Апоптотическая чувствительность к apo2l/trail путем тестирования экспрессии galnac-t14 в клетках/тканях

Апоптотическая чувствительность к apo2l/trail путем тестирования экспрессии galnac-t14 в клетках/тканях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По этой заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США номер 60/708677, поданной 16 августа 2005, и по предварительной заявке США номер 60/808076, поданной 24 мая 2006, содержания которых включены здесь в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Описанные здесь изобретения относятся к способам и анализам для выявления биомаркеров, прогнозирующих чувствительность клеток млекопитающих к Apo2L/TRAIL и/или антителам-агонистам рецепторов смерти. Более конкретно, представленные здесь изобретения относятся к способам и анализам, которые выявляют молекулы, связанные с семейством белков GalNac-T, которые прогнозируют чувствительность злокачественных клеток млекопитающих к Apo2L/TRAIL или антителам-агонистам рецепторов смерти, таким как антитела-агонисты DR4 или DR5.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В уровне техники были идентифицированы различные лиганды и рецепторы, принадлежащие к суперсемейству факторов некроза опухоли (TNF). В число таких лигандов включены фактор некроза опухоли альфа («TNF-альфа»), фактор некроза опухоли бета («TNF-бета» или «лимфотоксин-альфа»), лимфотоксин бета («LT-бета»), лиганд CD30, лиганд CD27, лиганд CD40, лиганд OX-40, лиганд 4-1BB, LIGHT, лиганд Apo-1 (также называемый Fas лигандом или лигандом CD95), лиганд Apo-2 (также называемый Apo2L или TRAIL), лиганд Apo-3 (также называемый TWEAK), APRIL, лиганд OPG (также называемый RANK лигандом, ODF или TRANCE), и TALL-1 (также называемый BlyS, BAFF или THANK) (См., например, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, страницы 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633, опубликована 16 января 1997; WO 97/25428, опубликована 17 июля 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO 98/28426, опубликована 2 июля 1998; WO 98/46751, опубликована 22 октября 1998; WO 98/18921, опубликована 7 мая 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).

Индукция различных клеточных ответов, опосредованных такими лигандами семейства TNF, обычно начинается с их связывания со специфическими клеточными рецепторами. Некоторые, но не все, лиганды семейства TNF связываются с «рецепторами смерти» клеточной поверхности и посредством этого индуцируют различную биологическую активность, для активации каспаз, или ферментов, которые осуществляют процессы клеточной гибели или апоптоз (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997). В число представителей суперсемейства рецепторов TNF, идентифицированных к настоящему времени, включены TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (также называемый Apo-1 или CD95), DR4 (также называемый TRAIL-R1), DR5 (также называемый Apo-2 или TRAIL-R2), DcR1, DcR2, остеопротегерин (OPG), RANK и Apo-3 (также называемый DR3 или TRAMP) (см., например, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, страницы 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417563, опубликованную 20 марта 1991; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)).

Большинство из этих представителей семейства рецепторов TNF имеют общую характерную структуру рецепторов клеточной поверхности, включая внеклеточные, трансмембранные и внутриклеточные области, тогда как другие встречаются в природе в виде растворимых белков, лишенных трансмембранного и внутриклеточного домена. Внеклеточная часть характерных TNFR содержит повторяющуюся структуру аминокислотной последовательности множественных доменов, богатых цистеином (CRD), начиная с NH₂-конца.

Лиганд, называемый Apo-2L или TRAIL, был обнаружен несколько лет назад как представитель TNF семейства цитокинов (см., например, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; патент США 5763223, выданный 9 июня 1998; патент США 6284236, выданный 4 сентября 2001). Полная длина нативной последовательности Apo2L/TRAIL полипептида человека составляет в длину 281 аминокислоту, II тип трансмембранного белка. Некоторые клетки могут продуцировать природную растворимую форму этого полипептида посредством ферментативного расщепления внеклеточной области этого полипептида (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Кристаллографические исследования растворимых форм Apo2L/TRAIL демонстрируют гомотримерную структуру, сходную со структурами TNF, и других родственных белков (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Однако было обнаружено, что Apo2L/TRAIL, в отличие от других представителей семейства TNF, обладает уникальной структурной особенностью в том, что три остатка цистеина (в положении 230 каждой субъединицы в гомотримере) вместе координируют атом цинка и что связывание цинка является важным для стабильности триммера и биологической активности (Hymowitz et al., supra; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).

В литературных источниках сообщалось, что Apo2L/TRAIL может играть роль в модуляции иммунной системы, включая аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит [см., например, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].

Также сообщалось, что растворимые формы Apo2L/TRAIL индуцируют апоптоз в различных злокачественных клетках, в том числе в опухолях кишечника, легких, груди, предстательной железы, мочевого пузыря, почек, яичников и головного мозга, а также меланоме, при лейкозе и множественной миеломе (см., например, Wiley et al., supra; Pitti et al., supra; патент США 6030945, выданный 29 февраля 2000; патент США 6746668, выданный 8 июня 2004; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). In vivo исследования на мышиных моделях опухолей дополнительно дают возможность предположить, что Apo2L/TRAIL, отдельно или в сочетании с химиотерапией или лучевой терапией, может оказывать значительные противоопухолевые воздействия (см., например, Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., supra; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); заявку РСТ US/00/15512; заявку РСТ US/01/23691). В отличие от многих типов злокачественных клеток, у человека большинство нормальных клеточных типов являются резистентными к индукции апоптоза под действием определенных рекомбинантных форм Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra). Jo et al. сообщал о том, что растворимая форма Apo2L/TRAIL, меченая полигистидином, индуцировала апоптоз in vitro в нормальных выделенных гепатоцитах человека, но не в гепатоцитах, не принадлежащих человеку (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); см. также Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Считается, что некоторые рекомбинантные препараты Apo2L/TRAIL могут варьировать, исходя из биологических свойств и биологических активностей в отношении патологических клеток по сравнению с нормальными, в зависимости, например, от наличия или отсутствия таг-молекулы, содержания цинка и % содержания тримера (См., Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).

Было обнаружено, что Apo2L/TRAIL связывается по меньшей мере с пятью различными рецепторами. По меньшей мере два из рецепторов, которые связывают Apo2L/TRAIL, содержат функциональный, цитоплазматический домен смерти. Один такой рецептор был назван «DR4» (и, альтернативно, TR4 или TRAIL-R1) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); см. также WO 98/32856, опубликованную 30 июля 1998; WO 99/37684, опубликованную 29 июля 1999; WO 00/73349, опубликованную 7 декабря 2000; US 2003/0036168, опубликованную 20 февраля 2003; US 6433147, выданный 13 августа 2002; US 6461823, выданный 8 октября 2002, и US 6342383, выданный 29 января 2002).

Другой рецептор для Apo2L/TRAIL был назван DR5 (альтернативно он также был назван Apo-2; TRAIL-R или TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER) (см., например, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), WO 98/51793, опубликованную 19 ноября 1998; WO 98/41629, опубликованную 24 сентября 1998; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986, опубликованную 20 августа 1998; EP 870827, опубликованную 14 октября 1998; WO 98/46643, опубликованную 22 октября 1998; WO 99/02653, опубликованную 21 января 1999; WO 99/09165, опубликованную 25 февраля 1999; WO 99/11791, опубликованную 11 марта 1999; WO 03/042367, опубликованную 22 мая 2003; WO 02/097033, опубликованную 5 декабря 2002; WO 03/038043, опубликованную 8 мая 2003; US 2002/0072091, опубликованную 13 августа 2002; US 2002/0098550, опубликованную 7 декабря 2001; US 6313269, выданный 6 декабря 2001; US 2001/0010924, опубликованную 2 августа 2001; US 2003/01255540, опубликованную 3 июля 2003; US 2002/0160446, опубликованную 31 октября 2002, US 2002/0048785, опубликованную 25 апреля 2002; US 2004/0141952, опубликованную 22 июля 2004; US 2005/0129699, опубликованную 16 июня 2005; US 2005/0129616, опубликованную 16 июня 2005; US 6342369, выданный в феврале 2002; US 6569642, выданный 27 мая 2003, US 6072047, выданный 6 июня 2000, US 6642358, выданный 4 ноября 2003; US 6743625, выданный 1 июня 2004). Подобно DR4, сообщалось, что DR5 содержит цитоплазматический домен смерти и способен передавать сигнал апоптоза при связывании с лигандом (или при связывании с молекулой, такой как антитело-агонист, которое имитирует активность этого лиганда). Кристаллическая структура комплекса, образованного между Apo-2L/TRAIL и DR5, описана у Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

При связывании с лигандом как DR4, так и DR5 могут запускать апоптоз, независимо вовлекая и активируя инициатор апоптоза, каспазу-8 посредством молекулы-адаптора, содержащей домен смерти, названной FADD/Mort1 [Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)].

Сообщалось, что Apo2L/TRAIL также связывается с рецепторами, называемыми DcR1, DcR2 и OPG, которые предположительно функционируют как ингибиторы, а не трансдукторы передачи сигнала (см., например, DCR1 (также называемый TRID, LIT или TRAIL-R3) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); и Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998); DCR2 (также называемый TRUNDD или TRAIL-R4) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)], и OPG [Simonet et al., supra]. В отличие от DR4 и DR5, рецепторы DcR1 и DcR2 не дают сигнала к апоптозу.

В литературных источниках сообщалось об определенных антителах, которые связываются с рецепторами DR4 и/или DR5. Например, анти-DR4 антитела к рецептору DR4 и обладающие агонистической или апоптотической активностью в некоторых клетках млекопитающих описаны, например, в WO 99/37684, опубликованной 29 июля 1999; WO 00/73349, опубликованной 12 июля 2000; WO 03/066661, опубликованной 14 августа 2003. Также, см., например, Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); WO 02/097033, опубликованную 2 декабря 2002; WO 03/042367, опубликованную 22 мая 2003; WO 03/038043, опубликованную 8 мая 2003; WO 03/037913, опубликованную 8 мая 2003; US 2003/0073187, опубликованную 17 апреля 2003; US 2003/0108516, опубликованную 12 июня 2003. Также были описаны некоторые анти-DR5 антитела, см., например, WO 98/51793, опубликованную 8 ноября 1998; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., “An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice”, Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada; WO 03/038043, опубликованную 8 мая 2003; WO 03/037913, опубликованную 8 мая 2003; US 2003/0180296, опубликованную 25 сентября 2003. Кроме того, были описаны некоторые антитела, обладающие перекрестной реактивностью в отношении как DR4, так и DR5 рецепторов (см., например, патент США 6252050, выданный 26 июня 2001).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описанное здесь изобретение относится к способам и анализам для исследования экспрессии одного или нескольких биомаркеров в образце ткани млекопитающих или клеточном образце, в которых экспрессия одного или нескольких таких биомаркеров прогнозирует чувствительность образца ткани или клеточного образца к таким агентам, как Apo2L/TRAIL или антителам-агонистам к DR5. В различных вариантах осуществления этого изобретения способы и анализы исследования экспрессии молекул в GalNac-T семействе белков, в частности GalNAc-T14 или GalNAc-T3.

Как рассматривалось выше, у человека большинство нормальных клеточных типов проявляет резистентность к индукции апоптоза под действием некоторых рекомбинантных форм Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra). Также было отмечено, что некоторые популяции патологических типов клеток человека (например, некоторые популяции злокачественных клеток) являются резистентными к индукции апоптоза под действием некоторых рекомбинантных форм Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 1999, supra; Walczak et al., Nature Med., 1999, supra). Следовательно, исследуя образец ткани млекопитающего или клеточный образец на экспрессию выбранных биомаркеров путем анализа, можно удобно и эффективно получить информацию, полезную для оценки соответствующих или эффективных способов лечения пациентов. Например, информация, полученная в результате анализа, направленного на выявление экспрессии GalNac-T14 в образце ткани или клеточном образце млекопитающего, может предоставить лечащему врачу полезные сведения, которые могут быть использованы для определения оптимальной схемы лечения (с использованием Apo2L/TRAIL или антител-агонистов рецепторов смерти) для пациентов, страдающих таким заболеванием, как рак, или заболеванием, связанным с иммунной системой, таким как аутоиммунное заболевание.

Изобретение относится к способам прогнозирования чувствительности образца ткани или клеток млекопитающих (например, злокачественных клеток) к Apo2L/TRAIL или антителу-агонисту рецептора смерти. В некоторых вариантах осуществления способы включают в себя получение образца ткани или клеток млекопитающего и исследование ткани или клетки на экспрессию GalNac-T14. Способы можно проводить в различных форматах, включая анализы, определяющие экспрессию мРНК и/или белка, анализы ферментативной активности и другие, рассмотренные здесь способы. Определение экспрессии GalNac-T14 в указанных тканях или клетках будет прогнозировать то, что такие ткани или клетки будут чувствительными к апоптоз-индуцируемой активности Apo2L/TRAIL и/или антителу рецептора смерти. В необязательных вариантах осуществления ткани или клетки также могут быть исследованы на экспрессию рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2.

Дополнительные способы по изобретению включают в себя способы индукции апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающие в себя стадии получения образца ткани или клеток млекопитающего, исследование ткани или клетки на экспрессию GalNac-T14, и при определении, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует GalNac-T14, воздействие на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством Apo2L/TRAIL или антителом-агонистом рецептора смерти. Стадии в способах исследования экспрессии GalNac-T14 можно проводить в различных аналитических форматах, включая исследования определения экспрессии мРНК и/или белка, ферментативной активности и другие, рассмотренные здесь способы. В необязательных вариантах осуществления способы также включают в себя исследование образца ткани или клеток на экспрессию рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2. Необязательно образец ткани или клеток содержит злокачественную ткань или клетки. Необязательно, образец ткани или клеток содержит клетки немелкоклеточного рака легких, клетки злокачественной опухоли поджелудочной железы, клетки рака груди или клетки неходжкинской лимфомы.

Другие способы по изобретению включают в себя способы лечения заболевания у млекопитающего, такого как заболевание, связанное с иммунной системой, или рак, предусматривающие стадии получения образца ткани или клеток этого млекопитающего, исследование ткани или клеток на экспрессию GalNac-T14, и при определении, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует GalNac-T14, введение указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL или антитела-агониста рецептора смерти. Стадии в этих способах исследования экспрессии одного или нескольких биомаркеров можно проводить в различных аналитических форматах, включая исследование определения экспрессии мРНК и/или белка, ферментативной активности и другие описанные здесь способы. В необязательных вариантах осуществления способы также включают в себя исследование образца ткани или клеток на экспрессию рецепторов DR4, DR5, DcR1, или DcR2. Необязательно способы включают в себя лечение злокачественного заболевания млекопитающего. Необязательно эти способы дополнительно к введению эффективного количества Apo2L/TRAIL и/или антитела-агониста рецептора смерти включают в себя введение указанному млекопитающему химиотерапевтических средств(а) или применение лучевой терапии.

В дополнительных вариантах осуществления упомянутые выше способы могут включать в себя исследование ткани или клеток млекопитающего на экспрессию других GalNac-T молекул, таких как GalNac-T3.

Другие варианты осуществления иллюстрируются в качестве примера следующими пунктами:

1. Способ прогнозирования чувствительности образца ткани или клеток млекопитающего к Apo2L/TRAIL, включающий в себя стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток млекопитающего для выявления экспрессии GalNac-T14, где экспрессия указанной GalNac-T14 прогнозирует чувствительность указанного образца ткани или клеток к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL.

2. Способ по пункту 1, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют путем определения экспрессии мРНК GalNac-T14.

3. Способ по пункту 1, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют с помощью иммуногистохимии.

4. Способ по пункту 1, дополнительно включающий в себя стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

5. Способ по пункту 1, в котором образец ткани или клеток содержит злокачественную ткань или клетки.

6. Способ по пункту 5, в котором указанные злокачественные клетки представляют собой клетки или ткань рака поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

7. Способ индукции апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающих, включающий в себя стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для выявления экспрессии GalNac-T14, и

после выявления экспрессии указанной GalNac-T14 воздействие на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством Apo2L/TRAIL.

8. Способ по пункту 7, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют путем тестирования экспрессии мРНК GalNac-T14.

9. Способ по пункту 7, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют с помощью иммуногистохимии.

10. Способ по пункту 7, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

11. Способ по пункту 7, в котором указанный образец ткани или клеток содержит злокачественную ткань или клетки.

12. Способ по пункту 11, в котором указанные злокачественные клетки представляют собой злокачественные клетки или ткань рака поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

13. Способ по пункту 7, в котором на указанные клетки воздействуют эффективным количеством полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281, представленные на Фиг.1.

14. Способ лечения заболевания у млекопитающего, например заболевания, связанного с иммунной системой, или злокачественного заболевания, включающий в себя стадии:

получения образца ткани или клеток указанного млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для определения экспрессии GalNac-T14, и

после определения экспрессии указанной GalNac-T14 введение указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL.

15. Способ по пункту 14, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют путем определения экспрессии мРНК GalNac-T14.

16. Способ по пункту 14, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют с помощью иммуногистохимии.

17. Способ по пункту 14, дополнительно включающий в себя стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанной ткани или клетке.

18. Способ по пункту 14, в котором образец ткани или клеток содержит злокачественную ткань или клетки.

19. Способ по пункту 18, в котором указанные злокачественные клетки или ткань содержат клетки или ткань рака поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

20. Способ по пункту 14, в котором эффективное количество полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281, представленные на Фиг.1, вводят указанному млекопитающему.

21. Способ по пункту 14, в котором указанному млекопитающему также вводят химиотерапевтическое средство (средства) или применяют лучевую терапию.

22. Способ по пункту 14, в котором указанному млекопитающему также вводят цитокин, цитотоксическое средство или ингибитор роста.

23. Способ по пункту 7, в котором указанный полипептид Apo2L/TRAIL связан с молекулой полиэтиленгликоля.

24. Способ по пункту 14, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL связан с молекулой полиэтиленгликоля.

25. Способ прогнозирования чувствительности образца ткани или клеток млекопитающего к антителам рецептора смерти, включающий в себя стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для определения экспрессии GalNac-T14, где экспрессия указанной GalNac-T14 прогнозирует чувствительность указанного образца ткани или клеток к апоптоз-индуцирующей активности антител к рецептору смерти.

26. Способ по пункту 25, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют путем определения экспрессии мРНК GalNac-T14.

27. Способ по пункту 25, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют с помощью иммуногистохимии.

28. Способ по пункту 25, дополнительно включающий в себя стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

29. Способ по пункту 25, в котором образец ткани или клеток содержит ткань злокачественной опухоли или злокачественные клетки.

30. Способ по пункту 29, в котором указанные злокачественные клетки представляют собой злокачественные клетки или злокачественную ткань опухоли поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

31. Способ по пункту 25, в котором антитела к рецептору смерти представляют собой анти-DR4 или анти-DR5 антитела.

32. Способ индукции апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающих, включающий в себя стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для выявления экспрессии GalNac-T14, и

после выявления экспрессии указанной GalNac-T14 воздействие на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством антитела к рецептору смерти.

33. Способ по пункту 32, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют путем тестирования экспрессии мРНК GalNac-T14.

34. Способ по пункту 32, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют с помощью иммуногистохимии.

35. Способ по пункту 32, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

36. Способ по пункту 32, в котором указанный образец ткани или клеток содержит злокачественную ткань или клетки.

37. Способ по пункту 36, в котором указанные злокачественные клетки представляют собой злокачественные клетки или ткань рака поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

38. Способ по пункту 32, в котором на указанные клетки воздействуют эффективным количеством антитела-агониста DR4 или DR5.

39. Способ по пункту 38, в котором на указанные клетки воздействуют эффективным количеством антитела-агониста DR5, которое связывает рецептор DR5, изображенный на Фиг.3A.

40. Способ лечения заболевания млекопитающего, например, заболевания, связанного с иммунной системой, или злокачественного заболевания, включающий в себя стадии:

получения образца ткани или клеток указанного млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для выявления экспрессии GalNac-T14, и

после определения экспрессии указанной GalNac-T14 введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела к рецептору смерти.

41. Способ по пункту 40, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют путем выявления экспрессии мРНК GalNac-T14.

42. Способ по пункту 40, в котором указанную экспрессию GalNac-T14 исследуют с помощью иммуногистохимии.

43. Способ по пункту 40, дополнительно включающий в себя стадию изучения экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанной ткани или клетке.

44. Способ по пункту 40, в котором образец ткани или клеток содержит злокачественную ткань или злокачественные клетки.

45. Способ по пункту 44, в котором указанные злокачественные клетки или злокачественная ткань содержит клетки или ткань злокачественной опухоли поджелудочной железы, лимфомы или немелкоклеточного рака легких.

46. Способ по пункту 40, где указанному млекопитающему вводят эффективное количество анти-DR4 или DR5 антитела.

47. Способ по пункту 40, где указанному млекопитающему также вводят химиотерапевтическое средство или применяют лучевую терапию.

48. Способ по пункту 40, в котором указанному млекопитающему также вводят цитокин, цитотоксическое средство или ингибитор фактора роста.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1 показана нуклеотидная последовательность кДНК лиганда Apo-2 человека (SEQ ID NO:2) и происходящая из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1). «N» в 447 положении нуклеотидной последовательности используется для обозначения нуклеотидного основания, которое может быть «T» или «G».

На Фиг.2A и 2B показана нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) полной длины DR4 человека и происходящая из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности DR4 человека также описаны у Pan et al., Science, 276:111 (1997).

На Фиг.3A показана последовательность 411 аминокислот (SEQ ID NO:5) DR5 человека, опубликованная в WO 98/51793 19 ноября 1998. В уровне техники известен вариант транскрипционного сплайсинга DR5 человека. Этот вариант сплайсинга DR5 кодирует последовательность 440 аминокислот (SEQ ID NO:6) DR5 человека, показанную на Фиг.3B и 3C, опубликованную в WO 98/35986 20 августа 1998.

На Фиг.3D показаны нуклеотидные последовательности кДНК (SEQ ID NO:7) полной длины DcR1 человека и происходящая из них аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности DcR1 человека (и его отдельные домены) также показаны и описаны в WO 98/58062.

На Фиг.3E показаны нуклеотидные последовательности кДНК (SEQ ID NO:9) полной длины DcR2 человека и происходящая из них аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:10). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности DcR2 человека (и его отдельные домены) также представлены в WO 99/10484.

На Фиг.4A показана нуклеотидная последовательность GalNac-T14 человека (SEQ ID NO:11) и происходящая из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12). Эти последовательности также описаны у Wang et al., BBRC, 300:738-744 (2003).

На Фиг.4B показана нуклеотидная последовательность GalNac-T3 человека (SEQ ID NO:13) и происходящая из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:14). Эти последовательности также описаны у Bennett et al., J. Biol. Chem., 271:17006-17012 (1996).

На Фиг.5 представлена суммарная таблица данных по IC50, полученных при анализе клеточных линий немелкоклеточного рака легких («NSCLC») на чувствительность или резистентность к апоптотической активности Apo2L (+ 0,5% эмбриональная сыворотка теленка «FBS» или 10% FBS) и моноклонального антитела к DR5 «DR5 ab», перекрестно-связанного «XL» или не перекрестно-связанного, + 0,5% эмбриональная сыворотка теленка «FBS» или 10% FBS), измеренную в MTT анализах цитотоксичности.

На Фиг.6 представлена суммарная таблица данных по IC50, полученных при анализе клеточных линий рака поджелудочной железы на чувствительность или резистентность к апоптотической активности Apo2L (+ 0,5% эмбриональная сыворотка теленка «FBS» или 10% FBS) и моноклонального антитела к DR5 «DR5 ab», перекрестно-связанного «XL» или не перекрестно-связанного, + 0,5% эмбриональная сыворотка теленка «FBS» или 10% FBS), измеренную в MTT анализах цитотоксичности.

На Фиг.7 представлена суммарная таблица данных по IC50, полученных при анализе клеточных линий неходжкинской лимфомы («NHL») на чувствительность или резистентность к апоптотической активности Apo2L (+ 10% эмбриональная сыворотка теленка «FBS») и моноклонального антитела к DR5 «DR5 ab», перекрестно-связанного «XL» или не перекрестно-связанного (+ 10% эмбриональная сыворотка теленка «FBS»), измеренную в MTT анализах цитотоксичности.

На Фиг.8 представлено сравнение чувствительности («sen») или резистентности («RES») выбранных клеточных линий NSCLC, рака поджелудочной железы и NHL к антителу DR5 и корреляция с экспрессией GalNac-T14, измеренной по экспрессии мРНК GalNac-T14.

На Фиг.9 представлена гистограмма различных клеточных линий NSCLC, поджелудочной железы и NHL, расположенных (в порядке убывания) по уровням экспрессии образцов мРНК GalNac-T14.

Фиг.10A-D иллюстрируют дифференциальную экспрессию специфических ферментов О-гликозилирования в Apo2L/TRAIL-чувствительных и резистентных линиях злокачественных клеток: (A) вариабельность клеток измеряли после инкубирования с различными дозами Apo2L/TRAIL. IC50 для каждой клеточной линии вычисляли как концентрацию Apo2L/TRAIL, которая дает 50% потерю жизнеспособности. Каждый эксперимент на жизнеспособность повторяли по меньшей мере три раза в присутствии низкой (0,5%) и высокой (10%) концентрации эмбриональной сыворотки теленка. Черные, серые или незаполненные символы обозначают клеточные линии, которые являются наиболее чувствительными, умеренно чувствительными или резистентными к Apo2L/TRAIL, соответственно. (B) уровни экспрессии мРНК ppGalNAcT-14 (набор зондов 219271_at) в клеточных линиях поджелудочной железы и злокачественной меланомы. Клеточные линии распределены по типу ткани и чувствительности к Apo2L/TRAIL. Черные, серые или незаштрихованные столбцы обозначают клеточные линии, как в А. (C) уровни экспрессии мРНК Fut-6 (верхняя панель, набор зондов 211885_x_at) и ppGalNAcT-3 (нижняя панель, набор зондов 203397_s_at) в клеточных линиях колоректального рака. Клеточные линии распределены как в B. Значения P на панелях B и С основаны на критерии Фишера корреляции между чувствительностью клеточной линии (включая высокую и умеренную) и экспрессией мРНК выше порогового значения. (D) Влияние Apo2L/TRAIL на рост прижившихся опухолевых ксенотрансплантатов. Бестимусным мышам «nude», несущим GalNAcT-3/Fut-6-позитивные (левая панель) или GalNAcT-3/Fut-6-негативные (правая панель) опухоли, вводили носитель или Apo2L/TRAIL (60 мг/кг/день внутрибрюшинно в дни 0-4) и наблюдали за размером опухоли (среднее±SE, N=10 мышей на группу).

Фиг.11 иллюстрирует модуляцию конкретных ферментов О-гликозилирования, изменяет чувствительность к Apo2L/TRAIL. (A) клетки Colo205 предварительно инкубировали с ингибитором фермента pan O-гликозилирования бензил-GalNAc (bGalNAc), обрабатывали Apo2L/TRAIL в течение 24 ч и определяли жизнеспособность клеток (DMSO=носитель-контроль). (B) Клетки PSN-1 (карцинома поджелудочной железы) и Hs294T (меланома) трансфектировали каспазой-8 или ppGalNAcT-14 siРНК в течение 48 ч, инкубировали с Apo2L/TRAIL в течение еще 24 ч и определяли жизнеспособность клеток. Дуплексы siРНК против нецелевой последовательности (Dharmacon) использовали в качестве контроля (NTC). (C) клетки DLD-1 колоректальной карциномы трансфектировали ppGalNAcT-3 или Fut-6 siРНК и тестировали, как в B. (D) Клетки HEK293 ко-трансфектировали плазмидами, кодирующими указанные гены в комбинации с ppGalNAcT-14 или векторным контролем. Апоптоз измеряли через 24 ч путем окрашивания Аннексином V (левая панель). Клетки H1569 меланомы трансдуцировали ретровирусом, направляющим экспрессию ppGalNAcT-14 или контрольным ретровирусом; полученные в результате пулы клеточных линий обрабатывали Apo2L/TRAIL в течение 24 ч и определяли жизнеспособность клеток (правая панель). Вестерн блот анализ с использованием анти-FLAG антител применяли для верификации экспрессии меченной эпитопом ppGalNAcT-14.

Фиг.12 иллюстрирует (A) анализ каспазного каскада, индуцированного действием Apo2L/TRAIL. Клетки PSN-1 и DLD-1 трансфектировали siРНК против ppGalNAcT-14 или Fut-6, соответственно, в течение 48 ч. Клетки обрабатывали Apo2L/TRAIL в течение 4 или 8 ч, и клеточные лизаты анализировали с помощью иммуноблоттинга с антителами, специфичными к каспазе-8, Bid, каспазе-9, каспазе-3, или актину в качестве контрольной нагрузки. (B) Клетки PSN-1 трансфектировали ppGalNAcT-14 siРНК как в A, обрабатывали Apo2L/TRAIL в течение 4 ч и определяли ферментативную активность каспаз-3/7 в клеточных лизатах. (C) Анализ Apo2L/TRAIL DISC. Клетки PSN-1 трансфектировали ppGalNAcT-14 siРНК как в A. Добавляли FLAG-Apo2L/TRAIL (1 мг/мл) в течение 0-60 мин, клетки лизировали и подвергали иммунопреципитации анти-FLAG антителом. DISC-ассоциированный FADD, каспазу-8, DR4, и выявляли иммуноблоттингом. (D) Клетки PSN-1 трансфектировали, обрабатывали и подвергали DISC иммунопреципитации как в C, и DISC-ассоциированную ферментативную активность каспазы-8 измеряли, как описано ранее (Sharp et al., J. Biol. Chem., 280:19401 (2005).

Фиг.13 иллюстрирует (A) моносахаридный анализ рекомбинантного DR5 человека (длинный вариант сплайсинга), продуцируемого в клетках CHO, выполненный с помощью HPAEC-PAD (высокоэффективная анионообменная хроматография с импульсным амперометрическим обнаружением). (B) Сравнение последовательностей Apo2L/TRAIL рецепторов человека (DR5 человека длиной 440 а.к. форма «hDR5L», DR5 человека короткая форма 411 а.к. «hDR5S» и hDR4), DR5 мыши или крысы (mDR5), Fas человека (hFas) TNFR1 человека (hTNFR1). Рамки указывают предполагаемые сайты О-гликозилирования. (C) Иммуноблоттинг суммарных клеточных лизатов, соответствующих D. DR5L-5T и DR5S-5T представляют собой конструкции, содержащие 5 замен треонин-на-аланин и DR5L-5T3S и DR5S-5T3S представляют собой конструкции, содержащие 5 замен треонин-на-аланин и три замены серин-на-аланин, соответственно, в остатках, которые являются возможными сайтами О-гликозилирования. (D) HEK293 клетки ко-трансфектировали указанными DR5 конструкциями вместе с вектором или плазмидой ppGalNAcT-14 в течение 48 ч и апоптоз измеряли окрашиванием Аннексином V. (E) уровни экспрессии мРНК для ppGalNAcT-14 (чип Affymetrix, набор зондов 219271_at) в образцах первичных опухолей человека, полученных из злокачественных опухолей кожи (SCC=сквамозно-клеточная карцинома), легких, поджелудочной железы (Panc), груди, яичников (Ov), эндометрия (Endo), мочевого пузыря (Bla, TCC= переходноклеточная карцинома) и NHL (FL=фолликулярная лимфома, DLBCL=диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома). Средние значения экспрессии в образцах указаны серой горизонтальной полосой для каждого класса. Показаны граничные значения 500 и 200 (меланома), соответствующие данным по клеточной линии с Фиг.10B.

Фиг.14 иллюстрирует (A) уменьшение экспрессии мРНК ppGalNAcT-14 или ppGalNAcT-3 в клетках PSN-1 или DLD-1 после 48 ч siРНК нокдауна с помощью Taqman анализа. (B) экспрессию GalNAcT-14 восстанавливают в клетках PSN-1 путем трансфекции пустой плазмиды (Empty), GalNAcT-14 дикого типа (GalNAcT-14) или GalNAcT-14, содержащих молчащие мутации siРНК (GalNAcT-14 si(1)Mut) после siGalNAcT-14 (1) опосредованных нокдауном ppGalNAcT-14. (C) Отрицательная регуляция ppGalNAcT-3 или Fut-6 под действием интерферирующих РНК ингибирует индуцированную Apo2L/TRAIL клеточную гибель в клетках C170 (колоректальный рак). Экспериментальная процедура как в 11C. (Таблица 1) A) Суммарная таблица фенотипов нокдауна под действием siРНК. Клеточные линии, в которых отрицательная регуляция GalNAcT-14 или ppGalNAcT-3 и Fut-6, в результате, приводит к защите от действия Apo2L/TRAIL, обозначены показывающими менее (+) или более 50% (++) защиту по меньшей мере с одним тестируемым олигонуклеотидом siРНК. (0) указывает на отсутствие защиты от Apo2L/TRAIL. (D), (E) После 48 ч нокдауна, указанными siРНК, клетки обрабатывали возрастающими дозами этопозида или стауроспорина (STS) в течение 24 ч и проводили анализ жизнеспособности клеток. (F) Ретровирусную ppGalNAcT-14, гиперэкспрессирующую PA-TU-8902 и пулы клеточных линий PL-45 подвергали анализу на жизнеспособность клеток после обработки Apo2L/TRAIL. Вестерн-блоттинг с использованием анти-FLAG антител показывает ретровирусную экспрессированную ppGalNAcT-14 в этих клетках.

Фиг.15 (A) Вестерн-блоттинг индуцированного Apo2L/TRAIL каскада активации каспазы в клеточных линиях колоректального рака, Colo205, чувствител