Применение ингибиторов пути комплемента для лечения глазных болезней

Применение ингибиторов пути комплемента для лечения глазных болезней

Реферат

Это изобретение относится к ингибированию пути комплемента, в частности к ингибированию Фактора D, у пациентов, страдающих от связанных с глазными болезнями состояний и от болезней, связанных с активацией комплемента, таких как возрастная макулярная дегенерация, диабетическая ретинопатия.

УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Макулярная дегенерация представляет собой клинический термин, который применяется для описания семейства заболеваний, которые характеризуются прогрессирующей потерей центрального зрения, связанной с аномалиями мембраны Бруха, хориоида, невральной сетчатки и/или ретинального пигментного эпителия. В центре сетчатки находится желтое пятно, диаметр которого составляет примерно 1/3-1/2 см. Пятно обеспечивает острое зрение, в особенности в центре (в ямке), потому что колбочки сетчатки имеют более высокую плотность. Кровеносные сосуды, клетки ганглия, внутренний нуклеарный слой и клетки и плексиформные слои повернуты в одну сторону (в отличие от оставшихся, расположенных выше), предоставляя таким образом свету более прямого пути к колбочкам сетчатки. Под сетчаткой располагаются хориоид, набор кровеносных сосудов, вкрапленных в фиброзную ткань, и пигментный эпителий (PE), который покрывает хориоидный слой. Хориоидные кровеносные сосуды обеспечивают питанием сетчатку (в особенности, ее зрительные клетки). Хориоид и PE обнаружены в задней области глаза.

Ретинальные пигментные эпителиальные клетки (RPE), которые составляют PE, продуцируют, хранят и транспортируют множество факторов, которые ответственны за нормальное функционирование и существование фоторецепторов. Эти мультифункциональные клетки транспортируют метаболиты к фоторецепторам из кровотока через хориокапилляры глаза. RPE клетки также функционируют в качестве макрофагов, фагоцитирующих концы внешних сегментов палочек и колбочек сетчатки, которые продуцируются при нормальном течении клеточной физиологии. Разнообразные ионы, белки и вода передвигаются между RPE клетками и внутренним фоторецепторным пространством, и эти молекулы, в конечном счете, воздействуют на метаболизм и выживаемость фоторецепторов.

Возрастная макулярная дегенерация (AMD), самая распространенная макулярная дегенерация, ассоциирована с прогрессирующей потерей остроты зрения в центральном участке поля зрения, изменениями хроматического зрения и аномальной адаптацией к темноте и чувствительностью. Два принципиальных клинических проявления AMD были описаны как сухая, или атрофическая, форма и влажная, или экссудативная, форма. Сухая форма ассоциирована с атрофической клеточной смертью центральной сетчатки или макулы, которая требуется для тонкого зрения, применяемого для таких активностей, как чтение, вождение или распознавание лиц. Примерно у 10-20% таких пациентов с сухой формой AMD заболевание прогрессирует до второй формы AMD, известной как влажная форма AMD. Влажная (неоваскулярная/экссудативная) форма AMD вызвана аномальным ростом кровеносных сосудов перед сетчаткой под макулой и васкулярным просачиванием, приводящим в результате к смещению сетчатки, кровоизлиянию и образованию рубца. Это приводит в результате к ухудшению зрения на период времени, составляющий месяцы и годы. Однако пациенты могут страдать быстрой потерей зрения. Все случаи влажной формы AMD происходят из развитой сухой формы AMD. Влажная форма является причиной 85% случаев слепоты из-за AMD. При влажной форме AMD, поскольку через кровеносные сосуды просачивается жидкость и кровь, образуется рубцовая ткань, которая разрушает центральную сетчатку. Наиболее значительными факторами риска для развития обеих форм заболевания являются возраст и отложение друз, аномальных внеклеточных осадков за ретинальным пигментным эпителием. Друзы вызывают латеральное растяжение монослоя RPE и физическое смещение RPE от его непосредственной системы кровоснабжения, хориокапилляров. Это смещение создает физический барьер, который может воспрепятствовать нормальной диффузии метаболитов и отходов между хориокапиллярами и сетчаткой. Друзы являются признаком осадков, ассоциированных с AMD. Биогенез друз включает дисфункцию RPE, ухудшая гидролиз внешних сегментов фоторецептора и последовательное накопление дебриса. Друзы содержат активаторы комплемента, ингибиторы, фрагменты комплемента, специфичные для активации, и компоненты терминального пути комплемента, включая мембраноатакующий комплекс (MAC или C5b-9), наличие которых предполагает, что фокальная концентрация этих веществ может произвести мощный хемотаксический стимул для лейкоцитов, действующих через каскад комплемента (Killingsworth, et al., (2001) Exp Eye Res 73, 887-96). Недавние исследования включали локальное воспаление и активацию каскада комплемента в стадии их образования (Bok D. Proc Natl Acad Sci (USA). 2005; 102: 7053-4; Hageman GS, et al. Prog Retin Eye Res. 2001; 20: 705-32; Anderson DH, et al. Am J Ophthalmol. 2002; 134: 411-31. Johnson LV, et al. Exp Eye Res. 2001; 73: 887-96). Влажная форма AMD ассоциирована с хориоидальной неоваскуляризацией (CNV) и является сложным биологическим процессом. Патогенез образования нового хориоидального сосуда плохо изучен, но считается, что такие факторы, как воспаление, ишемия и локальное продуцирование ангиогенных факторов, являются важными. Хотя предполагалось, что воспаление играет роль, при этом роль комплемента не выяснялась. Предварительное исследование CNV на мышиной модели показало, что CNV вызвано активацией комплемента (Bora PS, J Immunol. 2005; 174: 491-497). Система комплемента является ключевым компонентом врожденного иммунитета против микробной инфекции и включает группу белков, которые обычно присутствуют в сыворотке в не активном состоянии. Эти белки организованы в три пути активации: классический, лектиновый и альтернативный (V.M. Holers, In Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). Молекулы на поверхности микробов могут активировать эти пути, что приводит в результате к образованию протеазных комплексов, известных как C3-конвертазы. Классический путь представляет собой кальций/магний-зависимый каскад, который обычно активируется при образовании комплексов антиген/антитело. Он также может активироваться зависимым от антитела образом с помощью связывания C-реакционно-способного белка, образующего комплекс с лигандом и с помощью большого количества патогенов, включающих грам-отрицательные бактерии. Альтернативный путь представляет собой магний-зависимый каскад, который активируется с помощью вклада и активации C3 на определенных восприимчивых поверхностях (например, полисахаридах клеточной стенки дрожжей и бактерий, и определенных биополимерных веществах).

Альтернативный путь принимает участие в амплификации активности обоих путей - классического и лектинового (Suankratay, C., ibid; Farries, T.C. et al., MoI. Immunol. 27: 1155-1161(1990)). Активация пути комплемента генерирует биологически активные фрагменты белков комплемента, например C3a, C4a и C5a анафилатоксины и C5b-9 мембраноатакующие комплексы (MAC), которые опосредуют воспалительные реакции посредством вовлечения хемотаксиса лейкоцитов, активации макрофагов, нейтрофилов, тромбоцитов, тучных клеток и эндотелиальных клеток посредством увеличенной васкулярной проницаемости, цитолизиса и повреждения ткани.

Фактор D может быть подходящей мишенью для ингибирования этой амплификации путей комплемента, потому что его концентрация в плазме человека очень низкая (1,8 мкг/мл), и было показано, что он является лимитирующим ферментом активации альтернативного пути комплемента (P.H. Lesavre and HJ. Mϋller-Eberhard. J. Exp.Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401). Было продемонстрировано с применением моделей на животных и в ex vivo исследованиях, что ингибирование активации комплемента является эффективным при лечении симптомов некоторых болезней, например красной волчанки и гломерулонефрита (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568).

С применением анализа полиморфизма отдельных нуклеотидов (SNP) у AMD пациентов было обнаружено, что генетический вариант Фактора H (Y402H) является с высокой степенью ассоциированным с увеличенной заболеваемостью AMD (Zareparsi S, Branham KEH, Li M, et al. Am J Hum Genet. 2005; 77: 149-53; Haines JL, et al. Sci 2005; 208: 419-21). Субъекты, являющиеся или гомозиготными, или гетерозиготными по этой точечной мутации гена Фактора H, составляют 50% случаев AMD. Фактор H является ключевым растворимым ингибитором альтернативного пути комплемента (Rodriguez de Cordoba S, et al. Mol Immunol 2004; 41: 355-67). Он связывается с C3b и, таким образом, ускоряет распад C3-конвертазы альтернативного пути (C3bBb) и действует в качестве кофактора для опосредованной Фактором I протеолитической инактивации C3b. Исследования с гистохимическим окрашиванием показали, что существует одинаковое распределение Фактора H и MAC в области контакта RPE-хориоид. Обнаруженные у пациентов с AMD значительные количества отложений MAC в этой области контакта указывают, что гаплотип Фактора H (Y402H) может обладать ослабленной функцией ингибирования комплемента. Предполагается, что Фактор H (Y402H) может обладать пониженной аффинностью связывания с C3b. Таким образом, он не настолько эффективен, как дикий тип Фактора H в ингибировании активации альтернативного пути комплемента. Это ставит RPE и клетки хориоида в положение постоянного риска атаки комплемента, опосредованной альтернативным путем. Было показано, что отсутствие в плазме Фактора H вызывает неконтролируемую активацию альтернативного пути с использованием C3 и часто других компонентов комплемента, таких как C5. В соответствии с этими полученными данными известно, что уровень Фактора H в плазме уменьшается при курении, которое является известным фактором риска для развития AMD (Esparza-Gordillo J, et al. Immunogenetics. 2004; 56: 77-82).

В настоящее время не существует испытанной лекарственной терапии для сухой формы AMD и не доступно никакое лечение для развитой сухой формы AMD. Для избранных случаев влажной формы AMD может быть эффективен метод, известный как лазерная фотокоагуляция для закрытия протекающих или кровоточащих кровеносных сосудов. К сожалению, лазерная коагуляция не возвращает потерянное зрение, но только замедляет и в некоторых случаях предотвращает дальнейшую потерю зрения. Недавно было показано, что фотодинамичная терапия является эффективной для остановки аномального роста кровеносных сосудов примерно для одной трети пациентов с влажной формой AMD в случае раннего лечения. При использовании Фотодинамичной Терапии Visdyne (PDT) краситель инъецируют в глаз пациента, он накапливается в области протекания сосуда в сетчатке, и под воздействием лазера с низкой энергией он реагирует - закрывает протекающие сосуды. В дополнение к этим двум лазерным методам существует несколько антиангиогенных терапий, направленных на создание конструкций васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) для лечения влажной формы AMD. Однако только 10% подвергнутых лечению пациентов показывают улучшение зрения.

Принимая во внимание эти неадекватные способы лечения влажной формы AMD и тотальное отсутствие доступных способов лечения развитой сухой формы AMD, очевидно, что необходимо создание новых способов лечения этого серьезного заболевания. В нашем изобретении предлагается новый способ лечения этого серьезного заболевания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к ингибиторам комплемента для лечения связанных с глазной болезнью состояний или болезней, таких как возрастная макулярная дегенерация (AMD), диабетическая ретинопатия, ангиогенез, связанный с глазной болезнью (такой как неоваскуляризация, связанная с глазной болезнью, воздействующая на хориоидную, корнеальную или ткань сетчатки), и для лечения других состояний, связанных с глазной болезнью, включающих активацию комплемента. Лечение AMD включает обе формы AMD - влажную и сухую.

Ингибиторы комплемента по настоящему изобретению включают, но не ограничены ими, те, что ингибируют альтернативный путь комплемента, такие как Фактор D, пропердин, Фактор B, Фактор Ba и Фактор Bb, и те, что ингибируют классический путь комплемента, такие как C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9 и C5b-9. Настоящее изобретение также включает применение ингибиторов комплемента в комбинации с другими агентами, такими как антиангиогенные агенты и противовоспалительные агенты, такие как стероиды.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к применению ингибиторов C5aR и C3aR, таких как антитела и выделенные фрагменты, и однодоменные конструкции, а также низкомолекулярные компоненты.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к применению рекомбинантного растворимого белка CRl (TPlO) и к белкам, выделенным из него; к применению молекул, ингибирующих C3 (таких как компстатин, пептидомиметик, который связывается с С3 и ингибирует его активацию); к применению киРНК, которые блокируют синтез C3, C5, FD, фактора P, фактора B.

Эти ингибиторы могут представлять собой, но не ограничены ими, низкомолекулярные химические компоненты, нуклеотиды, пептиды, белки, пептидомиметики и антитела.

Другое воплощение настоящего изобретения включает применение человеческого Фактора H, очищенного из крови человека, или рекомбинантного человеческого Фактора H, вводимого пациентам с помощью внутриглазного введения или с помощью другого клинически эффективного пути введения.

Антитела по настоящему изобретению включают цельные иммуноглобулины, scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2 или dAb. Домены антител включают или VH домен, или VL домен.

Одно воплощение настоящего изобретения представляет собой применение моноклонального антитела, которое связывается с Фактором D и блокирует его способность активировать альтернативный путь комплемента. Такие антитела описаны в WO 01/70818 и US 20020081293, которые введены сюда с помощью ссылки, такие антитела, как моноклональное антитело 166-32, полученное из гибридомы, депонированной в ATCC и обозначенной HB 12476. Настоящее изобретение также включает антитела, которые специфично связываются с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело 166-32. Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут также включать гуманизированные антитела сопутствующей заявки, которая введена сюда с помощью ссылки.

Одно воплощение по настоящему изобретению представляет собой применение моноклонального антитела, которое связывается с компонентом комплемента C5a. Такие антитела включают антитело 137-26, полученное из гибридомы, депонированной в ATCC и обозначенной PTA-3650, и любое антитело, которое специфично связывается с тем же эпитопом, что и антитело 137-26.

Согласно настоящему изобретению ингибитор пути комплемента может вводиться путем (a) парентерального введения; (b) с помощью биосовместимого или биодеградируемого имплантанта с замедленным высвобождением; (c) с помощью имплантации инфузионного насоса; или (d) с помощью локального введения, такого как субконъюнктивальное введение или введение в стекловидное тело. Ингибитор комплемента может также вводиться с помощью парентерального введения, выбранного из перорального введения, энтерального введения и местного введения. Местное введение может включать способы введения с помощью раствора для глазной примочки, глазной мази, глазного щитка или раствора глазных капель.

Кроме того, ингибитор комплемента по настоящему изобретению может вводиться в комбинации с иммуномодулирующим или иммуноподавляющим компонентом.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к введению конструкций нуклеиновой кислоты, которые способны экспрессировать ингибиторы пути комплемента для генной терапии.

Другое воплощение настоящего изобретения включает способ скрининга ингибиторов комплемента, которые применимы в лечении AMD, включая применение модели AMD на стареющих мышах, дифицитных по Ccl-2 или Ccr-2. У этих мышей проявляются гистопатологические изменения, подобные обнаруженным при сухой и влажной форме AMD человека. Эти мыши могут быть подвергнуты лечению ингибиторами комплемента или Фактора H с помощью введения в стекловидное тело. Гистологическое исследование может быть осуществлено для определения защиты от развития AMD у мышей, подвергнутых лечению с помощью тестируемых агентов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Это изобретение не ограничено специальными, описанными в описании изобретения, методами, протоколами, клеточными линиями, векторами или реагентами, потому что они могут варьироваться. Кроме того, применяемая терминология не предназначена только для целей описания конкретных воплощений, и подразумевается, что она не ограничена рамками настоящего изобретения. В описании и формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если только в контексте ясно не оговорено другое, например ссылка на "клетку-хозяин" включает множество таких клеток-хозяев.

Если не определено по-другому, все применяемые технические и научные термины и любые акронимы имеют такие же значения, как и в общепринятом понимании специалистов в данной области изобретения. Здесь описаны приведенные для примера способы, инструменты и вещества, хотя в практической области настоящего изобретения могут применяться любые подобные или эквивалентные описанным здесь способам или веществам.

Все указанные патенты и публикации включены в описание посредством ссылки в допустимой по закону степени для целей описания и определения белков, ферментов, векторов, клеток-хозяев и методов, опубликованных здесь, которые могут применяться по настоящему изобретению. Однако здесь ничего не должно быть истолковано как допущение, что изобретение не дает права датировать более ранним числом такую заявку на основании предыдущего изобретения.

Определения

Термин "вариант аминокислотной последовательности" обозначает полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, которые отличаются в некоторой степени от нативной последовательности полипептида. Обычно варианты аминокислотной последовательности имеют, по меньшей мере, примерно 70% гомологию с нативным полипептидом, или, по меньшей мере, примерно 80% гомологию, или, по меньшей мере, примерно 90% гомологию с нативным полипептидом. Варианты аминокислотной последовательности имеют замены, делеции и/или вставки в определенных положениях внутри нативной аминокислотной последовательности.

Термин "идентичность" или "гомология" определяется как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны с остатком соответствующей последовательности, с которой осуществляется сравнение, после сравнения последовательностей и введения пропусков, если необходимо для достижения максимального процента идентичности для всей последовательности, при этом, не учитывая никаких консервативных замен как часть идентичности. Ни N- или C-концевые удлинения или вставки не должны быть истолкованы как уменьшающие идентичность или гомологию. Способы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны из уровня техники. Идентичность последовательности может быть легко рассчитана известными способами, включающими, но не ограниченными способами, описанными в (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, 30 H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Способы определения идентичности разработаны для получения наибольшего совпадения между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности между двумя последовательностями с использованием компьютерных программ включают, но не ограничены пакетом программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Atschul, S.F. et al., J Molec. Biol. 215: 403-410 (1990). Программа BLAST X общедоступна через NCBI и через другие источники (BLASTManual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. MoI. Biol. 215: 403-410 (1990). Хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана также может применяться для определения идентичности.

Термин "антитело" применяется здесь в широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные, по меньшей мере, из двух интактных антител и фрагментов антител, поскольку они проявляют желаемую биологическую активность.

Термин "моноклональное антитело", как применяется здесь, обозначает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Модификатор "моноклональное" показывает характер антитела, которое получено из, по существу, гомогенной популяции антител, и этот термин не должен быть истолкован, как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые применяются в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены с помощью гибридомного способа, описанного впервые Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены рекомбинантными методами ДНК (см. e.g., U.S. Pat. No. 4,816,567). "Моноклональные антитела" могут быть также выделены из фаговой библиотеки антител с применением методик, описанных, например, у Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991). Моноклональные антитела здесь конкретно включают "химерные" антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи является идентичным или гомологичным соответствующим последовательностям антител, выделенных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как оставшийся участок цепи(ей) является идентичным или гомологичным соответствующей последовательности антител, выделенных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также является идентичным или гомологичным соответствующей последовательности таких фрагментов антител, поскольку они проявляют желаемую биологическую активность (U.S. Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

"Фрагменты антител" включают участок интактного антитела, включающий его антиген-связывающий или вариабельный участок. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител).

"Интактное" антитело представляет собой антитело, которое включает антиген-связывающий вариабельный участок, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут представлять собой нативные последовательности константных доменов (например, человеческие нативные последовательности константных доменов) или их вариант аминокислотной последовательности. Интактное антитело может обладать одной или более эффекторными функциями.

"Эффекторные функции" антитела обозначают такие биологические активности, которые могут быть отнесены к Fc участку (нативная последовательность Fc участка или вариант аминокислотной последовательности Fc участка) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают CIq связывание; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание Fc рецетора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; даун-регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточный рецептор; BCR) и т.д.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей интактные антитела могут быть отнесены к различным "классам". Существует пять главных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на "подклассы" (изотипы), например IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называются α, δ, ε, γ и µ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

"Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" (ADCC) обозначает клеточно-опосредованную реакцию, в которой не специфичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc рецепторы (FcR) (например, Натуральные Киллерные клетки (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и, следовательно, вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. FcR экспрессируется на гемопоэтических клетках. Для определения ADCC активности интересующей молекулы может быть осуществлен in vitro ADCC тест, такой как описанный в U.S. Пат.No. 5500362 или 5821337. Применяемые эффекторные клетки для таких тестов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и Натуральные Киллерные (NK) клетки. Альтернативно или дополнительно, ADCC активность интересующей молекулы может быть определена in vivo, например, в модели животных. Некоторые такие модели являются общедоступными.

Термин "вариабельный" обозначает тот факт, что определенные участки вариабельных доменов существенно отличаются по последовательностям между антителами и применяются для связывания и специфичности каждого конкретного антитела для его конкретного антигена. Однако вариабельность неодинаково распределена по последовательностям вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками, оба - в легкой цепи и вариабельные домены тяжелой цепи. Эти гипервариабельные участки также называются участками, определяющими комплементарность или CDR. Наиболее высококонсервативные участки называются каркасными участками (FR). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелой и легкой цепей включает четыре FR, обычно принимающих конфигурацию β-листа, связанных тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, связывающие и в некоторых случаях образующие часть структуры β-листа. Гипервариабельные участки в каждой цепи посредством FR поддерживаются вместе в близком соседстве и с гипервариабельными участками из другой цепи вносят вклад в образование антиген-связывающего сайта антител (смотри Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Термин "гипервариабельный участок" обозначает аминокислотные остатки антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок обычно включает аминокислотные остатки из "участка, определяющего комплементарность" или "CDR" (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Hl), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 2632 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. MoL Biol. 196:901-917 (1987)). Как здесь определяется, остатки "Каркасного Участка" или "FR" остатки представляют собой такие остатки вариабельного домена, которые отличны от остатков гипервариабельного участка.

Посредством папаинового гидролиза антител получают два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых "Fab" фрагментами, каждый с одним антиген-связывающим сайтом, и остаточный "Fc" фрагмент, чье название отражает его способность легко кристаллизоваться. При обработке пепсином получают F(ab')2 фрагмент, который имеет два антиген-связывающих сайта, и все еще остается способным к перекрестному связыванию антигена.

Fab фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CHI) тяжелой цепи. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов вставкой нескольких остатков в карбокси конец CHl домена тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирного участка антитела. Fab'-SH здесь является обозначением для Fab', в котором цистеиновые остатки константных доменов несут, по меньшей мере, одну свободную тиольную группу. F(ab')2 фрагменты антитела исходно были получены как пары Fab' фрагментов, между которыми располагаются шарнирные цистеины. Также известны другие химические конденсации фрагментов антитела.

"Легкие цепи" антител из любых растительных видов могут быть отнесены к одному из двух совершенно отдельных типов, называемых каппа (K) и лямбда (л), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий сайт. Этот участок состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, которые находятся в плотной, но не ковалентной связи. Они находятся в такой конфигурации, чтобы три гипервариабельных участка каждого гипервариабельного домена взаимодействовали для определения антиген-связывающего сайта на поверхности VH-VL димера. Вместе шесть гипервариабельных участков дают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, включающего только три гипервариабельных участка, специфичных для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя с меньшей аффинностью, чем полный сайт связывания.

"Одноцепочечный Fv" или "scFv" фрагменты антитела включают VH и VL домены антитела, где эти домены присутствуют в виде одной полипептидной цепи. Предпочтительно Fv полипептид дополнительно включает полипептидный линкер между VH и VL доменами, который дает возможность scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. В качестве обзора по scFv смотри Pliickthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994). scFv фрагменты антитела к ErbB2 описаны в WO93/16185; U.S. Пат. No. 5571894; и U.S. Пат. No. 5587458.

Термин "диатела" обозначает короткие фрагменты антитела с двумя антиген-связывающими сайтами, которые включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одну полипептидную цепь (VH-VL). Посредством применения линкера, который слишком короткий, чтобы дать возможность спариться двум доменам на одной и той же цепи, осуществляется принудительное спаривание доменов с комплементарными доменами на другой цепи и создаются два антиген-связывающих сайта. Диатела наиболее полно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; и у Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 90:6444-6448 (1993).

"Однодоменное антитело" является синонимом с "dAb" и обозначает полипептид вариабельного участка иммуноглобулина, где связывание антигена осуществляется с помощью одного домена, содержащего вариабельный участок. Как применяется здесь, "однодоменное антитело" включает i) антитело, включающее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), или его антиген-связывающий фрагмент, который образует антиген-связывающий сайт независимо от любого другого вариабельного домена, ii) антитело, включающее вариабельный домен легкой цепи (VL), или его антиген-связывающий фрагмент, который образует антиген-связывающий сайт независимо от любого другого вариабельного домена, iii) антитело, включающее полипептид, содержащий VH домен, связанный с другим полипептидом, содержащим VH или VL домен (например, VH-VH или VHx-VL), где каждый V домен образует антиген-связывающий сайт независимо от любого другого вариабельного домена, и iv) антитело, включающее полипептид, содержащий VL домен, связанный с другим полипептидом, содержащим VL домен (VL-VL), где каждый V домен образует антиген-связывающий сайт независимо от любого другого вариабельного домена. Как применяется здесь, VL домен обозначает обе формы легких цепей - каппа и лямбда.

"Гуманизированные" формы отличных от человеческих антител (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, выделенную из отличного от человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины, где гипервариабельные участки замещены остатками из гипервариабельного участка из отличных от человека видов, таких как мышь, крыса, кролик или отличный от человека примат, имеющие желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасного участка (FR) человеческого иммуноглобулина замещены на соответствующие, отличные от человеческих остатки. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаружены в человеческом антителе или в отличном от человеческого антителе. Эти модификации осуществляют для дополнительного улучшения характеристик антитела. Обычно гуманизированное антитело включает, по существу, все из, по меньшей мере, одного и обычно из двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все из гипервариабельных петель соответствуют аналогичным последовательностям отличного от человеческого иммуноглобулина и все или, по существу, все из FR представляют собой аналогичные последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также необязательно включает, по меньшей мере, фрагмент константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Примеры методики гуманизации можно обнаружить, например, у Queen et al. U.S. Пат. No. 5585089, 5693761; 5693762; 6180370, которые введены сюда с помощью ссылки.

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ

Антитела по настоящему изобретению могут быть получены с помощью любого подходящего способа, известного из уровня техники. Антитела по настоящему изобретению могут включать поликлональные антитела. Способы получения поликлональных антител известны специалисту в данной области (Harlow, et al., Antibodies: a Laboratory Manual (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), которая, таким образом, полностью введена сюда с помощью ссылки).

Например, антитела могут быть получены путем введения иммуногена, включающего интересующий антиген, различным животным-хозяевам, включающим, но не ограниченным ими, кроликов, мышей, крыс и т.д., для того чтобы индуцировать продуцирование сыворотки, содержащей специфичные к антигену поликлональные антитела. Введение иммуногена может повлечь за собой одну или более инъекций иммунизированного агента и, если желательно, адъюванта. Для повышения иммунологического ответа могут применяться различные адъюванты в зависимости от видов-хозяев и включают, но не ограничены ими, адъювант Фрейнда (полный и не полный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол и потенциально применяемые человеческие адъюванты, такие как BCG (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Дополнительные примеры адъювантов, которые могут применяться, включают MPL-TDM адъювант (монофосфорил липид A, синтетический дикориномиколат трегалозы).

Протоколы иммунизации хорошо известны из уровня техники и могут быть осуществлены с помощью способа, который вызывает иммунный ответ у выбранного животного-хозяина. Адъюванты хорошо известны из уровня техники.

Обычно иммуноген (содержащий или не содержащий адъювант) инъецируют млекопитающему с помощью многократных подкожных или внутрибрюшинных инъекций или иммуноген инъецируют внутримышечно или через IV. Иммуноген может включать антигенный полипептид, сшитый белок или их варианты. В зависимости от природы полипептидов (т.е. процента гидрофобности, процента гидрофильности, стабильности, суммарного заряда, изоэлектрической точки и т.д.) они могут применяться для конъюгации иммуногена с белком, о котором известно, что он является иммуногенным для иммунизируемого млекопитающего. Такая конъюгация включает как химическую конъюгацию путем модификации активных химических функциональных групп с двумя агентами - иммуногеном и иммуногенным белком, чтобы они были конъюгированы так, чтобы образовалась ковалентная связь, так и включает конъюгацию с помощью методики на основе образования сшитого белка, или с помощью других способов, известных специалисту в данной области. Примеры таких иммуногенных белков включают, но не ограничены ими, гемоцианин лимфы улитки, овальбумин, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин, соевый ингибитор трипсина и разные Т-хелперные пептиды. Различны