуются пониженным уровнем связывания (например, отсутствием связывания) с человеческим FcγRI, FcγRIIA и/или FcγRIIIA. В некоторых вариантах изобретения антитела согласно изобретению принадлежат к классу IgG (например, IgG1 или IgG4) и содержат по меньшей мере одну мутацию в E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 и/или P329 (нумерация проводилась в соответствии с Европейской системой нумерации (EU)). В некоторых вариантах изобретения указанные антитела включают мутацию L234A/L235A или D265A/N297A.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителам против полипептидов DLL4, содержащим любую из описанных здесь антигенсвязывающих последовательностей, где указанные антитела против полипептидов DLL4 специфически связываются с DLL4.

Антитела согласно изобретению связываются (например, специфически связываются) с DLL4, в некоторых вариантах изобретения, они могут модулировать один или несколько видов DLL4-ассоциированных эффектов, включая, но не ограничиваясь ими, ослабление или блокирование активации рецептора Notch, ослабление или блокирование молекулярного сигнала, передаваемого после передачи сигнала рецептора Notch, нарушение или блокирование связывания рецептора Notch с DLL4 и/или стимуляцию пролиферации эндотелиальных клеток и/или ингибирование дифференцировки эндотелиальных клеток и/или ингибирование артериальной дифференциации и/или ингибирование сосудистой перфузии опухоли, и/или лечение и/или предупреждение развития опухоли, клоточно-пролиферативного расстройства или рака; и/или лечение или предупреждение расстройства, ассоциированного с экспрессией и/или активностью DLL4 и/или лечение или предупреждение расстройства, ассоциированного с экспрессией и/или активностью рецептора Notch. В некоторых вариантах изобретения, антитело согласно изобретению специфически связывается с DLL4. В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с внеклеточным доменом DLL4 (ECD). В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с полипептидом, состоящим или, в основном, состоящим из внеклеточного домена DLL4. В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с DLL4 с KD примерно 1 нМ или более, или примерно 500 пМ или более. В некоторых вариантах изобретения антитело специфически связывается с человеческим DLL4 с k_on примерно 2×10⁵ или более, или примерно 1×10⁵ или более. В некоторых вариантах изобретения антитело согласно изобретению ослабляет, ингибирует и/или блокирует активность DLL4 in vivo и/или in vitro. В некоторых вариантах изобретения антитело конкурирует с DLL4-лигандом за связывание с DLL4 (ослабляет и/или блокирует связывание рецептора Notch с DLL4).

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к композициям, содержащим одно или несколько антител согласно изобретению и носитель. В одном из вариантов изобретения указанный носитель является фармацевтически приемлемым.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим анти-DLL4-антитело согласно изобретению.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту согласно изобретению.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к композициям, содержащим одну или несколько нуклеиновых кислот согласно изобретению и носитель. В одном из вариантов изобретения указанный носитель является фармацевтически приемлемым.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор согласно изобретению. Указанным вектором может быть вектор любого типа, например рекомбинантный вектор, такой как экспрессионный вектор. При этом могут быть использованы любые клетки-хозяева. В одном из вариантов изобретения клеткой-хозяином является прокариотическая клетка, например E.coli. В одном из вариантов изобретения клеткой-хозяином является эукариотическая клетка, например клетка млекопитающего, такая как клетка яичника китайского хомячка (CHO).

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам получения антитела согласно изобретению. Так, например, настоящее изобретение относится к способам получения анти-DLL4-антитела (которое, как определено в настоящей заявке, является полноразмерным антителом или фрагментом антитела) или иммуноконъюгата, где указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора согласно изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фраг