Антитела к egfl7 и способы их применения

Антитела к egfl7 и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в целом к композициям и способам, которые являются пригодными для модулирования развития сосудов. Конкретно, настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с полипептидом домена 7, подобного эпидермальному фактору роста (EGFL7). Настоящее изобретение, кроме того, относится к диагностике и лечению состояний и заболеваний, связанных с ангиогенезом.

Уровень техники

Развитие переноса с помощью сосудов является фундаментальным требованием для множества физиологических и патологических процессов. Активно растущие ткани, такие как эмбрионы и опухоли, требуют адекватной подачи крови. Они удовлетворяют эту потребность посредством продуцирования проангиогенных факторов, которые способствуют формированию новых кровеносных сосудов с помощью процесса, называемого ангиогенезом. Формирование трубочек сосудов представляет собой сложное, но упорядоченное биологическое событие, включающее в себя все следующие далее стадии или многие из них: a) эндотелиальные клетки (EC) пролиферируют из существующих EC или дифференцируются от прогениторных клеток; b) EC мигрируют и коалесцируют с формированием тяжеобразных структур; c) затем сосудистые тяжи подвергаются тубулогенезу с формированием сосудов с центральным просветом; d) существующие тяжи или сосуды высылают отростки для формирования вторичных сосудов; e) примитивное сосудистое сплетение подвергается дальнейшей перестройке и переформированию; и f) периэндотелиальные клетки рекрутируются для окружения эндотелиальных трубочек, обеспечивая обслуживающие и модуляторные функции для сосудов; такие клетки включают в себя перициты для малых капилляров, клетки гладких мышц для сосудов большего размера и клетки миокарда в сердце. Hanahan, Science 277:48-50 (1997); Hogan & Kolodziej, Nat. Rev. Genet. 3:513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112:19-28 (2003).

Сейчас хорошо установлено, что ангиогенез осуществляется при патогенезе разнообразных расстройств. Они включают в себя твердые опухоли и метастазы, атеросклероз, ретролентальную фиброплазию, гемангиомы, хроническое воспаление, интраокулярные неоваскулярные заболевания, такие как пролиферативные ретинопатии, например, диабетическая ретинопатия, возрастная макулярная дегенерация (AMD), неоваскулярная глаукома, иммунное отторжение трансплантированной корнеальной ткани и других тканей, ревматоидный артрит и псориаз. Folkman et al., J. Biol Chem. 267:10931-34 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); и Garner A., "Vascular diseases," In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp. 1625-1710.

В случае роста опухоли, ангиогенез видимо является критичным для перехода от гиперплазии к неоплазии, и для обеспечения питания для роста и метастазирования опухоли. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). Неоваскуляризация дает возможность опухолевым клеткам для получения преимущества в росте и пролиферативной автономии, по сравнению с нормальными клетками. Опухоль обычно начинается как отдельная аберрантная клетка, которая может пролиферировать только до размера в несколько кубических миллиметров, из-за дистанции до ближайшего доступного капиллярного русла, и она может оставаться 'пассивной' без дальнейшего роста и распространения в течение продолжительного периода времени. Некоторые опухолевые клетки затем переключается на ангиогенный фенотип с активированием эндотелиальных клеток, которые пролиферируют и созревают в виде новых капиллярных кровеносных сосудов. Эти вновь сформированные кровеносные сосуды не только делают возможным непрерывный рост первичной опухоли, но также служат для распространения и реколонизации метастатических опухолевых клеток. Соответственно, наблюдается корреляция между плотностью микрососудов в срезах опухоли и выживаемостью пациентов при раке груди, а также при некоторых других опухолях. Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-24 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-46 (1992). Точные механизмы, которые контролируют ангиогенное переключение, как следует, непонятны, но предполагается, что неоваскуляризация массы опухоли возникает в результате общего баланса действия множества стимуляторов и ингибиторов ангиогенеза (Folkman, Nat. Med. 1(1):27-31 (1995)).

Процесс развития сосудов плотно регулируется. К настоящему времени, значительное количество молекул, в основном, секретируемых факторов, продуцируемых окружающими клетками, как показано, регулируют дифференциацию, пролиферацию, миграцию и коалесценцию EC в виде тяжеобразных структур. Например, фактор васкулярного эндотелиального роста (VEGF) идентифицирован в качестве ключевого фактора, вовлеченного в стимулирование ангиогенеза и в индуцирование проницаемости сосудов. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). Обнаружение того, что потеря даже одной аллели VEGF приводит к летальности эмбриона, показывает незаменимую роль, которую играет этот фактор при развитии и дифференцировании сосудистой системы. Кроме того, VEGF, как показано, является ключевым медиатором неоваскуляризации, связанной с опухолями и интраокулярными расстройствами. Ferrara et al., Endocr. Rev, выше. мРНК VEGF сверхэкспрессируется в большинстве исследуемых опухолях человека. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-59 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-35 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-34 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-39 (1995).

Также, уровни концентрации VEGF в глазных жидкостях сильно коррелируют с присутствием активной пролиферации кровеносных сосудов у пациентов с диабетическими и другими связанными с ишемией ретинопатиями. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-87 (1994). Кроме того, исследования продемонстрировали локализацию VEGF в хороидальных неоваскулярных мембранах у пациентов, подверженных AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-68 (1996).

Нейтрализующие антитела анти-VEGF подавляют рост разнообразных линий клеток опухолей человека у голых мышей (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995); Borgstrom et al., Cancer Res. 56:4032-39 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-24 (1996)), а также ингибируют интраокулярный ангиогенез у моделей ишемических ретинальных расстройств (Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). По этой причине, моноклональные антитела анти-VEGF или другие ингибиторы действия VEGF являются обещающими кандидатами для лечения опухолей и различных интраокулярных неоваскулярных расстройств. Такие антитела описываются, например, в EP 817648, опубликованном 14 января, 1998 года; и в заявках WO 98/45331 и WO 98/45332, обе они опубликованы 15 октября, 1998 года. Одно из антител анти-VEGF, бевацизумаб, было одобрено FDA (администрация по лекарственным средствам и пищевым продуктам США) для использования в сочетании с режимом химиотерапии для лечения метастатического рака толстой и прямой кишки (CRC). И еще бевацизумаб исследуется во множестве осуществляемых клинических исследований для лечения различных проявлений рака.

Известно, что внеклеточный матрикс (ECM) играет важную роль в процессе ангиогенеза. Madri, Transpl. Immunol. 5:179-83 (1997). EC окружены временным ECM во время их миграции, и они прилипают в вновь синтезированным базальным мембранам сосуда после формирования просвета. В дополнение к созданию скелета во время морфогенеза капилляра, ECM, как показано, осуществляет комплексный локальный контроль функционирования EC. Например, ECM способен регулировать доступность растворимых ангиогенных медиаторов для EC и конкретизировать природу и тип взаимодействий с интегрином и клеточную адгезию молекул. Предполагается также, что выживаемость EC регулируется кооперацией между рецепторами фактора роста и интегринами, которые, в свою очередь, управляются композицией локального ECM. Stupack & Cheresh, Oncogene 22:9022-29 (2003).

Несмотря на множество достижений в области ангиогенеза, некоторые из стадий во время формирования трубки сосуда по-прежнему определены плохо. Особенно мало известно относительно того, как регулируется тубулогенез - как сосудистые тяжи развиваются, становясь трубочками, и какие факторы регулируют этот переход. Имея ввиду роль ангиогенеза во многих заболеваниях и расстройствах, является желательным создание средств уменьшения или ингибирования одного или нескольких биологических воздействий, вызывающих эти процессы. Является также желательным создание средств анализа присутствия патогенных полипептидов в нормальных и болезненных состояниях, в особенности при раке. Существует также необходимость в композициях и способах, которые могут повысить эффективность существующих терапевтических подходов против ангиогенеза.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение частично основывается на идентификации антител против EGFL7 со свойствами, которые показывают, что они являются особенно полезными для терапии.

В одном из аспектов, настоящее изобретение предоставляет антитела, продуцируемые гибридомами анти-EGFL7 mumab 4F11.1.8, анти-EGFL7 mumab 10G9.1.6 и анти-EGFL7 mumab 18F7.1.8.

В одном из аспектов, настоящее изобретение предоставляет антитело анти-EGFL7, содержащее одну или несколько комплементарно определяемых областей (CDR), выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности 4F11 CDR-L1 KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5); (b) последовательности 4F11 CDR-L2 GASNLES (SEQ ID NO: 6); (c) последовательности 4F11 CDR-L3 QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7); (d) последовательности 4F11 CDR-H1 TYGMS (SEQ ID NO: 8); (e) последовательности 4F11 CDR-H2 WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9); и (f) последовательности 4F11 CDR-H3 LGSSA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления, легкая цепь указанного антитела содержит, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности CDR, выбранных из: KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5), GASNLES (SEQ ID NO: 6), и QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7). В некоторых вариантах осуществления, тяжелая цепь указанного антитела содержит, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности CDR, выбранных из: TYGMS (SEQ ID NO: 8), WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9), и LGSSA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления, легкая цепь указанного антитела содержит, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности CDR, выбранных из: KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5), GASNLES (SEQ ID NO: 6), и QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7); и тяжелая цепь указанного антитела содержит, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности CDR, выбранных из: TYGMS (SEQ ID NO: 8), WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9), и LGSSA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления, легкая цепь антитела содержит последовательность: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления, тяжелая цепь антитела содержит последовательность: QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2).

В одном из аспектов, настоящее изобретение предоставляет антитело анти-EGFL7, содержащее одну или несколько комплементарно определяемых областей (CDR), выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности 10G9 CDR-L1 RSSQSLVIITNGITYLH(SEQIDNO: 11); (b) последовательности 10G9 CDR-L2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 12); (c) последовательности 10G9 CDR-L3 SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13); (d) последовательности 10G9 CDR-H1 DYYMNSDYYMN (SEQ ID NO: 14); (e) последовательности 10G9 CDR-H2 DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15) и (f) последовательности 10G9 CDR-H3 ALGVFDY (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления, легкая цепь указанного антитела содержит, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности CDR, выбранных из: RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11), KVSNRFS (SEQ ID NO: 12), и SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах осуществления, тяжелая цепь указанного антитела содержит, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности CDR, выбранных из: DYYMNSDYYMN (SEQ ID NO: 14), DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15) и ALGVFDY (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления, легкая цепь указанного антитела содержит, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности CDR, выбранных из: RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11), KVSNRFS (SEQ ID NO: 12), и SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13); и тяжелая цепь указанного антитела содержит, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности CDR, выбранных из: DYYMNSDYYMN (SEQ ID NO: 14), DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), и ALGVFDY (SEQ ID NO: 16). В некоторых вариантах осуществления, легкая цепь антитела содержит последовательность: DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGITYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления, тяжелая цепь антитела содержит последовательность: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSDYYMNSDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPKNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREADYDPIYYAMDYWGQGTTLTVSA (SEQ ID NO: 4).

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет антитела анти-EGFL7, которые специфично связываются с полипептидом, содержащим одну из следующих последовательностей аминокислот: CCP, TIY и ACS. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет выделенные антитела, которые связываются с таким же эпитопом EGFL7 человека, как и другие антитела по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет выделенные антитела, которые конкурируют за связывание EGFL7 с другими антителами по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело, антитело с созревшим сродством, антитело человека или биспецифичное антитело. В некоторых вариантах осуществления, антитело представляет собой фрагмент антитела.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую антитело анти-EGFL7 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция дополнительно содержит антиангиогенный агент. В некоторых вариантах осуществления, антиангиогенный агент представляет собой бевацизумаб или ранибизумаб.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, кодирующий антитело по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет векторы, содержащие эти полинуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления, векторы представляют собой векторы экспрессии. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет клетки-хозяева, включая прокариотические и эукариотические клетки (включая клетки млекопитающих), содержащие такие векторы. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет способ получения антитела анти-EGFL7, включающий в себя (a) экспрессирование вектора экспрессии в соответствующей клетке-хозяине и (b) извлечение антитела.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет способ уменьшения или ингибирования ангиогенеза у субъекта, имеющего патологическое состояние, связанное с ангиогенезом, включающий в себя введение субъекту эффективного количества антитела анти-EGFL7 по настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей антитело анти-EGFL7 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, патологическое состояние представляет собой неоплазму, например, карциному. В некоторых вариантах осуществления, патологическое состояние связано с глазом, например, представляет собой интраокулярное неоваскулярное заболевание. В некоторых вариантах осуществления, антиангиогенный агент вводится субъекту в дополнение к антителу анти-EGFL7 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, антиангиогенный агент представляет собой антагонист фактора васкулярного эндотелиального роста (VEGF), например, антитело анти-VEGF (включая бевацизумаб и ранибизумаб). В некоторых вариантах осуществления, антиангиогенный агент вводится до или после введения антитела анти-EGFL7. В некоторых вариантах осуществления, антиангиогенный агент вводится одновременно с антителом анти-EGFL7.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предоставляет способ повышения эффективности антиангиогенного агента у субъекта, имеющего патологическое состояние, связанное с ангиогенезом, включающий в себя введение субъекту антитела анти-EGFL7 по настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей антитело анти-EGFL7 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, патологическое состояние представляет собой неоплазму, например карциному. В некоторых вариантах осуществления, патологическое состояние связано с глазом, например, представляет собой интраокулярное неоваскулярное заболевание. В некоторых вариантах осуществления, антиангиогенный агент вводится субъекту в дополнение к антителу анти-EGFL7 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, антиангиогенный агент представляет собой антагонист фактора васкулярного эндотелиального роста (VEGF), например антитело анти-VEGF (включая бевацизумаб и ранибизумаб). В некоторых вариантах осуществления, антиангиогенный агент вводится до или после введения антитела анти-EGFL7. В некоторых вариантах осуществления, антиангиогенный агент вводится одновременно с антителом анти-EGFL7. В некоторых вариантах осуществления, применяются также другие средства лечения, например, кортикостероиды или фотодинамическая терапия.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает последовательность аминокислот вариабельного домена легкой цепи Mab 4F11 (SEQ ID NO: 1) и HuKI (SEQ ID NO: 17).

Фиг. 2 показывает последовательность аминокислот вариабельного домена тяжелой цепи Mab 4F11 (SEQ ID NO: 2) и HuIII (SEQ ID NO: 18).

Фиг. 3 показывает последовательность аминокислот вариабельного домена легкой цепи Mab 10G9 (SEQ ID NO: 3) и HuKI (SEQ ID NO: 17).

Фиг. 4 показывает последовательность аминокислот вариабельного домена тяжелой цепи Mab 10G9 (SEQ ID NO: 4) и HuIII (SEQ ID NO: 18).

Фиг. 5 иллюстрирует домены полноразмерного EGFL7 и его усеченных форм, используемых для картирования сайтов связывания антитела.

Фиг. 6 показывает объем опухоли in vivo у моделей Xenomouse, трансфицированных раком легких человека (NSCLC; HI 299), в течение курса лечения антителами анти-VEGF и анти-EGFL7 по настоящему изобретению.

Фиг. 7 показывает выживаемость у моделей Xenomouse, трансфицированных in vivo раком легких человека (NSCLC; H1299), в течение курса лечения антителами анти-VEGF и анти-EGFL7 по настоящему изобретению.

Фиг. 8 показывает объем опухоли in vivo у моделей Xenomouse, трансфицированных раком груди человека (MDA-MB231), в течение курса лечения антителами анти-VEGF и анти-EGFL7 по настоящему изобретению.

Фиг. 9 показывает объем опухоли in vivo у моделей Xenomouse, трансфицированных раком груди человека (MDA-MB231), в течение курса лечения антителом анти-VEGF и анти-EGFL7 Mab 18F7 по настоящему изобретению.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Настоящее изобретение предоставляет антитела анти-EGFL7, которые являются пригодными для использования, например, для лечения или предотвращения болезненных состояний, связанных с экспрессированием и/или активностью EGFL7, например, с повышенным экспрессированием и/или активностью или нежелательным экспрессированием и/или активностью. В некоторых вариантах осуществления, антитела по настоящему изобретению используются для лечения опухоли, рака и/или пролиферативного расстройства клеток.

В другом аспекте, антитела анти-EGFL7 по настоящему изобретению являются пригодными для использования в качестве реагентов для детектирования и/или выделения EGFL7, например для детектирования EGFL7 в различных тканях и типах клеток.

Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способы получения антител анти-EGFL7, полинуклеотидов, кодирующих антитела анти-EGFL7, и клеток, содержащих полинуклеотиды, кодирующие антитела анти-EGFL7.

Общие технологии

Технологии и процедуры, описываемые или упоминаемые здесь, как правило, хорошо понятны и повсеместно применяются с использованием обычной методологии специалистами в данной области, такие, например, как широко используемые методологии, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); в серии METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL., and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

Определения

"Выделенное" антитело представляет собой такое, которое идентифицируется и выделяется и/или извлекается из компонента его природно-окружающей среды. Загрязняющие компоненты его природно-окружающей среды представляют собой материалы, которые могут влиять отрицательно на диагностические или терапевтические применения антитела, и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворимые вещества. В некоторых вариантах осуществления, антитело будет очищаться (1) до получения более чем 95 мас.% антитела, как определяется посредством метода Лаури, а иногда, до более чем 99 мас.%, (2) до уровня, достаточного для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней последовательности аминокислот посредством использования секвенатора с вращающейся чашкой, или (3) до гомогенности в соответствии с анализом SDS-PAGE при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, с использованием окрашивания с помощью кумаси голубого или серебряного окрашивания. Выделенное антитело включает в себя антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку, по меньшей мере, один компонент природной окружающей среды антитела не будет присутствовать. Обычно, однако, выделенное антитело будет приготавливаться посредством, по меньшей мере, одной стадии очистки.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицируется и отделяется, по меньшей мере, от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связывается в природном источнике нуклеиновых кислот антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты находится в другой форме или имеет параметры иные, чем те, с которыми она находится в природе. По этой причине выделенные молекулы нуклеиновых кислот отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, как она существует в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют антитело, где, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в хромосомальном положении, отличном от природных клеток.

Термины "остаток вариабельного домена, пронумерованный согласно Kabat" или "положение аминокислоты, пронумерованное согласно Kabat" и их вариации относятся к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелых цепей или вариабельных доменов легких цепей компиляции антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). При использовании этой системы нумерации, реальная линейная последовательность аминокислот может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие сокращению или инсерции в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать одну вставку аминокислоты (остаток 52a в соответствии с Kabat) после остатка 52 H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b, и 82c и тому подобное, в соответствии с Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков согласно Kabat может определяться для данного антитела посредством совмещения в областях гомологии последовательности антитела со "стандартной" последовательностью, пронумерованной по Kabat.

Фраза "по существу сходные" или "по существу одинаковые", как здесь используется, означает достаточно высокой уровень сходства между двумя численными значениями (как правило, одно из них связано с антителом по настоящему изобретению, а другое связано с эталонным/сравнительным антителом) так что специалист в данной области посчитал бы различие между двумя значениями малым или не имеющим биологической и/или статистической значимости в контексте биологической характеристики, измеряемой с помощью указанных значений (например, значений Kd). Разность между указанными двумя значениями, как правило, является меньшей, примерно, чем 50%, примерно 40%, примерно 30%, примерно 20% или примерно 10%, как функция значения для эталонного/сравнительного антитела.

"Сродство связывания", как правило, относится к прочности общей суммы нековалентных взаимодействий между отдельным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указывается иного, как здесь используется, "сродство связывания" относится к собственному сродству связывания, которое отражает взаимодействие 1:1 между элементами связывающейся пары (например, антитела и антигена). Сродство молекулы X к ее партнеру Y может, как правило, быть представлено посредством константы диссоциации (Kd). Сродство может измеряться посредством обычных способов, известных в данной области, включая те, которые описываются здесь. Антитела с малым сродством, как правило, связывают антиген медленно и имеют тенденцию к легкой диссоциации, в то время антитела с высоким сродством, как правило, связывают антиген быстрее и имеют тенденцию к сохранению связи в течение более продолжительного времени. Разнообразные способы измерения сродства связывания известны в данной области, и любой из них может использоваться для целей настоящего изобретения. Конкретные иллюстративные варианты осуществления описываются далее.

В одном из вариантов осуществления, "Kd" или "значение Kd" в соответствии с настоящим изобретением измеряется посредством анализа связывания радиоактивно меченого антигена (RIA), осуществляемого с помощью версии Fab антитела, представляющего интерес, и его антигена, как описывается с помощью следующего анализа, который измеряет сродство связывания в растворе Fab к антигену посредством уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (¹²⁵I)-меченого антигена в присутствии ряда титрований немеченого антигена, а затем захвата связанного антигена с помощью планшета, покрытого антителом анти-Fab (Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-81 (1999)). Для установления условий для анализа, планшеты для микротитрования (Dynex) покрываются в течение ночи 5 мкг/мл захватывающего антитела анти-Fab (Cappel Labs) в 50 мМ растворе карбоната натрия (pH 9,6), а затем блокируются с помощью 2% (масс/объем) раствора сывороточного бычьего альбумина в PBS в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В планшете без адсорбента (Nunc #269620), 100 пМ или 26 пМ [^I25I]-антигена смешивают с последовательными разбавлениями Fab, представляющего интерес (например, в соответствии с оценками антитела анти-VEGF, Fab-12, у Presta et al., Cancer Res. 57:4593-99 (1997)). Затем Fab, представляющие интерес, инкубируют в течение ночи; однако инкубирование может продолжаться в течение более длительного периода (например, 65 часов), чтобы обеспечить достижение равновесия. После этого смеси переносят на планшет для захвата, для инкубирования при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют, и планшет промывают восемь раз 0,1% раствором Tween-20 в PBS. Затем планшеты сушат, добавляют 150 мкл/лунка сцинтиллянта (MicroScint-20; Packard) и планшеты считают на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого из Fab, которые дают 20% или меньше от максимального связывания, выбирают для использования в анализах конкурентного связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления Kd или значение Kd измеряют посредством анализов с использованием поверхностного плазмонного резонанса, с использованием BIAcore^TM-2000 или BIAcore^TM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, с помощью чипов с иммобилизованным антигеном CM5, при ~10 единицах отклика (RU). Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют с помощью N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разбавляют в 10 мМ раствора ацетата натрия, pH 4,8, как 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инжекцией при скорости потока 5 мкл/минута, для достижения приблизительно 10 единиц отклика (RU) связанного белка. После инжекции антигена, инжектируют 1M этаноламина для блокировки непрореагировавших групп. Для измерений кинетики, двукратное последовательное разбавление Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) инжектируют в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C, при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) вычисляют с использованием простой модели связывания Лангмюра один к одному (BIAcore Evaluation Software version 3.2) посредством одновременной подгонки сенсограммы ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) вычисляют как отношение k_off/k_on. См., например, Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Если скорость ассоциации превышает 10⁶ M^-1 сек^-1, согласно анализу с использованием поверхностного плазмонного резонанса, описанного выше, тогда скорость ассоциации может определяться посредством использования методики гашения флюоресценции, где измеряют увеличение или уменьшение интенсивности испускания флюоресценции (возбуждение=295 нм; испускание=340 нм, полосовой фильтр, 16 нм) при 25°C для 20 нМ антитела анти-антиген (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, что измеряют на спектрометре, таком как спектрофотометр, с остановкой потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) с красной кюветой с перемешиванием.

"Скорость прямой реакции" или "скорость ассоциации" или "скорость связывания", или "k_on" в соответствии с настоящим изобретением может также определяться с помощью той же технологии поверхностного плазмонного резонанса, описанной выше, с использованием BIAcore^TM-2000 или BIAcore^TM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, с помощью чипов с иммобилизованным антигеном CM5 при ~10 единиц оклика (RU). Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют с помощью N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с инструкциями производителей. Антиген разбавляют 10 мМ ацетата натрия, pH 4,8, при 5 мг/мл (~0,2 мкМ), перед инжекцией при скорости потока 5 мкл/минут для достижения приблизительно 10 единиц оклика (RU) связанного белка. После инжекции антигена, инжектируют 1M этаноламина для блокировки непрореагировавших групп. Для измерений кинетики, двукратные последовательные разбавления Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) инжектируют в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C, при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) вычисляют с использованием простой модели связывания Лангмюра один к одному (BIAcore Evaluation Software version 3.2) посредством одновременной подгонки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесная константа диссоциации (Kd) вычисляется как отношение k_off/k_on. См., например, Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293:865-81 (1999). Однако, если скорость ассоциации превышает 10⁶ M^-1 сек^-1, согласно анализу с помощью поверхностного плазмонного резонанса, описанного выше, тогда скорость ассоциации, как правило, определяется посредством использования методики гашения флюоресценции, где измеряют увеличение или уменьшение интенсивности испускаемой флюоресценции (возбуждение=295 нм; испускание=340 нм, полосовой фильтр, 16 нм) при 25°C для 20 нМ антитела анти-антиген (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, что измеряют на спектрометре, таком как спектрофотометр, с системой остановки потока (Aviv Instruments), или спектрофотометр 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.

Термин "вектор", как здесь используется, предназначен для упоминания молекулы нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Один из типов вектора представляет собой "плазмиду, которая относится к круговой петле двухнитевой ДНК, с которой могут лигироваться дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой фаговый вектор. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут лигироваться в виде вирусного генома. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный источник репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут встраиваться в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и при этом они реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы упоминаются здесь как "рекомбинантные векторы экспрессии" (или просто, "рекомбинантные векторы"). Как правило, векторы экспрессии, используемые в технологиях рекомбинантной ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании, "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку пазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора.

"Полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", как здесь используются взаимозаменяемо, относятся к полимерам из нуклеотидов любой длины и включают в себя ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который может включаться в полимер с помощью ДНК или РНК полимеразы или посредством реакции синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если она присутствует, модификация структуры нуклеотидов может придаваться до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может дополнительно модифицироваться после синтеза, например, посредством конъюгирования с меткой. Другие типы модификаций включают в себя, например, "кэппирование", замещение одного или нескольких существующих в природе нуклеотидов аналогом, внутринуклеотидные модификации, такие, например, как модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, сложные фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и тому подобное) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и тому подобное), замещения, содержащие боковые остатки, такие, например, как белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и тому подобное), замещения интеркаляторами (например, акридин, псорален и тому подобное), замещения, содержащие хелатирующие агенты (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и тому подобное), замещения, содержащие алкиляторы, замещения с модифицированными связями (например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты и тому подобное), а также немодифицированные формы полинуклеотида (полинуклеотидов). Кроме того, любые из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, могут заменяться, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищенными с помощью стандартных защитных групп или активированными для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или могут конъюгироваться с твердыми или полутвердыми подложками. Группа OH на 5' и 3' концах может быть фосфорилированной или замещенной аминами или органическими остатками кэппирующих групп из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы могут также дериватизовываться до стандартных защитных групп. Полинуклеотиды могут также содержать аналогичные формы рибозных или дезоксирибозных сахаров, которые являются, как правило, известными в данной области, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидо-рибозу, карбоциклические аналоги сахаров, альфа-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и аналоги с основными нуклеозидами, такие как метилрибозид. Одна или несколько связей сложных фосфодиэфиров может заменяться альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают в себя, но, не ограничиваясь этим, варианты осуществления, где фосфат заменяется P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), (O)NR₂ ("амидат"), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ ("формацеталь"), в котором каждый из R или R' независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аральдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть одинаковыми. Предыдущее опи