Определение респондеров на химиотерапию

Определение респондеров на химиотерапию

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, путем определения в биологическом образце сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК. Настоящее изобретение также относится к способам выявления потенциального агента или выбора композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого у пациента, в которых применяют фосфорилированный белок Akt и/или фосфорилированный белок МАПК.

Предпосылки создания изобретения

В развитие злокачественных новообразований у человека обычно вовлекается EGFR, кодируемый геном erbB1. В частности, повышенная экспрессия EGFR наблюдается при раке молочной железы, мочевого пузыря, легких, головы, шеи и желудка, а также при глиобластомах. Рецептор фактора роста эпидермиса (epidermal growth factor receptor - EGFR), гликопротеин молекулярной массой 170 кДа, состоит из N-концевого внеклеточного домена, гидрофобного трансмембранного домена и С-концевого внутриклеточного участка, содержащего домен киназы. EGFR лиганд-индуцированная димеризация активирует внутриклеточный домен RTK (Src-гомологический домен 1, SH1), что приводит к аутофосфорилированию шести специфических тирозиновых остатков EGFR в некаталитическом хвосте цитоплазматического домена.

Клеточные эффекты активации EGFR в раковой клетке индуцируют повышенную пролиферацию, активацию клеточной подвижности, адгезию, инвазию, ангиогенез и повышенное выживание клеток путем ингибирования апоптоза. Активированный EGFR индуцирует пролиферацию опухолевых клеток вследствие стимуляции каскада митоген-активированой протеинкиназы (МАПК). При связывании лиганда с EGFR фактор обмена гуаниновых нуклеотидов SOS привлекается к плазматической мембране посредством адаптерного белка Grb2, который стимулирует замещение ГТФ на ГДФ на малом G-белке Ras, активируя впоследствии каскад МАПК, состоящий из Raf, MEK и ERK. Активированные ERK (рМАПК, pERK1/2) в свою очередь фосфорилируют и активируют факторы транскрипции, например, ELK-1 или с-Мус, стимулирующие клеточный рост.

Многообразные метаболические пути факторов роста способствуют развитию и выживанию клеток немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ) путем активации множественных киназ. EGFR также повышает выживание раковых клеток путем передачи сигнала через фосфатидилинозит-3-киназный (PI3K)/Akt путь и STAT путь. Akt также стимулируется другими факторами роста, включая инсулиновый фактор роста 1, основной фактор роста фибробластов, и интерлейкины 3 и 6. Все три изоформы Akt 1-3 полностью фосфорилированы (рАКТ) сходным образом по остаткам Т308 в активационном домене и S473 в СООН-концевом домене.

Эрлотиниб (продукт Tarceva^®) является сильным ингибитором тирозинкиназы (TKI) рецептора фактора роста эпидермиса (HER1/EGFR), который увеличивает выживаемость у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМКРЛ), у которых предшествующая химиотерапия не дала результатов, при использовании данного препарата в качестве единственного лекарственного средства (WO 01/34574). Эффективность продукта Tarceva^® исследована в различных испытаниях. Его химическое название N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-амин.

В испытании TALENT проведена III фаза плацебо-контролируемого исследования у пациентов с НМКРЛ первой линии терапии, которые получали гемцитабин и цисплатин (эта сопутствующая химиорадиотерапия была нетрадиционным для США лечением) в комбинации с эрлотинибом (продуктом Tarceva^®) в дозе 150 мг/сутки или с плацебо. Основным конечным результатом считалась продолжительность выживания, вторичными конечными результатами были время до прогрессирования, степень ответа, продолжительность ответа, фармакокинетические и фармакодинамические показатели и качество жизни. Также оценивались уровни экспрессии HER1/EGFR и HER2. Был проведен стандартный анализ безопасности. Общий результат испытания TALENT оказался отрицательным. На основании первичных и вторичных результатов не было доказано преимущества эрлотиниба (продукта Tarceva^®) в сочетании с химиотерапией (гемцитабин и цисплатин) по сравнению с лечением только гемцитабином и цисплатином (U.Gatzemeier и др., Proc Am Soc Clin Oncol, 23, 2004. с.617 (Реферат 7010)). Идентичные результаты наблюдались в исследовании TRIBUTE (США) с эрлотинибом в сочетании с карбоплатином и паклитакселом (R.S.Herbst и др., J Clin Oncol, 22, 2004, реферат 7011). В III фазе рандомизированного плацебо-контролируемого исследования единственного агента эрлотиниба в качестве второй или третьей линии терапии немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ) (BR.21; NCIC/OSIP) обнаружено статистически достоверное увеличение выживаемости при лечении эрлотинибом (6,7 месяцев) по сравнению с плацебо (4,7 месяцев).

Различные исследования посвящены изучению биомаркеров при немелкоклеточном раке легкого и их отношению к определенным лекарственным препаратам, ингибирующим EGFR. Han и др., Int J Cancer, 113, 2005. cc.109-115, исследовали 65 пациентов, получавших монотерапию гефитинибом (Iressa™, EGFR TKI). Они анализировали молекулы, ниже EGFR по метаболическому пути, в качестве маркеров прогнозирования ответа на гефитиниб при резистентном к химиотерапии немелкоклеточном раке легкого. F.Cappuzzo и др., JNCI, 96, 2004, cc.1133-1141, исследовали 106 пациентов, получавших монотерапию гефитинибом (Iressa™; EGFR TKI). Они изучали фосфорилирование Akt и эффективность гефитиниба у пациентов с продвинутой формой немелкоклеточного рака легкого и обнаружили, что лечебное действие гефитиниба было выше у пациентов с P-Akt-положительными опухолями, чем у пациентов с P-Akt-отрицательными опухолями. S.Vicent и др., Br J Cancer, 90, 2004, cc.1047-1052, исследовали 111 пациентов с НМКРЛ. Они обнаружили, что при немелкоклеточном раке легкого pERK активирован и связан с прогрессирующими опухолями. S.W.Han и др., J Clin Oncol, 23, 2005, cc.2493-2501, исследовали 90 пациентов, получавших монотерапию гефитинибом (EGFR TKI). Они провели анализ прогнозируемого и прогностического влияния мутации рецептора фактора роста эпидермиса у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, находившихся на лечении гефитинибом. Т.Mukohara и др., Lung Cancer, 41, 2003, cc.123-130, исследовали 60 пациентов, по 20 пациентов на стадию, которые подвергались либо неоадьювантной химиотерапии, либо облучению. Экспрессия EGFR коррелировала с экспрессией pERK и pAkt. Сами авторы указывают, что объем выборки был слишком низким. D.Raben и др., Int J Radiation Oncology Biol. Phys, 59, 2004, cc.27-38, исследовали нацеленную терапию при немелкоклеточном раке легкого. М.Ono и др., Mol Cancer Ther, 3, 2004, cc.465-472, провели оценку 9 клеточных линий НМКРЛ при обработке гефитинибом. F.R.Hirsch и др., Curr Opin Oncol, 17, 2005, cc.118-122, рассматривали состояние фосфорилирования Akt и МАПК в качестве потенциального маркера устойчивости к гематинибу. Meert и др., Clinical Cancer Research, 9, 2003, 2316-2326, исследовали клеточные линии НМКРЛ в плане активности ингибиторов EGFR. Ни уровень экспрессии EGFR, ни уровень экспрессии Her2 не коррелировали с чувствительностью к ингибиторам EGFR. J.Brognard и др., Cell Death and Differentiation, 9, 2002, cc.893-904, провели анализ 19 клеточных линий НМКРЛ, из которых 17 показали фосфорилирование Erk1/2 и конститутивную активность. О.David и др., Clinical Cancer Research, 10, 2004, cc.6865-6871, показали, что сверхэкспрессия pAkt является независимым прогностическим фактором при НМКРЛ. S.Kakiuchi и др., Human Molecular Genetics, 13, 2004, cc.3029-3043, исследовали кДНК-микрочипы генома у 33 пациентов с НМКРЛ. Все пациенты получали гефитиниб в качестве монотерапии. Не было обнаружено доказательств корреляции между уровнем экспрессии Akt/pAkt, состоянием гена EGFR или окрашиванием pEGFR и ответом на гефитиниб. R.H.Kim и др., Cancer Cell, 7, 2005, cc.263-273, обнаружили, что экспрессия онкогена DJ-1 соответствует уровню pAkt. B.R.Balsara и др., Carcinogenesis, 25, 2004, cc.2053-2059, исследовали 110 пациентов с НМКРЛ с экспрессией ТМА pAkt. Не было существенных различий по выживаемости у негативных и позитивных по pAkt пациентов. Y.Hirami и др., Cancer Letters, 214, 2004, cc.157-164, исследовали связь рецептора фактора роста эпидермиса, pAkt и индуцируемого гипоксией фактора-1-альфа при немелкоклеточном раке легкого. S.H.Lee и др., APMIS 110, 2002, cc.587-592, провели анализ 43 метастазов в лимфоузлах у пациентов с НМКРЛ. Активация Akt при НМКРЛ играет большую роль в развитии опухоли, чем в ее прогрессировании. J.A.Engelman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 2004, cc.3788-3793, провели анализ erbB-3 опосредованной активности фосфоинозитид-3-киназы в чувствительных к гефитинибу линиях клеток немелкоклеточного рака легкого. О.David, J Cell Mol Med, 5, 2001, cc.430-433, рассмотрели роль Akt и PTEN в качестве новых диагностических маркеров при раке легкого. A.Mantha и др., Clin. Cancer Res., 11, 2095, cc.2398-2407, исследовали использование в качестве мишени мевалонатного пути, ингибирующего функцию рецептора фактора роста эпидермиса.

Исследовали прогностические маркеры, связанные с EGFR-позитивным раком, в WO 2004/046386. Маркеры генной экспрессии для ответа на лекарственные препараты, являющиеся ингибиторами EGFR, описаны в US 2004/0157255. Биомаркеры и способы определения чувствительности к модуляторам рецептора фактора роста эпидермиса описаны в WO 2004/063709. В WO 01/00245 описывают гуманизированные антитела к ErbB2 и способы лечения рака с применением антител к ErbB2, например, гуманизированных антител к erbB2.

Краткое описание изобретения

По-прежнему существует потребность в способах определения чувствительности к терапии ингибиторами EGFR, в частности при комбинированной терапии ингибитором EGFR с химиотерапевтическим агентом.

Поэтому в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривается способ определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, включающий способ определения сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, при этом сверхэкспрессия фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК указывает на то, что биологический образец, включающий клетки рака легкого человека, является чувствительным к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело, которое связывается с фосфорилированным белком АКТ, или антитело, которое связывается с фосфорилированным белком МАПК, применяют для определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения, предусматривается способ выбора композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого у человека, включающий,

а) раздельную экспозицию аликвот биологического образца, включающего клетки рака легкого, которые чувствительны к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, в присутствии множества тестируемых композиций,

б) сравнение уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвотах биологического образца, подвергавшихся контакту с тестируемыми композициями, и уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с тестируемыми композициями,

в) выбор одной из тестируемых композиций, которая изменяет уровень экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте, содержащей эту тестируемую композицию, по сравнению с аликвотой, не контактировавшей с тестируемой композицией, в котором, по меньшей мере, 10% различие между уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с тестируемой композицией, и уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с тестируемой композицией, является основанием для выбора тестируемой композиции.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ выявления потенциального агента, включающий:

а) контактирование аликвоты биологического образца, содержащего клетки рака легкого, которые чувствительны к ингибитору EGFR и химиотерапевтическому агенту, с потенциальным агентом,

б) определение уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, и определение уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с потенциальным агентом,

в) отслеживание действия потенциального агента путем сравнения уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, и уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с потенциальным агентом,

г) выявление указанного агента по указанному наблюдаемому действию, при котором, по меньшей мере, 10% различие между уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, и уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, указывает на действие потенциального агента.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, предусматриваются потенциальный агент, устанавливаемый согласно способу настоящему изобретения, и фармацевтический препарат, включающий агент, соответствующий настоящему изобретению.

Кроме того, в другом варианте осуществления настоящего изобретения, агент согласно настоящему изобретению применяется для получения композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ получения лекарственного препарата, включающий стадии способа настоящего изобретения и

(i) синтез потенциального агента, установленного на стадии (в), или его аналога, или производного в количестве, достаточном для обеспечения субъекта указанным лекарственным препаратом в терапевтически эффективном количестве, и/или

(ii) соединение потенциального агента, установленного на стадии (в), или его аналога, или производного с фармацевтически приемлемым носителем.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения белок Akt, белок МАПК, фосфорилированный белок Akt, фосфорилированный белок МАПК, антитело, селективно связывающееся с фосфорилированным белком Akt или фосфорилированным белком МАПК, применяют для выявления потенциального агента или для выбора композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого у пациента.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается набор, включающий антитело против фосфорилированного белка МАПК и/или фосфорилированного белка Akt.

Понятие «биологический образец» обычно обозначает какой-либо биологический образец, полученный от индивидуума, из тканевой жидкости, клеточной линии, культуры ткани или другого источника. Тканевыми жидкостями являются, например, лимфа, сыворотка, моча, сперма, синовиальная жидкость и спинномозговая жидкость. В соответствии с настоящим изобретением биологический образец включает клетки рака легкого и раковые клетки, не относящиеся к клеткам легкого (другие клетки). Способы получения биоптатов тканей и тканевых жидкостей млекопитающих хорошо известны в данной области.

Понятие «уровень экспрессии» обычно относится к количеству аминокислотного продукта или белка в образце, предпочтительно к количеству фосфорилированного аминокислотного продукта или фосфорилированного белка в образце согласно настоящему изобретению. Понятие «экспрессия» относится к процессу, посредством которого кодируемая геном информация преобразуется в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке, и включает их фосфорилирование согласно настоящему изобретению. В контексте настоящего изобретения, «экспрессируемые гены» включают таковые, которые транскрибируются в иРНК и затем транслируются в белок и посттрансляционно модифицируются, например, фосфорилируются. Для полноты это понятие также включает экспрессируемые гены, которые транскрибируются в РНК, но не транслируются в белок (например, транспортную или рибосомную РНК). Понятия «сверхэкспрессия» и «недостаточная экспрессия» относятся к отклонению в сторону повышения или понижения относительно уровня экспрессии в образце, используемом в качестве контроля. Следовательно, понятие «сверхэкспрессия» также означает «повышенную экспрессию», а понятие «недостаточная экспрессия» означает «пониженную экспрессию».

Используемое в настоящем описании в общем смысле и в частности понятие «антитело» охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, поливалентные антитела (например, бивалентные), образованные, по меньшей мере, из двух интактных антител, а также фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, полученному из популяции в основном гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются одинаковыми, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что их можно синтезировать незагрязненными другими антителами. Определение «моноклональное» обозначает характер антитела, полученного в основном из гомогенной популяции антител, и не ограничивается необходимостью получения антитела каким-либо определенным методом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным G.Kohler и др. в Nature, 256, 1975, с.495, или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент US 4816567). «Фрагменты антител» включают часть интактного антитела.

Антитело, которое «связывает» антиген, представляющий интерес в соответствии с настоящим изобретением, т.е. фосфорилированный белок МАПК или фосфорилированный белок рАКТ, является таковым, способным связываться с этим антигеном с достаточным сходством, исходя из условия, что антитело пригодно для определения наличия антигена. Антитело по настоящему изобретению является антителом, которое связывает фосфорилированный белок МАПК или фосфорилированный белок рАКТ, обычно оно предпочтительно связывает фосфорилированный белок МАПК или фосфорилированный белок рАКТ в противоположность нефосфорилированному белку МАПК или нефосфорилированному белку рАКТ, или не дает значительной перекрестной реакции с нефосфорилированным белком МАПК или нефосфорилированным белком рАКТ. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения степень связывания антитела с нефосфорилированными белками составляет менее 10%, что было определено с помощью анализа разделения клеток по интенсивности флюоресценции (FACS) или радиоиммунопреципитации (РИП). Другими словами, оно специфически связывает фосфорилированный белок МАПК или фосфорилированный белок рАКТ, и не специфически связывает или не полностью связывает нефосфорилированный белок МАПК или нефосфорилированный белок рАКТ.

«Химиотерапевтический агент» представляет соединение, пригодное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, например, тиотеп и циклофосфамид (продукт CYTOXAN™), алкилсульфонаты, например, бусульфан, импросульфан и пипосульфан, азиридины, например, бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа, этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин, азотистые иприты, например, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлоретаминоксид гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилиприт, нитрозомочевины, например, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, антибиотики, например, аклациномицины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, антиметаболиты, например, метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ), аналоги фолиевой кислоты, например, деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат, аналоги пуринов, например, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, аналоги пиримидинов, например, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-ФУ, андрогены, например, калустерон, дромостанолонпропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, антиадреналины, например, аминоглютетимид, митотан, трилостан, усилители фолиевой кислоты, например, фролиниковая кислота, ацеглатон, альдофосфамидгликозид, аминолевулиновая кислота, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазихинон, элформитин, ацетат эллиптиния, этоглуцид, нитрат галлия, гидроксимочевина, лентинан, лонидамин, митогуазон, митоксантрон, мопидамол, нитракрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, продукт PSK®, разоксан, сизофиран, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазихинон, 2,2,2''-трихлортриэтиламин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, арабинозид («Ara-С»), циклофосфамид, тиотепа, таксаны, например, паклитаксел (продукт TAXOL®, фирма Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси) и доцетаксел (продукт TAXOTERE®, фирма Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Франция), хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, метотрексат, аналоги платины, например, цисплатин и карбоплатин, винбластин, платина, этопозид (VP-16), ифосфамид, митомицин С, митоксантрон, винкристин, винорелбин, навелбин, новантрон, тенипозид, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, СРТ-11, ингибитор топоизомеразы RFS 2000, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, эсперамицины, капецитабин, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные какого-либо из вышеуказанных соединений. Также в это определение включены антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, например, антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон), и антиандрогены, например, флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные какого-либо из вышеуказанных соединений. Сам «химиотерапевтический агент» может представлять комбинацию указанных выше химических соединений, пригодных для лечения рака, т.е. комбинация может представлять гемцитабин/цисплатин, а также, например, цисплатин/паклитаксел, цисплатин/доцетаксел, цисплатин/винорелбин, гемцитабин/карбоплатин или карбоплатин/доцетаксел.

Понятие «ингибитор EGFR» относится к терапевтическому агенту, который связывается с EGFR и, необязательно, ингибирует активацию EGFR. Примеры таких агентов включают антитела и мелкие молекулы, которые связываются с EGFR. Примеры антител, которые связываются с EGFR, включают моноклональные антитела MAb 579 (АТСС CRL НВ 8506), MAb 455 (АТСС CRL НВ8507), MAb 225 (АТСС CRL 8508), MAb 528 (АТСС CRL 8509) (см., US 4943533, Mendelsohn и др.) и их варианты, например, химерный 225 (С225 или цетуксимаб, продукт ERBUTIX®), и реконструированное человеческое антитело 225 (Н225) (см., WO 96/40210), антитела, которые связывают мутантный тип 11EGFR (US 5212290), гуманизированные и химерные антитела, которые связывают EGFR, что описано в US 5891996, человеческие антитела, которые связывают EGFR, например, ABX-EGF (см. WO 98/50433, фирма Abgenix). Антитело против EGFR может быть конъюгировано с цитотоксическим агентом, с образованием, таким образом, иммуноконъюгата (см., например, ЕР 0659439 А2, Merck Patent GmbH). Примеры малых молекул, которые связываются с EGFR, включают ZD1839 или гефитиниб (продукт IRESSA™, фирма Astra Zeneca), CP-358774 (продукт Tarceva®, фирма Genentech/OSI) и AG1478, AG1571 (продукт SU 5271, фирма Sugen). Особо предпочтительными в этой заявке являются ингибиторы тирозинкиназы EGFR, например, особенно ингибиторы тирозинкиназы EGFR с небольшими молекулами, например продукт Tarceva®. «Небольшая молекула» может быть, например, пептидом или пептидомиметиком с молекулярной массой менее примерно 10000 г на моль, предпочтительно менее примерно 5000 г на моль. Предпочтительно «небольшая молекула» является соединением, т.е. органическим или неорганическим соединением, с молекулярной массой менее примерно 5000 г на моль, предпочтительно менее примерно 1000 г на моль, более предпочтительно менее 500 г на моль, и солями, сложными эфирами и другими фармацевтически приемлемыми формами таких соединений. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор EGFR является ингибитором тирозинкиназы EGFR, который является соединением с молекулярной массой менее, примерно, 5000 г на моль, предпочтительно менее примерно 1000 г на моль, и солями, сложными эфирами и другими фармацевтически приемлемыми формами такого соединения. Другими словами, ингибитор EGFR является соединением, которое ингибирует активность тирозинкиназы EGFR и которое имеет молекулярную массу менее примерно 5000 г на моль, предпочтительно менее примерно 1000 г на моль, более предпочтительно менее 500 г на моль, и солями, сложными эфирами и другими фармацевтически приемлемыми формами такого соединения.

«Гемцитабин» является химиотерапевтическим агентом 2',2'-дифтордезоксицитидином (dFdC), который является пиримидиновым аналогом дезоксицитидина, у которого дезоксирибозная часть в 2'-положении содержит два атома фтора (см. V.Heinemann и др., Cancer Res, 48, 1988, с.4024). Он имеется в продаже в качестве продукта Gemzar® от фирмы Eli Lilly and Company, Индианаполис, штат Индиана, США.

«Цисплатин» в контексте этой заявки является химиотерапевтическим агентом цис-диаминодихлорплатиной (см. US 5562925), который коммерчески доступен в качестве продукта Platinol® от фирмы Bristol-Myers Squibb Company, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США. «Цисплатин» является комплексом тяжелого металла, содержащим центральный атом платины, окруженный двумя атомами хлора и двумя молекулами аммиака в цис-положении.

Согласно настоящему изобретению выражение «биологический образец», содержащий клетки рака легкого человека, чувствителен к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента» означает, что биологический образец, содержащий клетки рака легкого человека, чувствителен к лечению комбинацией ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента в противоположность лечению только одним ингибитором рецептора фактора роста эпидермиса. Понятие «чувствительный» также можно понимать в качестве «реагирующего на» или «показывающего реакцию на», особенно такую реакцию, которая оказывает лечебное воздействие на пациента с раком легкого. Таким образом, можно установить является ли пациент с раком легкого чувствительным к лечению комбинацией ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента в противоположность лечению только одним ингибитором рецептора фактора роста эпидермиса. Это означает, что такое лечение будет эффективно для пациента.

Белок "МАПК" является членом высоко консервативного цитозольного семейства серин/треониновых протеинкиназ, известных в качестве митоген-активируемых протеинкиназ (МАПК) или внеклеточных сигнал-регулируемых киназ (ERK). Это семейство белков включает несколько подгрупп. ERK активируются и фосфорилируются по тирозину или треонину в ответ на широкое разнообразие внеклеточных сигналов, включая осмотический стресс, тепловой шок, провоспалительные цитокины, гормоны и митогены. Понятие «белок МАПК» в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к членам семейства белков МАПК, включающего или предпочтительно состоящего из МАПК1 и МАПКЗ. Аминокислотные последовательности МАПК1 (ERK2) представляют (SEQ ID NO:1) и МАПК3 (ERK1) - (SEQ ID NO:2). Эти аминокислотные последовательности кодируются последовательностями иРНК, т.е. кДНК последовательностями SEQ ID NO:3 и 4 для МАПК1 и SEQ ID NO:5 для МАПК 3. Основными участками фосфорилирования в МАПК1 являются Thr-185 и Tyr185 и основными участками фосфорилирования в МАПК3 являются Thr202 и Tyr204. Эти участки фосфорилирования также распознаются антителом, применяемым в настоящем изобретении, т.е. предпочтительно поликлональной сывороткой к фосфорилированным формам МАПК1 и МАПК3.

Понятие «белок Akt» относится к белкам подсемейства Akt/PKB, регулируемым вторичным мессенджером серин/треониновых протеинкиназ, который представлен тремя членами, обозначаемыми Akt1/PKB-альфа, Akt2/РКВ-бета (S.P.Staal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1987, cc.5034-5037) и Akt3/РКВ-гамма (K.Nakatani и др., Biochem. Biophys. Res. Comm., 257, 1999, cc.906-910; US 6881555), соответственно. Изоформы являются гомологичными и активируются путем фосфорилирования в ответ на сигнал фосфатидилинозит-3'-ОН-киназы (PI3K). Метаболический путь PI3K/Akt/PKB, по-видимому, важен для регулирования клеточного выживания/клеточной гибели (H.Dudek и др., Science, 275, 1997, cc.661-665), а также для онкогенеза. Понятие «белок Akt» в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к членам семейства белков Akt, включающего или предпочтительно состоящего из Akt1, Akt2 и Akt3. Фосфорилирование Akt1/PKB-альфа происходит по двум участкам Thr³⁰⁸ и Ser⁴⁷³ (R.Meier и др., J. Biol. Chem., 272, 1997, cc.30491-30497). Эквивалентные участки фосфорилирования находятся в Akt2/PKB-бета (Thr³⁰⁹ и Ser⁴⁷⁴) и Akt3/PKB-гамма (Thr³⁰⁵ и Ser⁴⁷²). Понятие «фосфорилированный белок Akt» относится к фосфорилированному белку «Akt», предпочтительно фосфорилированному на указанных выше участках. Понятие «белок МАПК» в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к членам семейства белков МАПК, включающего или предпочтительно состоящего из МАПК1 и МАПК3. Akt 1 также известен в качестве серин/треониновой протеинкиназы человека RAC-alpha (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-альфа), протеинкиназы В (РКВ) (С-АКТ) и аминокислотная последовательность Akt 1 представляет последовательность SEQ ID NO:6. AKT2 также известен в качестве серин/треониновой протеинкиназы человека RAC-бета (ЕС 2.7.1.37) (RAC-PK-бета), протеинкиназы Akt-2 или протеинкиназы В, бета (РКВ бета), и аминокислотная последовательность Akt 2 представляет последовательность SEQ ID NO:7. AKT3 также известен в качестве серин/треониновой протеинкиназы человека RAC-гамма (ЕС 2.7.1.37) (RAC-PK-гамма), протеинкиназы Akt-3 или протеинкиназы В, гамма (РКВ гамма) (STK-2), и аминокислотная последовательность Akt 3 представляет последовательность SEQ ID NO:8.

Подробное описание изобретения

Традиционные методы молекулярной биологии и химии нуклеиновых кислот, которые находятся в пределах компетентности в данной области техники, описаны в литературе. См., например, J.Sambrooket и др. «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1989, «Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach», под ред. M.J.Gait, IRL Press, 1984, «Nucleic Acid Hybridisation - A Practical Approach», под ред. B.D Hames и S.J.Higgins, IRL Press, 1985, и серии «Methods in Enzymology», Academic Press, Inc., все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок. Все указанные в настоящем описании патенты, заявки на патенты и публикации, которые приведены выше и ниже, включены в настоящее описание в качестве ссылок.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, включающий определение сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, при этом сверхэкспрессия фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК указывает на то, что биологический образец, включающий клетки рака легкого человека, является чувствительным к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента.

Предпочтительно в способе по настоящему изобретению сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце выявляют следующим путем:

а) определением в биологическом образце уровня экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК,

б) определением уровня экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, включающем клетки рака легкого человека, которые не чувствительны к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента,

в) выявлением разницы уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), в соответствии с чем выявляют сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК.

Предпочтительно разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет по меньшей мере 10%. Более предпочтительно, разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет по меньшей мере 25%. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет по меньшей мере 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500% или 1000%. Разница уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), может достигать 10000 или 50000%. Разница уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет предпочтительно от 10% до 10,000%, более предпочтительно 25%-10000%, 50%-10000%, 100%-10000%, еще более предпочтительно 25%-5000%, 50%-5000%, 100%-5000%.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, биологический образец представлен первичной опухолью легкого или метастазом (местным или отдаленным), который может быть получен, например, путем биопсии легкого или путем биопсии других органов. Метастаз может быть представлен также отдаленным метастазом, например, в печень или лимфоузел. Следует отметить, что такой отдаленный метастаз также содержит клетки рака легкого, поскольку метастазы происходят от легкого.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения рак представлен другим раком, отличным от рака легкого, например, раком поджелудочной железы. Однако пригодны также и другие раки в виде солидных опухолей, например, рак яичника, колоректальный рак, рак головы и шеи, почечно-клеточная карцинома, глиома и раки желудочно-кишечного тракта, особенно рак желудка.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения ингибитор EGFR представлен ингибиторами тирозинкиназы EGFR, особенно ингибиторами тирозинкиназы EGFR с небольшими молекулами, например, препаратом Tarceva^®. Следовательно, другими словами, в особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитором EGFR является эрлотиниб