Полипептид

Полипептид

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка относится к предварительным заявкам США на патент с регистрационными номерами 60/485413, 60/485539 и 60/485616, поданным 7 июля 2003. Ссылка также относится к международным заявкам РСТ/US2004/021723 и РСТ/US2004/021739, поданным 7 июля 2004 и указывающим США (заявитель: Genencor International, Inc). Ссылка также относится к заявкам США на патент на изобретение под регистрационными номерами 10/886905 и 10/866903, которые также все были поданы 7 июля 2004.

Ссылка также относится к предварительной заявке США на патент под регистрационным номером 60/608919 (поданной как заявка США на патент на изобретение под регистрационным номером 10/887056 7 июля 2004, но преобразованной в предварительную заявку от 15 сентября 2004). Ссылка также относится к предварительной заявке США под регистрационным номером 60/612407, которая была подана 22 сентября 2004.

Ссылка дополнительно относится к заявке США на патент под регистрационным номером 60/485539, поданной 7 июля 2003. Ссылка также относится к международной заявке РСТ/IB2004/002487, поданной 7 июля 2004 и указывающей США (заявитель: Danisco A/S). Ссылка также относится к предварительной заявке США на патент на изобретение под регистрационным номером 10/886023, поданной 7 июля 2004.

Ссылка также относится к заявкам США на патент на изобретение под регистрационными номерами 10/886505, 10/886527 и 10/886504, которые все были поданы 7 июля 2004. Ссылка также относится к заявке США на патент на изобретение под регистрационным номером 10/947612, поданной 22 сентября 2004.

Вышеприведенные заявки и каждый документ, цитированный или внесенный ссылкой в каждую из данной и вышеприведенных заявок, в том числе в течение рассмотрения каждой из вышеприведенных заявок (“цитированные документы заявок и статей”), и любые инструкции разработчиков или каталоги по любым продуктам, цитированным или упомянутым в каждой из вышеприведенных заявок и статей и в любой заявке и цитированных документах статей, таким образом, являются включенными в данную работу посредством ссылки. Кроме того, все документы, цитированные в данном тексте, и все документы, цитированные или внесенные ссылкой в документы, цитированные в данном тексте, и любые инструкции разработчиков или каталоги по любым продуктам, цитированным или упомянутым в данном тексте или в любом документе, таким образом включенном в данный текст, являются включенными в данную работу посредством ссылки. Документы, включенные посредством ссылки в данный текст, или любые их прописи могут быть использованы при практической реализации данного изобретения. Документы, включенные посредством ссылки в данный текст, не признаются являющимися предшествующим уровнем техники.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к полипептидам, особенно к полипептидам амилазы и нуклеиновым кислотам, кодирующим их, и их применениям в качестве немальтогенных экзоамилаз в производстве пищевых продуктов. Амилазы данного изобретения сконструированы таким образом, что они имеют больше полезных качеств. В частности, амилазы настоящего изобретения проявляют измененную экзоспецифичность и/или измененную термостабильность. В частности полипептиды получены из полипептидов, имеющих немальтогенную экзомилазную активность, в частности активность глюкан-1,4-альфа-мальтотетрагидролазы (ЕС 3.2.1.60).

Уровень техники

Улучшенные амилазы могут способствовать решению проблем, присущих некоторым процессам, таким как выпекание. Кристаллизация амилопектина происходит в крахмальных гранулах в день после выпекания, что приводит к повышенному черствению хлеба и вызывает потерю свежести хлеба. Когда хлеб черствеет, хлеб теряет эластичность мякиша и влагу мякиша. В результате мякиши становятся менее эластичными, и на хлебе образуется кожистая корка.

Ферментативный гидролиз (например, амилазами) боковых цепей амилопектина может снижать кристаллизацию и повышать противодействие черствению. Кристаллизация зависит от длины боковых цепей амилопектина: чем длиннее боковые цепи, тем больше кристаллизация. Большинство крахмальных гранул состоит из смеси двух полимеров: амилопектина и амилозы, из которых примерно 75% приходится на амилопектин. Амилопектин представляет собой очень большую, разветвленную молекулу, состоящую из цепей α-D-глюкопиранозильных единиц, соединенных (1-4)-связями, где цепи прикреплены α-D-(1-6)-связями для образования ответвлений. Амилоза представляет собой линейную цепь из (1-4)-связанных α-D-глюкопиранозильных единиц, имеющих незначительное количество α-D-(1-6)ответвлений.

Выпекание мучных хлебобулочных продуктов, таких как белый хлеб, хлеб, сделанный из просеянной рисовой муки и пшеничной муки, и булочки, выполняется выпеканием хлебного теста при температурах печи в интервале от 180 до 250°С в течение примерно от 15 до 60 минут. В течение процесса выпекания крутой градиент температуры (200→120°С) преобладает выше в поверхностных слоях теста, где образуется корка выпекаемого продукта. Однако из-за пара температура в мякише составляет только около 100°С в конце процесса выпекания. При температурах выше, примерно 85°С, может происходить инактивация фермента и фермент не будет обладать свойствами, противодействующими черствению. Таким образом, только термостабильные амилазы способны эффективно модифицировать крахмал в процессе выпекания.

Активность эндоамилазы может отрицательно влиять на качество конечного хлебного продукта образованием липкого, клейкого мякиша из-за аккумулирования разветвленных декстринов. Предпочтительной является активность экзоамилазы, потому что она осуществляет желаемую модификацию крахмала, которая приводит к замедлению черствения, с меньшими отрицательными эффектами, связанными с активностью эндоамилазы. Уменьшение активности эндоамилазы может привести к большей экзоспецифичности, что может уменьшить разветвленные декстрины и произвести хлеб более высокого качества.

Сущность изобретения

Авторы данного изобретения предлагают PS4-вариантный полипептид, представленный в формуле изобретения. Авторы также предлагают применение такого PS4-вариантного полипептида в качестве пищевых добавок и включением его в продовольственные продукты, хлебобулочные изделия, композиции улучшителя, кормовые продукты, в том числе корма для животных, и т.д., как представлено в формуле изобретения. Авторы предлагают нуклеиновые кислоты, которые кодируют и которые имеют отношение к PS4-вариантным полипептидам, представленным в формуле изобретения. Способы получения таких PS4-вариантных полипептидов, а также другие аспекты изобретения представлены в формуле изобретения.

Списки последовательностей

SEQ ID NO:1 представляет PS4-эталонную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila. SEQ ID NO:2 представляет PSac-D34 последовательность; аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Рseudomonas saccharophila с 11 замещениями и делецией крахмал-связывающего домена. SEQ ID NO:3 представляет PSac-D20 последовательность; аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila с 13 замещениями и делецией крахмал-связывающего домена. SEQ ID NO:4 представляет PSac-D14 последовательность; аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila с 14 замещениями и делецией крахмал-связывающего домена. SEQ ID NO:5 представляет предшественник глюкан-1,4-альфа-мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila (ЕС 3.2.1.60) (G4-амилаза)(мальтотетраозо-образующая амилаза)(экзомальтотетраогидролаза)(мальтотетраозо-образующая экзоамилаза). Номер доступа в SWISS-PROT - Р22963. SEQ ID NO:6 представляет ген mta P.saccharophila, кодирующий мальтотетраогидролазу (ЕС номер = 3.2.1.60). Номер доступа в GenBank - Х16732. SEQ ID NO:7 представляет PS4-эталонную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности мальтотетрагидролазы Pseudomonas stutzeri. SEQ ID NO:8 представляет PStu-D34 последовательность; аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas stutzeri с 9 замещениями. SEQ ID NO:9 представляет PStu-D20 последовательность; аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas stutzeri с 11 замещениями. SEQ ID NO:10 представляет PStu-D14 последовательность; аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas stutzeri с 12 замещениями. SEQ ID NO:11 представляет предшественник глюкан-1,4-альфа-мальтотетрагидролазы Pseudomonas stutzeri (Pseudomonas perfectomarina) (ЕС 3.2.1.60) (G4-амилаза) (мальтотетраозо-образующая амилаза) (экзомальтотетраогидролаза) (мальтотетраозо-образующая экзоамилаза). Номер доступа в SWISS-PROT - Р13507. SEQ ID NO:12 представляет ген мальтотетраозо-образующей амилазы (amyP) P. stutzeri, полный cds. Номер доступа в GenBank - M24516. SEQ ID NO:13 представляет pMD55 последовательность; аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila с 11 замещениями (G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, L178F, A179T и G121F). SEQ ID NO:13 представляет pMD55 последовательность; аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila с 11 замещениями (G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y, D34N, L178F, A179T и G121F) и делецией крахмал-связывающего домена. SEQ ID NO:14 представляет РMD96 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, H307L и S334P. SEQ ID NO:15 представляет SSM 381 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L и 334P. SEQ ID NO:16 представляет SSM279 B1 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую аминокислотные мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157М, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L и 334P. SEQ ID NO:17 представляет SSM237 Р2 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую аминокислотные мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 158T, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L и 334P. SEQ ID NO:18 представляет аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую аминокислотные мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 198W, 223E, 307L и 334P. SEQ ID NO:19 представляет SSM325 F3 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229Р, 307L и 334P. SEQ ID NO:20 представляет рMD129 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 198W, 223E, 303E, 307L и 334P. SEQ ID NO:21 представляет SSM341 A9 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 303E, 307L и 334P. SEQ ID NO:22 представляет SSM341 G11 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 303D, 307L и 334P. SEQ ID NO:23 представляет SSM350 B11 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306T, 307L и 334P. SEQ ID NO:24 представляет SSM350 C12 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 306G, 307L и 334P. SEQ ID NO:25 представляет SSM332 Q4 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую аминокислотные мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 309Р, 307L и 334P. SEQ ID NO:26 представляет SSM365 В4 последовательность: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую аминокислотные мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316S и 334P. SEQ ID NO:27 представляет SSM365 F4: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 316P и 334P. SEQ ID NO:28 представляет SSM360 C7: аминокислотную последовательность мальтотетрагидролазы Pseudomonas saccharophila, имеющую мутации 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 307L, 334P и 353T.

Подробное описание

В нижеследующих описании и примерах, если в тексте не оговорено иначе, дозы PS4-вариантных полипептидов даны в частях на миллион (микрограммы на грамм) муки. Например, обозначение “1 D34”, использованное в таблице 2, указывает на 1 часть на миллион pSac-D34 на основе массы к массе. Предпочтительно количества фермента или количества определяют на основе анализов активности в виде эквивалентов чистого ферментного белка, измеренного с помощью альбумина бычьей сыворотки (BSA) в качестве стандарта, используя анализ, описанный в Bradford (1976, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254).

В описании различных вариантов PS4-вариантного полипептида, созданных или подразумеваемых в качестве охватываемых данным документом, будут приняты следующие обозначения для облегчения ссылки:

(i) в тех случаях, когда замещение включает число и букву, например, 141Р, то это относится к [положение в соответствии с системой нумерации/замещающая аминокислота]. Таким образом, например, замещение аминокислоты на пролин в положении 141 обозначается как 141Р;

(ii) в тех случаях, когда замещение включает букву, число и букву, например, А141Р, то это относится к [первоначальная аминокислота/положение в соответствии с системой нумерации/замещающая аминокислота]. Таким образом, например, замещение аланина на пролин в положении 141 обозначается как А141Р.

В тех случаях, когда возможно присутствие двух или более вероятных заместителей в конкретном положении, это будет обозначаться прилежащими буквами, которые необязательно могут быть разделены косой черточкой “/”, например, G303ED или G303E/D. Там, где в положении соответствующей аминокислоты может быть замещение на любую аминокислоту, это обозначается следующим образом [положение, в соответствии с системой нумерации/Х], например, 121Х.

Множественные мутации могут обозначаться наличием разделительных косых черточек “/”, например, А141Р/G223A, что означает мутации в положении 141 и 223 при замещении аланина пролином и глицина аланином, соответственно.

Если не указано иначе, то все технические и научные термины, использованные в данной работе, имеют то же самое значение, что и обычно подразумеваемое средним специалистом в данной области, к которой настоящее изобретение относится. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, New York (1994), и Hale and Marham, The Happer Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) обеспечивают специалистов общим словарем по многим терминам, использованным в данном изобретении. Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, могут быть применены на практике или при тестировании данного изобретения, в нем описаны предпочтительные методы и материалы. Области числовых значений включают числовые значения, определяющие границы области. Если не указано иначе, нуклеиновые кислоты представлены слева направо в направлении от 5' к 3'; аминокислотные последовательности представлены слева направо в направлении от амино до карбокси, соответственно.

В практике данного изобретения будут использованы, если не указано иначе, обычные методики химии, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые находятся на уровне способностей среднего специалиста в данной области. Такие методики изложены в литературе. См., например, J. Sambrооk, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9,13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol № 1 by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson "Immunocytochemistry: Theory and Practice", CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); "Immunochemical Protocols, vol.80", in the series: "Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. Каждый из перечисленных источников включен в данную работу посредством ссылки.

Все патенты и публикации, включающие все последовательности, раскрытые в таких патентах и публикациях, отнесенных к данной работе, в явной форме включены посредством ссылки.

PS4-вариантные полипептиды

Авторы предлагают немальтогенную экзоамилазу, имеющую замещение в одном или нескольких положениях, которое приводит к измененному свойству, предпочтительно, к измененной экзоспецифичности или измененной термостабильности, или к обоим свойствам относительно исходного фермента.

Кроме того, авторы предлагают композиции, включающие пищевые добавки, пищевые продукты, хлебобулочные изделия, композиции улучшителей, кормовые продукты, включающие животные корма, и т.д., содержащие полипептиды, которые обладают немальтогенной экзоамилазной активностью, а также способы получения и применения таких полипептидов и композиций. Авторы предлагают другие применения таких композиций, а именно в приготовлении детергентов, подсластителей, сиропов, и т.д. Композиции включают полипептид вместе, с по меньшей мере, одним другим компонентом. В частности авторы предлагают пищевые или кормовые добавки, содержащие полипептиды.

Такие полипептиды и нуклеиновые кислоты отличаются от их исходных последовательностей включением ряда мутаций и обозначены для удобства как “PS4-вариантные полипептиды”. Иными словами, последовательность PS4-вариантного полипептида или нуклеиновой кислоты отличается от исходной последовательности по ряду положений или остатков. В предпочтительных вариантах осуществления мутации включают аминокислотные замещения, т.е. замену одного аминокислотного остатка на другой. Таким образом, PS4-вариантные полипептиды содержат ряд замен в природе аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях исходной последовательности.

Использованный в данной работе термин “вариант” следует понимать, как обозначающий молекулу, происходящую от исходной молекулы. Варианты включают полипептиды, а также нуклеиновые кислоты. Варианты включают замещения, инсерции, трансверсии и инверсии, наряду с другими превращениями, на одном или нескольких положениях. Варианты включают также усечения. Варианты включают гомологи и функциональные производные исходных молекул. Варианты включают последовательности, которые являются комплементарными последовательностям, которые способны к гибридизации с нуклеотидными последовательностями, представленными в данной работе.

Замещения для PS4-вариантных полипептидов

Авторы предлагают PS4-вариантные полипептиды с изменениями последовательностей, включающими аминокислотные замещения в немальтогенной экзоамилазной последовательности. Аминокислотное замещение может быть представлено в любом одном или нескольких положениях 26, 70, 121, 145, 146, 157, 158, 161, 188, 198, 223, 229, 272, 303, 306, 309, 316, 339 и 353 относительно нумерации положений последовательности экзоамилазы Pseudomonas saccharophila, представленной как SEQ ID NO:1.

Аминокислотная мутация может присутствовать в одном или нескольких положениях, выбранных из групп, состоящих из: (а) положений 121, 161, 223; (b) положений 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316, 353; и (с) положений 26, 70, 145, 188, 272, 339; и любых комбинаций (а), (b) и (с).

Аминокислотное замещение может включать замену на 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E, 223K. В альтернативном случае или в дополнение, аминокислотное замещение может включать замену на 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q, 353T. Кроме того, в альтернативном случае или в дополнение аминокислотное замещение может включать замену на 26E, 70D, 1145D, 188S, 188T, 188H, 272Q, 339A, 339E.

Такие вариантные полипептиды обозначены в данном документе как “PS4-вариантные полипептиды”. Нуклеиновые кислоты, кодирующие такие вариантные полипептиды, также раскрыты и будут обозначаться для удобства как «PS4-вариантные нуклеиновые кислоты». PS4-вариантные полипептиды и нуклеиновые кислоты будут более подробно описаны ниже.

«Исходные» последовательности, т.е. последовательности, на которых основаны PS4-вариантные полипептиды и нуклеиновые кислоты, предпочтительно представляют собой полипептиды, имеющие немальтогенную экзоамилазную активность. Термины “исходные ферменты” и “исходные полипептиды” следует интерпретировать соответственно и использовать для обозначения ферментов и полипептидов, на которых основаны PS4-вариантные полипептиды. Они более подробно описаны ниже.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления исходные последовательности представляют собой немальтогенные экзоамилазные ферменты, предпочтительно бактериальные немальтогенные экзоамилазные ферменты. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления исходные последовательности содержат глюкан-1,4-альфа-мальтотетрагидролазу (ЕС 3.2.1.60). Предпочтительно исходная последовательность представляет собой последовательность, получаемую из видов Pseudomonas, например Pseudomonas saccharophilia или Pseudomonas stutzeri.

В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид содержит или является гомологом последовательности немальтогенной экзоамилазы дикого типа, например, из Pseudomonas spp.

Таким образом, исходный полипептид может включать немальтогенную экзоамилазу из Pseudomonas saccharophilia, имеющую последовательность, представленную как SEQ ID NO:1. В других предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает немальтогенную экзоамилазу из Pseudomonas stutzeri, имеющую последовательность, представленную как SEQ ID NO:11, или немальтогенную экзоамилазу из Pseudomonas stutzeri, имеющую номер доступа в SWISS-PROT-Р13507.

С другой стороны, исходный полипептид может представлять собой вариант из любых последовательностей дикого типа, что означает, что исходный полипептид может быть сам по себе сконструирован или содержать PS4-вариантный полипептид.

Однако, как будет ясно специалисту в данной области, хотя PS4-вариантные полипептиды могут быть получены мутациями уже мутированных последовательностей, можно создать такие вариантные полипептиды, начиная от последовательности дикого типа (или фактически любой подходящей последовательности), идентификацией различий между начальной последовательностью и желаемым вариантом и введением требуемых мутаций в исходную последовательность для достижения желаемого варианта.

Родственные белки и нуклеиновые кислоты, предпочтительно имеющие последовательность или функциональную гомологию с последовательностью немальтогенной экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной как SEQ ID NO:1, или с последовательностью немальтогенной экзоамилазы Pseudomonas stutzeri, представленной как SEQ ID NO:11, названы в данном документе членами “PS4-семейства”. Примеры немальтогенных экзоамилазных ферментов из “PS4-семейства”, подходящих для применения при получении PS4-вариантных полипептидов и нуклеиновых кислот, более подробно раскрыты ниже.

PS4-вариантные полипептиды, описанные в данном документе, предпочтительно сохраняют свойства исходных полипептидов и, кроме того, предпочтительно обладают дополнительными полезными свойствами, например повышенной активностью, или термостабильностью, или рН устойчивостью или любой их комбинацией (предпочтительно всеми). Это более подробно описано ниже.

Описанные здесь мутанты, полученные замещением в РS4, могут быть использованы для любой подходящей цели. Предпочтительно они могут быть использованы для целей, для которых подходит исходный фермент. В частности они могут быть использованы в любом применении, для которого используется экзомальтотетраогидролаза. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления они обладают дополнительным преимуществом более высокой термостабильности, или более высокой экзоамилазной активности, или более высокой рН стабильности, или любой их комбинации. Примеры подходящих применений PS4-вариантных полипептидов и нуклеиновых кислот включают производство продовольствия, в частности выпекание хлеба, а также производство кормовых продуктов; дополнительные примеры подробно представлены ниже.

PS4-вариантные полипептиды могут включать одну или несколько мутаций в дополнение к представленным выше положениям. Это могут быть одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь или более мутаций, предпочтительно замещений в дополнение к уже представленным мутациям. Также могут быть другие мутации, такие как делеции, инсерции, замещения, трансверсии, транзиции и инверсии, в одном или нескольких других положениях. Кроме того, для PS4-вариантов нет необходимости содержать все замещения в перечисленных положениях. В действительности у них могут отсутствовать одно, два, три, четыре или пять замещений, т.е. аминокислотный остаток дикого типа присутствует в таких положениях.

PS4-вариантные полипептиды на основе последовательностей дикого типа

В вариантах осуществления, где исходный полипептид включает последовательность дикого типа, PS4-вариантные полипептиды могут содержать последовательность дикого типа, но с мутацией в одном или нескольких положениях 121, 161 и 223, предпочтительно 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E или 223K, предпочтительнее G121F, G121Y, G121W, S161A, G223E или G223K.

PS4-вариантные полипептиды могут содержать последовательность дикого типа или последовательности, представленные в предыдущем абзаце, но с мутацией в любом одном или нескольких положениях 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 или 353, предпочтительно 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q или 353T, предпочтительнее 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P или 353T.

PS4-вариантные полипептиды могут содержать последовательность дикого типа или последовательность, представленную в двух предыдущих параграфах, но с мутацией в любом одном или нескольких положениях 26, 70, 145, 188, 272 или 339, предпочтительно 26Е, 26D, 70D, 145D, 188S, 188T, 188H, 272Q, 339A или 339Е, предпочтительнее N26E, N26D, G70D, N145D, G188S, G188T, G188H, H272Q, W339A или W339E.

В целом любая комбинация положений, замещений и специфических мутаций может быть скомбинирована любым способом и в любом количестве для получения PS4-вариантных полипептидов, раскрытых в данной работе.

Таким образом, авторы раскрывают PS4-вариантные полипептиды, основанные на исходной последовательности PS4 дикого типа, предпочтительно на немальтогенной экзоамилазе Pseudomonas saccharophilia, имеющей последовательность, представленную как SEQ ID NO:1. Таким образом, PS4-вариантные полипептиды могут содержать последовательность, представленную как SEQ ID NO:1, но с любой одной или несколькими мутациями в положениях, представленных выше. PS4-вариантные полипептиды также могут быть основаны на последовательности немальтогенного фермента Pseudomonas stutzeri дикого типа, представленной как SEQ ID NO:7 ниже, но с любой одной или несколькими мутациями в положениях, представленных выше.

Хотя PS4-вариантные полипептиды могут быть основаны на исходных последовательностях PS4-дикого типа, в предпочитаемых вариантах осуществления PS4-вариантные полипептиды основаны на сконструированных генной инженерией (или мутированных) версиях исходных последовательностей PS4-дикого типа. Следовательно, такие варианты осуществления, исходные последовательности включают уже мутированные PS4-последовательности. Такие последовательности могут быть сделаны заново (de novo) или мутированием базовой последовательности, один или несколько раз, как описано более детально ниже.

Положения 121, 161 и/или 223

PS4-вариантный полипептид может содержать последовательность дикого типа или мутантную последовательность, являющуюся вариантом последовательности дикого типа, такую, как уже мутированная последовательность, с замещениями в еще одном из положений, таких как 121, 161 и 223.

Таким образом, в основном объект мутации или мутаций в соответствующем положении или положениях может быть выгодно скомбинирован с одиночной дополнительной мутацией в одном, двух или всех положениях 121, 161 или 223.

Замещение в положении 121 в случае, когда присутствует, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из 121F, 121Y, 121W, 121H, 121A, 121M, 121G, 121S, 121T, 121D, 121E, 121L, 121K и 121V. Предпочтительно, замещение в положении 121 представляет собой 121F, 121Y или 121W. Замещение в положении 161 в случае, когда присутствует, предпочтительно представляет собой 161А, более предпочтительно S161A. В случае, когда положение 161 мутируют, дополнительная мутация в положении 160 также может присутствовать, предпочтительно 160D, более предпочтительно Е160D.

Замещение в положении 223 в случае, когда присутствует, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из 223K, 223Е, 223V, 223R, 223A, 223P и 223D. Предпочтительно, замещение в положении 223 представляет собой 223E или 223K. В особенно предпочтительных вариантах осуществления дополнительное замещение или замещения выбраны из группы, состоящей из G121F, G121Y, G121W, 161A, 223E и 223K.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления PS4-вариантный полипептид содержит, по меньшей мере, три следующих замещения: 121F/Y/W, 161A, 223E/K. Могут быть включены другие мутации, представленные ниже.

Положения 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 и 353

PS4-вариантный полипептид может содержать последовательность дикого типа или мутантную последовательность, являющуюся вариантом последовательности дикого типа, такую, как уже мутированная последовательность - включающая PS4-вариантный полипептид, имеющий мутацию в одном или нескольких положениях 121, 161 и 223 - с замещениями еще в одном из положений, таких как положения 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 и 353.

Положения 26, 70, 145, 188, 272 и 339

PS4-вариантный полипептид может содержать последовательность дикого типа или мутантную последовательность, являющуюся вариантом последовательности дикого типа, такую, как уже мутированная последовательность - включающая PS4-вариантный полипептид, имеющий мутацию в одном или нескольких положениях 121, 161, 223, 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 и 353 - с замещениями еще в одном из положений, таких как положения 26, 70, 145, 188, 272 и 339.

Таким образом, обычно объект мутации или мутаций в соответствующем положении или положениях можно выгодно комбинировать с одиночной дополнительной мутацией в одном, двух или всех положениях 26, 70, 145, 188, 272 и 339.

PS4-вариантный полипептид может содержать замещение в положении 26, предпочтительно 26Е или 26D. Более предпочтительно замещение в положении 26 включает N26E или N26D. Наиболее предпочтительно замещение в положении 26 включает N26E.

PS4-вариантный полипептид может содержать замещение в положении 70, предпочтительно 70D. Предпочтительнее замещение в положении 70 включает G70D.

PS4-вариантный полипептид может содержать замещение в положении 145, предпочтительно 145D. Предпочтительнее замещение в положении 145 включает N145D.

PS4-вариантный полипептид может содержать замещение в положении 188, предпочтительно 188S, 188T или 188H. Предпочтительнее замещение в положении 188 включает G188S, G188T или G188H. Наиболее предпочтительно замещение в положении 188 включает G188S или G188H.

PS4-вариантный полипептид может содержать замещение в положении 272, предпочтительно 272Q. Предпочтительнее замещение в положении 272 включает H272Q.

PS4-вариантный полипептид может содержать замещение в положении W339A, предпочтительно 339A или 339E. Предпочтительнее замещение в положении 339 включает W339A или W339E.

PS4-вариантные полипептиды на основе вариантных последовательностей

Комбинации с положениями 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 и/или 334

В некоторых вариантах осуществления исходные последовательности содержат мутации в одном или нескольких, предпочтительно во всех, положениях 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 и 334 (и соответственно PS4-вариантные полипептиды будут также содержать относящиеся к делу соответствующие мутации).

В таких вариантах осуществления мутации предпочтительно представляют одну или несколько мутаций, предпочтительно все из следующих: N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L и S334P.

В таких вариантах осуществления PS4-вариантный полипептид можно удобно получить из последовательности немальтогенного фермента Pseudomonas saccharophilia, содержащей последовательность Psac-D34(SEQ ID NO:2).

Комбинации с положениями 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 и 334, 121, 161 и/или 223

PS4-вариантные полипептиды могут дополнительно содержать мутации в любом из положений 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 и 334 в комбинации с мутациями в любом из положений 121, 161 и/или 223. Таким образом, авторы раскрывают PS4-вариантный полипептид, включающий любую комбинацию из: (а) любая одна или несколько мутаций в остатках 33, 34, 121, 134, 141, 157, 178, 179, 223, 307 и 334, предпочтительно N33Y, D34N, G121D, G134R, A141P, I157L, L178F, A179T, G223A, H307L и S334P; (b) любая одна или несколько мутаций в положениях 121, 161 или 223, предпочтительно 121F, 121Y, 121W, 161A, 223E или 223K, предпочтительнее 121F, 161A или 223E, и (с) любая одна или несколько мутаций в положениях 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 или 353, предпочтительно 146G, 146M, 157M, 158T, 158A, 158S, 198W, 198F, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P, 316K, 316Q или 353T, предпочтительнее 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P или 353T.

В некоторых вариантах осуществления авторы предлагают PS4-вариантный полипептид, содержащий все из следующих мутаций, представленных в (а) выше, в комбинации с одной или несколькими мутациями, представленными в (с) выше. В других вариантах осуществления авторы предлагают PS4-вариантный полипептид, содержащий все из дополнительных мутаций, представленных в (а) выше, в комбинации со всеми мутациями, представленными в (b) выше, в комбинации с любой одной или несколькими мутациями, представленными в (с) выше.

PS4-вариантные полипептиды на основе рМD96

В вариантах осуществления, где включены мутации из всех (а) и (b), PS4-вариантный полипептид может быть удобно получен из последовательности немальтогенного фермента Pseudomonas saccharophilia, содержащей последовательность рМD96 (SEQ ID NO:14).

Таким образом, авторы, в частности, предлагают PS4-вариантные полипептиды, представленные в примерах 12-20, имеющие последовательности SEQ ID NO:15-28. Как показано в примерах, каждый из данных полипептидов обладает одним или несколькими улучшенными свойствами по сравнению с исходным полипептидом.

Другие комбинации

Кроме того, также могут быть использованы исходные последовательности, содержащие мутации в других положениях, например, в любом одном или нескольких положениях из 134, 141, 157, 223, 307 и 334. Необязательно, они могут включать мутации либо в одном, либо в обоих положениях 33 и 34.

Таким образом, исходная последовательность может содержать одну или несколько мутаций в положениях, выбранных из группы, состоящей из 134, 141, 157, 223, 307, 334 и необязательно 33 и 34 (и соответственно, конечно, PS4-вариантные полипептиды будут также содержать относящиеся к делу соответствующие мутации).

В некоторых вариантах осуществления исходные полипептиды содержат замещения на аргинин в положении 134, пролин в положении 141 и пролин в положении 334, например G134R, A141P и S334P.

В следующих вариантах осуществления исходный полипептид дополнительно содержит мутацию в положении 121. Исходный полипептид может дополнительно содержать мутацию в положении 178. Он может дополнительно содержать мутацию в положении 179. Он может дополнительно содержать мутацию в положении 87. Соответствующие особенно предпочтительные замещения представляют собой предпочтительно 121D, предпочтительнее G121D, предпочтительно 178F, предпочтительнее L128F, предпочтительно 179T, предпочтительнее A179T, предпочтительно 87S, предпочтительнее G87S.

Остатки в данных положениях могут быть замещены рядом остатков, например, I157V, или I157N, или G223L, или G223I, или G223S, или G223T, или H307I, или H307V, или D34G, или D34A, или D34S, или D34T, или A179V. Однако исходные полипептиды предпочтительно содержат замещения I157L, G223A, H307L, L178F и A179T (необязательно N33Y, D34N).

В особенно предпочтительном варианте осуществления PS4-вариантные полипептиды содержат замещение в любом одном или нескольких положениях 146, 157, 158, 198, 229, 303, 306, 309, 316 и 353, предпочтительно 146G, 157M, 158T, 198W, 229P, 303E, 303D, 306T, 306G, 309P, 316S, 316P или 353T, а также одно или несколько следующих замещений: G134R, A141P, I157L, G223A, H307L, S334P, N33Y и D34N вместе с одним или обоими замещениями L178F и A179T.

PS4-вариантные полипептиды на основе Psac-D20

PS4-варианты могут быть основаны