Способы лечения и профилактики фиброза антагонистами il-21/il-21r

Способы лечения и профилактики фиброза антагонистами il-21/il-21r

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №60/671,374, зарегистрированной 14 апреля 2005 г., которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0002] Настоящее изобретение относятся к способам лечения и профилактики фиброза и состояний, ассоциированных с фиброзом.

Уровень техники

[0003] Повреждение любого органа обычно приводит к физиологической реакции, включающей тромбоцитарный гемостаз с последующим притоком клеток воспаления и активированных фибробластов. Цитокины, продуцируемые этими типами клеток, стимулируют образование нового внеклеточного матрикса и кровеносных сосудов, которые совместно образуют грануляционную ткань. Образование фиброзной ткани является частью нормального полезного процесса заживления, следующего за повреждением; однако фиброз - это состояние, характеризующееся анормальным накоплением коллагенового матрикса после повреждения или воспаления, которое приводит к изменению структуры и функции различных тканей. Прогрессирующий фиброз почек, печени, легких, сердца, костей, костного мозга и кожи является основной причиной смерти или одним из факторов, приводящих к ней.

[0004] Многие заболевания, ассоциированные с пролиферацией фиброзной ткани, являются хроническими и часто ослабляющими здоровье. К таким заболеваниям относятся, например, болезни кожи, такие как склеродерма. Некоторые, включая легочный фиброз, могут быть летальными, поскольку существующие способы лечения дают значительные побочные эффекты и, в целом, не могут эффективно замедлить или остановить прогрессирование фиброза. Соответственно существует постоянная потребность в противофиброзных средствах.

[0005] Рецептор IL-21 (IL-21R) - это недавно открытый член семейства рецепторов цитокинов класса I (Parrish-Novak et al. (2000) Nature 408: 57-63; Ozaki et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 11439-44). Рецептор IL-21 демонстрирует значительную гомологию последовательности и структуры с альфа-цепью рецептора IL-4 (IL-4Ra) и располагается рядом с IL-4Rα в геномах человека и мыши, а его лиганд, IL-21, в значительной степени гомологичен цитокинам IL-2, IL-4 и IL-15 (Sivakumar et al. (2004) Immunology 112: 177-82; Habib et al. (2003) J. Allergy Clin. Immunol. 112: 1033-45). Таким образом, IL-21 и IL-21R благодаря своей гомологии с цитокинами и рецепторами, которым для функциональной сигнализации необходима гамма-цепь (γс), являются недавно описанными членами семейства (γс)-зависимых цитокинов (Vosshenrich and Di Santo (2001) Curr. Biol. 11: R175-77). Поскольку все члены γс семейства играют важные и уникальные роли в иммунной системе хозяина, растет интерес к исследованию новых функций IL-21R в процессе запускаемых антигеном иммунных реакций in vivo.

[0006] Первичные исследования функций IL-21 показали, что IL-21 оказывает антагонистическое воздействие на распространение естественных киллеров (NK-клетки) и в то же время стимулирует Т-клеточный иммунитет, включая противоопухолевый иммунитет (Ма et al. (2003) J. Immunol. 171: 608-15; Kishida et al. (2003) Mol. Ther. 8: 552-58; Di Carlo et al. (2004) /. Immunol. 172: 1540-47). Эти данные позволяют предположить, что IL-21 служит связующим звеном между реакциями врожденного и приобретенного иммунитета (Collins et al. (2003) Immunol. Res. 28: 131-40). IL-21 также регулирует функцию В-клеток и CD8⁺ T-клеток in vivo (Ozaki et al. (2002) Science 298: 1630-34; Suto et al. (2002) Blood 100: 4565-73; Mehta et al. (2003) J. Immunol. 170: 4111-18; Pene et al. (2004) J. Immunol. 172: 5154-57; Jin et al. (2004) J. ImmunoW3: 657-65; Zengetal. (2005) J. Exp. Med. 201: 139-48).

Дополнительные исследования указывают на то, что IL-21 является цитокином Т_Н2, который может ингибировать дифференцировку «необученных» (naive) Т_Н-клеток в Т_Н1-клетки, секретирующие интерферон-гамма (IFN-γ; Wurster et al. (2002) J Exp. Med. 196: 969-77). Действительно, лечение экзогенным IL-21 эффективно ингибирует продукцию IFN-γ, не влияя на другие цитокины, ассоциированные с Т_Н1/Т_Н2, что указывает на высокую специфичность подавления IFN-γ интерлейкином IL-21. Поэтому предполагают, что благодаря своей способности подавлять развитие Т_Н1 клеток IL-21 может стимулировать Т_Н2 ответы (Wurster et al., выше). Тем не менее, участие IL-21R в пути передачи сигналов в ходе Т_Н2 ответа при Т_Н2-зависимых заболеваниях ранее не исследовалось.

[0007] В случая шистосомоза цитокины Т_Н2 играют важную роль в патогенезе заболевания (Wynn (2004) Nat.Rev. Immunol. 4: 583-594; Pearce and MacDonald (2002) Nat.Rev.Immunol. 2: 499-511). В самом деле, все мыши, дефицитные по IL-4/IL-13-, IL-4Rα и Stat6, при заражении S.mansoni демонстрируют значительно ослабленное образование гранулемы и фиброз печени (Chiaramonte et al. (1999) J. Clin. Invest. 104: 777-85; Kaplan et al. (1998) J. Immunol. 160: 1850-56; Jankovic et al. (1999) J. Immunol 163: 337-42; Fallon et al. (2000) J. Immunol. 164: 2585-91). Если учесть, что по современной классификации IL-21 является цитокином Т_Н2 (Wurster et al. (2002), выше; Mehta et al. (2005). Proc. Natl. Acad. Set U.S.A. 102: 2016-21), разительное сходство между рецепторами IL-4 и IL-21 (Sivakumar et al., выше; Habib et al., выше), и важное значение родственных путей передачи сигналов через IL-4Rα/Stat6 в этом заболевании, а также в других воспалительных заболеваниях, направляемых цитокинами Т_Н2 (Wynn (2003) Annu. Rev. Immunol. 21: 425-56), эти исследования порождают важный вопрос: играет ли сигнализация IL-21R важную роль в инициации и/или поддержании Т_Н2 иммунитета.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Настоящее изобретение относится к способам лечения, уменьшения выраженности или профилактики фиброза или состояний, ассоциированных с фиброзом, а также способам поиска (скрининга) соединений и композиций, которые можно применять в таких способах. Настоящее изобретение обеспечивает также способы диагностики, прогнозирования и мониторинга прогрессирования (например, курс лечения) фиброза и/или состояний, ассоциированных с фиброзом. Указанные способы связаны с измерением и/или изменением уровня IL-21 и/или IL-21R (т.е. уровня активности IL-21 и/или IL-21R, уровня экспрессии IL-21 и/или IL-21R (например, уровня продуктов генов IL-21 и/или IL-21R) и/или уровня взаимодействия IL-21 с IL-21R). Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает антагонисты IL-21 или IL-21R для лечения фиброза и/или состояний, ассоциированных с фиброзом.

[0009] В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ лечения, уменьшения выраженности или профилактики фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния у субъекта (например, человека), включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества вещества, которое снижает уровень IL-21 и/или IL-21R у субъекта. В другом варианте реализации указанное вещество представляет собой антагонист IL-21/IL-21R, выбранный из группы, состоящей из антитела против IL-21R (анти-IL-21R антитела), антитела против IL-21, антиген-связывающего фрагмента антитела против IL-21R, антиген-связывающего фрагмента антитела против IL-21 и растворимого фрагмента IL-21R. В еще одном варианте реализации указанное вещество представляет собой растворимый фрагмент IL-21R, и указанный растворимый фрагмент IL-21R содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 1-538 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислот 20-538 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислот 1-235 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислот 20-235 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислот 1-236 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислот 20-236 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислот 1-529 последовательности SEQ ID NO: 5, аминокислот 20-529 последовательности SEQ ID NO: 5, аминокислот 1-236 последовательности SEQ ID NO: 5 и аминокислот 20-236 последовательности SEQ ID NO: 5. В другом варианте реализации настоящего изобретения растворимый фрагмент IL-21R связывает полипептид IL-21.

[0010] В другом варианте реализации указанное вещество представляет собой растворимый фрагмент IL-21R, и указанный растворимый фрагмент IL-21R содержит последовательность аминокислот, по существу идентичную последовательности аминокислот, соответствующей SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 27. В другом варианте реализации настоящего изобретения последовательность аминокислот растворимого фрагмента IL-21R содержит последовательность аминокислот, по существу идентичную последовательности аминокислот, соответствующей SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13. В другом варианте реализации указанное вещество представляет собой растворимый фрагмент IL-21R, и указанный растворимый фрагмент IL-21R кодирует последовательность нуклеотидов, по существу идентичную последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующей SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 26. В другом варианте реализации растворимый фрагмент IL-21R кодирует последовательность нуклеотидов, которая по существу идентична последовательности нуклеиновых кислот, соответствующей SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 16.

[0011] В другом варианте реализации указанное вещество представляет собой растворимый фрагмент IL-21R, и указанный растворимый фрагмент IL-21R содержит внеклеточный домен IL-21R и Fc-фрагмент иммуноглобулина. Еще в одном варианте реализации последовательность аминокислот внеклеточного домена IL-21R содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1-235 последовательности SEQ ID NO: 2 или аминокислотам 20-235 последовательности SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации Fc-фрагмент иммуноглобулина имеет измененную функцию. В еще одном варианте реализации Fc-фрагмент иммуноглобулина имеет последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам 244-467 последовательности SEQ ID NO: 17.

[0012] В другом варианте реализации настоящего изобретения фиброз или ассоциированное с фиброзом нарушение поражает печень, эпидерму, эндодерму, мышцу, сухожилие, хрящ, сердце, поджелудочную железу, легкое, матку, нервную систему, яичко, яичник, надпочечник, артерию, вену, толстую кишку, тонкий кишечник, желчные протоки или желудок. В еще одном варианте реализации фиброз или ассоциированное с фиброзом нарушение представляет собой интерстициальный фиброз легких. В другом варианте реализации фиброз или ассоциированное с фиброзом нарушение является результатом заражения шистосомой. Еще в одном варианте реализации фиброз или ассоциированное с фиброзом нарушение является результатом заживления раны. В другом способе реализации заживающая рана является результатом хирургического иссечения.

[0013] В другом варианте реализации настоящее изобретение включает также введение субъекту по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства. В другом варианте реализации указанный по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из ингибиторов цитокинов, ингибиторов факторов роста, иммунодепрессантов, противовоспалительных агентов, ингибиторов метаболизма, ингибиторов ферментов, цитотоксических средств и цитостатических средств. В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения указанное по меньшей мере одно терапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из антагонистов ФНО (фактора некроза опухолей), анти-ФНО средств (средств, специфичных к ФНО), антагонистов в IL-12, антагонистов IL-15, антагонистов IL-17, антагонистов IL-18, антагонистов IL-22, средств, уменьшающих количество Т-клеток, средств, уменьшающих количество В-клеток, циклоспорина, FK506, CCI-779, этанерцепта, (etanercept), ифликсимаба (infliximab), ритуксимаба (rituximab), адалимумаба (adalimumab), преднизолона (prednisolone), азатиоприна (azathioprine), золота, сульфасалазина (sulphasalazine), гидроксихлорохина (hydroxychloroquine), миноциклина (minocycline), анакинра (anakinra), абатацепта (abatacept), метотрексата (methotrexate), лефлюномида (leflunomide), рапамицина (rapamycin), аналогов рапамицина, ингибиторов Сох-2, ингибиторов cPLA2, нестероидных противовоспалительных препаратов, ингибиторов р38, антагонистов В7.1, В7.2, ICOSL, ICOS и/или CD28 и агонистов CTLA4.

[0014] В другом примере реализации настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации соединения для лечения, уменьшения выраженности или профилактики фиброза или ассоциированного с фиброзом нарушения у субъекта, который включает: (а) измерение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце; (b) приведение представляющих интерес клетки или образца в контакт с соединением; и (с) измерение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце после контакта с указанным соединением, где по более низкому уровню IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце после контакта по сравнению с уровнем IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке и/или образце, которые не приводили в контакт с соединением, идентифицируют указанное соединение как соединение, полезное для лечения, уменьшения выраженности или профилактики фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния у субъекта.

[0015] В другом примере реализации настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации соединения для лечения, уменьшения выраженности или профилактики фиброза или ассоциированного с фиброзом нарушения у субъекта, включающий: (а) измерение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце; (b) приведение представляющих интерес клетки или образца в контакт соединением; (с) измерение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце после контакта с указанным соединением; и (d) сравнение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце после контакта с эталонным уровнем IL-21 и/или IL-21R, где по более низкому, по сравнению с эталонным уровнем IL-21 и/или IL-21R, уровню IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце после контакта идентифицируют исследуемое соединение как соединение, полезное для лечения, уменьшения выраженности или профилактики фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния у субъекта.

[0016] В другом примере реализации настоящее изобретение обеспечивает способ мониторинга прогрессирования фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния у субъекта, который включает: (а) измерение уровня EL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у указанного субъекта, в первый момент времени; и (b) измерение уровня EL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у указанного субъекта во второй момент времени, где более низкий уровень IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у субъекта во второй момент времени, по сравнению с уровнем IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у субъетка в первый момент времени, указывает на уменьшение тяжести фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния.

[0017] В другом примере реализации настоящее изобретение обеспечивает способ прогнозирования течения фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния у субъекта, который включает: (а) измерение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у субъекта в первый момент времени; и (b) измерение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у указанного субъекта во второй момент времени, где более низкий уровень IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у субъекта, во второй момент времени по сравнению с уровнем IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у указанного субъекта в первый момент времени, указывает на снижение вероятности того, что у субъекта разовьется фиброз или ассоциированное с фиброзом состояние, либо вероятности усиления фиброза или ассоциированного состояния у указанного субъекта.

[0018] В другом примере реализации настоящее изобретение обеспечивает способ прогнозирования течения фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния у субъекта, который включает: (а) измерение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у субъекта; и (b) сравнение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у субъекта, с эталонным уровнем IL-21 и/или IL-21R, где более низкий уровень IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у пациента, по сравнению с эталонным уровнем IL-21 и/или IL-21R указывает на пониженную вероятность развития у пациента фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния либо на сниженную вероятность усиления фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния у субъекта.

[0019] В другом примере реализации настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики фиброза или ассоциированного с фиброзом состояния у субъекта, который включает: (а) измерение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у субъекта, и (b) сравнение уровня IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у указанного субъетка, с эталонным уровнем IL-21 и/или IL-21R, где более высокий уровень IL-21 и/или IL-21R в представляющих интерес клетке или образце, взятых у субъекта, по сравнению с эталонным уровнем IL-21 и/или IL-21R указывает на присутствие фиброза и/или ассоциированного с фиброзом состояния у субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0020] На ФИГ.1 приведена полноразмерная последовательность кДНК IL-21R/MU-1 мыши. Последовательность нуклеотидов соответствует нуклеотидам 1-2628 последовательности SEQ ID NO: 4.

[0021] На ФИГ.2А и 2В приведены последовательности аминокислот IL-21R/MU-1 мыши и человека. На ФИГ.2А приведена последовательность аминокислот EL-21R/MU-1 мыши (соответствующая аминокислотам 1-529 последовательности SEQ ID NO: 5). Аминокислоты 1-19 (жирный шрифт) представляют собой лидерную последовательность (предсказана программой SPScan с оценкой 10.1). Предсказанный трансмембранный домен (подчеркнут) обнаружен в области аминокислот 237-253 последовательности SEQ ID NO: 5. Предсказанные сигнальные мотивы включают мотив "Box 1" в области аминокислот 265-274 и мотив "Box 2" в области аминокислот 311-324 (жирный и подчеркнутый). В позициях аминокислот 281, 319, 361, 368, 397 и 510 последовательности SEQ ID NO: 5 расположены шесть остатков тирозина. Мотив WSXWS (SEQ ID NO: 3) расположен в области остатков аминокислот 214-218 (заглавные буквы, жирный шрифт). Возможные сайты «стыковки» (docking) с Stat включают остатки аминокислот 393-398 и остатки аминокислот 510-513 последовательности SEQ ID NO: 5. На ФИГ.2В изображена последовательность аминокислот IL-21R/MU-1 человека (соответствующая SEQ ID NO: 2). Указаны положения предсказанных сигнальной последовательности (аминокислоты 1-19 последовательности SEQ ID NO: 2); мотива WSXWS (аминокислоты 213-217 последовательности SEQ ID NO: 2) и трансмембранного домена (аминокислоты 236-252 (или 236-253, или 236-254) последовательности SEQ ID NO: 2 (подчеркнут)). Возможные сайты связывания JAK, сигнальные мотивы Box 1 и 2 и сайты «стыковки» со Stat указаны стрелками с подписями.

[0022] ФИГ.3 приведено GAP-сравнение последовательностей кДНК IL-21R/MU-1 человека и мыши (соответствующих нуклеотидам 1-2665 последовательности SEQ ID NO: 1 и нуклеотидам 1-2628 последовательности SEQ ID NO: 4 соответственно). huMU-1=IL-21R/MU-1 человека, murMU-1=IL-21R/MU-1 мыши. Параметры анализа: Gap weight (вес пробела)=50; Average Match (среднее совпадение)=1 0.000; Length Weight (вес длины)=3; Average Mismatch (среднее несовпадение)=0.000; Percent Identity (идентичность в процентах)=66.116.

[0023] На ФИГ.4 изображено GAP-сравнение белка IL-21R/MU-1 человека (соответствует последовательности аминокислот SEQ ID NO: 2) и белка IL-21R/MU-1 мыши (соответствует последовательности аминокислот SEQ ID NO: 5). Выравнивание осуществляли при помощи матрицы замены аминокислот BLOSUM62 (Henikoffn Henikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915-19). Параметры анализа: Gap Weight (вес пробела): 8; Average Match (среднее совпадение)=2.912; Length Weight (вес длины)=2; Average Mismatch (среднее несовпадение)=-2.003; Percent Identity (идентичность в процентах)=65.267.

[0024] На ФИГ.5 изображено множественное выравнивание последовательностей аминокислот IL-21R/MU-1 человека (соответствует SEQ ID NO: 2), IL-21R/MU-1 мыши (соответствует SEQ ID NO: 5) и бета-цепи IL-2 человека (GENBANK® Accession No. М26062). Лидерный и трансмембранный домены подчеркнуты. Консервативные мотивы рецепторов цитокинов выделены жирным шрифтом. Возможные сигнальные области указаны подчеркиванием и жирным шрифтом.

[0025] На ФИГ.6 изображена передача сигнала через IL-21R/MU-1. IL-21R/MU-1 фосфорилирует Stat 5 в клетках клона Е7, экспрессирующих рекомбинантный IL-21R/MU-1, стимулированных эритропоэтином (ЕРО). Обработка контрольных или химерных клеток BAF-3 интерлейкином IL-3 приводила к фосфорилированию Stat 3, но не Stat 1 или 5.

[0026] На ФИГ.7А-7В изображено выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот зрелого IL-21R человека, присоединенного по N-концу к лидерной последовательности медоносной пчелы и меткам His₆ и Flag. Последовательности нуклеотидов и аминокислот этого рекомбинантного белка, изображенного на ФИГ.7А-7В, приведены в SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11 соответственно. Последовательности аминокислот фрагмента зрелого IL-21R человека и фрагмента, содержащего лидер медоносной пчелы/метку His рекомбинантного белка, соответствуют аминокислотам 20-235 последовательности SEQ ID NO: 2 и аминокислотам 1-44 последовательности SEQ ID NO: 11 соответственно.

[0027] На ФИГ.8А-8С изображено: выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека, присоединенного по С-концу через линкер к Fc-последовательности иммуноглобулина G1 человека (IgG1). Последовательности нуклеотидов и аминокислот этого рекомбинантного белка, изображенного на ФИГ.8А-8С, приведены в SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 соответственно. Последовательности аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека, линкера и Fc-последовательности иммуноглобулина G1 человека (IgG1) соответствуют аминокислотам 1-235 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислотам 236-243 последовательности SEQ ID NO: 13 и аминокислотам 244-467 последовательности SEQ ID NO: 13 соответственно.

[0028] На ФИГ.9А-9С изображено выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека, присоединенного по С-концу через линкер к Fc-последовательности иммуноглобулина G1 человека (IgG1) и последовательности метки His₆. Последовательности нуклеотидов и аминокислот этого рекомбинантного белка, изображенного на ФИГ.9А-9С, приведены в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 соответственно. Последовательности аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека, линкера, Fc-последовательности иммуноглобулина G1 человека (IgG1) и последовательности метки His₆ соответствуют аминокислотам 1-235 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислотам 236-243 последовательности SEQ ID NO: 15, аминокислотам 244-467 последовательности SEQ ID NO: 15 и аминокислотам 468-492 последовательности SEQ ID NO: 15 соответственно.

[0029] На ФИГ.10А-10С изображено выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека, присоединенного по С-концу через линкер к мутированной Fc-последовательности иммуноглобулина G1 человека (IgG1). Fc-последовательность человека подвергали мутагенезу в остатках 254 и 257 по сравнению с диким типом, чтобы уменьшить связывание с Fc-рецептором. Последовательности нуклеотидов и аминокислот указанного рекомбинантного белка, изображенного на ФИГ.10А-10С, приведены в SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 соответственно. Последовательности аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека, линкера и мутированной Fc-последовательности иммуноглобулина G1 человека (IgG1) соответствуют аминокислотам 1-235 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислотам 236-243 последовательности SEQ ID NO: 17 и аминокислотам 244-467 последовательности SEQ ID NO: 17 соответственно.

[0030] На ФИГ.11А-11В изображено выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека, присоединенного по С-концу к последовательности родопсиновой метки. Последовательности нуклеотида и аминокислот рекомбинантного белка приведены в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19 соответственно. Последовательность аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека соответствует аминокислотам 1-235 последовательности SEQ ID NO: 2.

[0031] На ФИГ.12А-12С изображено выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека, соединенного с сайтом расщепления ЕК и мутированной Fc-области IgG1. Последовательности нуклеотидов и аминокислот этого рекомбинантного белка, изображенного на ФИГ.12А-12С, приведены в SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21 соответственно. Последовательности аминокислот внеклеточного домена IL-21R человека, сайта расщепления ЕК/мутированной Fc-области IgG1, соответствуют аминокислотам 1-235 последовательности SEQ ID NO: 2 и аминокислотам 236-470 последовательности SEQ ID NO: 21 соответственно.

[0032] На ФИГ.13А-13В изображено выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот внеклеточного домена IL-21R мыши, присоединенного по С-концу к иммуноглобулину G2a мыши (IgG2a). Последовательности нуклеотидов и аминокислот приведены в SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23 соответственно.

[0033] На ФИГ.14А-14В изображено выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот внеклеточного домена IL-21R мыши, присоединенного по С-концу к последовательностям меток Flag и His₆. Последовательности нуклеотидов показаны в SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

[0034] На ФИГ.15А-15В изображено выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот (лидерная последовательность медоносной пчелы) внеклеточного домена IL-21R мыши, присоединенного по N-концу к меткам последовательностей Flag и His₆. Последовательности нуклеотидов и аминокислот приведены в SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27 соответственно.

[0035] На ФИГ.16 показаны профили экспрессии IL-21 и IL-21R при высокополяризованных имунных ответах типа 1 и типа 2. Группу из пяти мышей IL-10/IL-4 КО ( k nock- o ut; TH1, Δ) и IL-10/IL-12 КО (Т_Н2, •) интраперитонеально сенсибилизировали яйцами S.mansoni и через 14 дней иммунизировали внутривенным путем. Отдельно готовили образцы РНК из легких для анализа способом ПЦР в реальном времени (RT-PCR) на IL-13 и IFN-γ (ФИГ.16А), и IL-21R, и IL-21 (ФИГ.16В). Средние значения ± SEM (стандартная погрешность среднего) экспрессии генов выражали как кратный прирост по сравнению с неиммунизированными контролями дикого типа после нормирования по уровню экспрессии гена HPRT (гипоксантинфосфорибозилтрансфераза - housekeeping ген). Звездочки обозначают значительные различия между группами в заданный момент времени, * р<0.05.

[0036] На ФИГ.17 показано, что продукция цитокинов типа 2 в легких мышей IL-21R^-/-, которым ввели яйца шистосом, снижена. Группам интактных мышей дикого типа (пустые столбики) и мышей IL-21R^-/- (цветные столбики) внутривенно вводили живые яйца S.mansoni и умерщвляли на 4, 7 и 14 день после инъекции. (А) Из тканей легких выделяли РНК и анализировали отдельно путем ПЦР в режиме реального времени (N=5 на группу/момент времени). Результаты показаны в виде графика «столбики с усами» со столбиками, соответствующими сумме по пяти животным, на которых показаны медианы, квартили, а также самый маленький и самый большой процентили распределения; столбики (снизу вверх) указывают 10-й, 25-й, 50-й, 75-й и 90-й процентили исследованных образцов соответственно. Звездочками обозначены значительные отличия от значений для дикого типа в заданный момент времени, * р<0.05, ** р<0.01, *** р<0.001. (В) Отбирали селезенки (Sp1) и лимфатические узлы, связанные с легкими (LN) (2 отдельные группы, 3-4 мыши на группу), и после 72-часовой инкубации в присутствии Con A (CON, 1 мкг/мл) или растворимого антигена яиц (SEA, 20 мкг/мл) анализировали суспензии отдельных клеток на IL-5, IL-10, IL-13 и IFN-γ. В нестимулированных культурах уровень цитокинов был ниже предела обнаружения. (С) Проводили количественное определение размера гранулемы под микроскопом (объем, мм³ Х 10^-3) и процентного содержания эозинофилов. (D) Проводили анализ генов воспаления, регулируемых Т_Н2, в гранулематозной ткани легкого путем ПЦР в реальном времени. Все приведенные данные характерны по меньшей мере для двух отдельных экспериментов.

[0037] На ФИГ.18 показано, что ответ 2 типа у мышей IL-21R^-/-, инфицированных N. brasiliensis, нарушен. В день 7 у отдельных инфицированных N. brasiliensis и интактных мышей C57BL/6 или IL-21R^-/- брали легкие (А), связанные с легкими лимфатические узлы (LALN) (В) (5/группу лечения). Выделяли РНК и получали кДНК, как описано в подписи к ФИГ.17. мРНК анализировали отдельно на IL-13, IL-4, AMCase, Yml и FIZZl путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Кратное изменение отражает отличия инфицированных мышей и интактных животных.

[0038] На ФИГ.19 показано, что у мышей IL-21R^-/- снижена выраженность воспаления, опосредуемого цитокинами 2 типа. Мышей дикого типа (пустые столбики) и IL-21R^-/- (цветные столбики) интраперитонеально сенсибилизировали яйцами S.mansoni, через две недели иммунизировали путем внутривенной инъекции живых яиц S.mansoni и умерщвляли в дни 4 и 7 после иммунизации. (А) Получали РНК из ткани легких и анализировали отдельно (N=5 на группу/момент времени) способом ПЦР в режиме реального времени, как описано выше в описании ФИГ.17. (В) Селезенки (Spl) и лимфатические узлы, связанные с легкими (LN), анализировали на IL-5, IL-10, IL-13 и IFN-γ после стимуляции антигеном (SEA) или митогеном (CON). (С) Под микроскопом количественно оценивали размер гранулемы (мм³×10^-3) и процент эозинофилов у мышей дикого типа (мышей на группу: N=10, день 4; N=15, день 7) и мышей IL-21R^-/- (N=11, день 4; N=16, день 7). (D) Анализ генов воспаления, регулируемых Т_Н2, в гранулематозной ткани легкого определяли способом ПЦР в режиме реального времени (N=5 на группу/момент времени). Звездочками отмечены значительные отличия от значений у дикого типа в заданный момент времени, * р<0.05, ** р<0.01, *** р<0.001. Приведенные данные представляют собой комбинированные результаты по 3 отдельным экспериментам.

[0039] На ФИГ.20 показано, что в отсутствие IL-21R снижается выраженность хронической болезни печени после подкожного инфицирования S.mansoni. Мышей дикого типа (пустые столбики) и IL-21R^-/- (цветные столбики) инфицировали 25-30 церкариями S.mansoni. Всех животных умерщвляли на 9-й неделе (острая стадия) или 12 недели (хроническая стадия) после инфицирования. (А) Из тканей легких выделяли РНК и анализировали отдельно способом ПЦР в режиме реального времени (N=8-10 на группу/момент времени), как описано в подписи к ФИГ.17. (В) Отбирали селезенки (Spl) и лимфатические узлы брыжейки (LN) объединяли в группы по 2-4 мышам и анализировали суспензии отдельных клеток на IL-5, IL-10 и IFN-γ. Приведенные данные представляют собой среднее по трем отдельным объединенным группам. (С) Под микроскопом оценивали размер гранулемы (мм³×10^-3) и процент эозинофилов в гранулемах у мышей дикого типа (мышей на группу: N=30 для недели 9, N=17 для недели 12) и мышей IL-21R^-/- (мышей на группу: N=27 для недели 9, N=19 для недели 12). (D) Проводили анализ генов воспаления Т_Н2 в гранулематозной ткани печени способом ПЦР в режиме реального времени (N=8-10 на группу/момент времени). Приведенные данные представляют собой комбинированные результаты по 3 отдельным экспериментам, проведенным в неделю 9, и двум, проведенным в неделю 12. Звездочками обозначены значительные отличия от значений дикого типа в заданный момент времени, * р<0.05, ** р<0.01, *** р<0.001.

[0040] ФИГ.21 демонстрирует, что отсутствие IL-21R не меняет клеточного состава гранулемы. (А) Клеточный состав гранулемы оценивали на неделю 9 в печенях мышей дикого типа (N=10) и мышей IL-21R^-/- (N=9). Показаны средние ± SEM малых лимфоцитов (Sm Lym), больших лимфоцитов (Lg Lym), макрофагов (Mac), фибробластов (Fibro), эозинофилов (Eos) и мастоцитов (Мс). (В) Лимфоциты выделяли из перфузируемых легких наивных мышей дикого типа и мышей IL-21R^-/- (верхние рисунки) в день 7 после внутривенного введения 5000 яиц S.mansoni (нижние рисунки). Числа на гистограммах показывают процентные доли CD4^- и CD4⁴⁺ Т-клеток в общем числе лимфоцитов легких.

[0041] ФИГ.22 демонстрирует, что отсутствие IL-21R значительно замедляет прогрессирование фиброза, зависимого от цитокинов Т_Н2. Мышей дикого типа (пустые столбики) и мышей IL-21R^-/- (цветные столбики) инфицировали церкариями S.mansoni. Животных умерщвляли на 9-ю неделю (острая стадия), 12-ю неделю (хроническая стадия) (панели A-D) или 29-ю неделю (поздняя хроническая стадия) (панель Е) после инфекции. (А) Для каждой группы показаны средние количества пар червей, общее число червей и яиц/пару червей в тысячах ± SE (средняя погрешность). Ни в одном эксперименте не обнаружили различий в интенсивности инфекции (n = число мышей). (В) При умерщвлении у мышей отбирали кровь и способом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) определяли титры изотип-специфичных антител к SEA. (С) Значения общего IgE в сыворотки в мкг/мл. (D-F) Фиброз оценивали по количеству гидроксипролина в микромолях, определенному в печени, в расчете на 10000 яиц (панель D) или в целой печени (панели Е и F). На панели F инфицированных мышей дикого типа C57BL/6 лечили либо контрольным антителом IgG2a (cIg - пустой столбик), либо sIL-21R-Fc (цветной столбик) в течение 6 недель. Звездочками обозначены значительные отличия от значений для дикого типа в заданные моменты времени, * р<0.05, ** р<0.01, *** р<0.001.

[0042] ФИГ.23 демонстрирует, что передача сигналов IL-21 стимулирует активацию макрофагов по альтернативному пути посредством изменения экспрессии рецептора IL-13. Макрофаги костного мозга в течение ночи обрабатывали различными комбинациями IL-4 (20 нг/мл), IL-13 (20 нг/мл) и IL-21 (20 нг/мл). Макрофаги, которые обрабатывали IL-4, IL-13 и IL-21, предварительно, перед введением IL-4 и IL-13, в течение 6 часов обрабатывали IL-21. Через 20 часов клетки лизировали и отдельно анализировали способом ПЦР в режиме реального времени (RT-PCR). (А) Способность IL-21 стимулировать макрофаги по альтернативному пути оценивали с помощью измерения экспрессии генов Arg-1 и FIZZ1. (В) Количественно оценивали активность аргиназы в лизатах клеток путем измерения превращения L-аргинина в мочевину (мг/дл + SEM, измерения в трипликатах). (С) Экспрессию мРНК IL-4Rct и IL-13Rccl оценивали способом ПЦР в режиме реального времени. При всех условиях мРНК IL-13Rα2 практически не удавалось обнаружить (результаты не показаны). Данные, показанные на панелях А, В и С, являются типичными примерами по 3 отдельным экспериментам. (D) Интактным мышам C57BL/6 каждый день в дни с 1-го по 6-й внутривенно вводили 5000 живых яиц S.mansoni и обрабатывали ФБР (фосфатный буферный раствор) или IL-21 (мкг/дозу). Животных (5 на группу) умерщвляли в день 7 и исследовали уровни мРНК IL-13Rα2 способом ПЦР в режиме реального времени. Результаты выражали в кратном приросте по отношению к необработанным контролям (пустой столбик). У мышей также отбирали кровь в момент умерщвления и способом твердофазного иммуноферментного анализа определяли количество sIL-13Rα2 в отдельных образцах сыворотки. Звездочками обозначены значительные отличия, * р<0.05, ** р<0.01, *** р<0.001.

[0043] ФИГ.24 показывает, что макрофаги, активированные по альтернативному пути, не продуцируют значительных количеств активного ФНО-β1. На правой панели показано содержание активного ФНО-β1 после активации макрофагов, а на левой панели - общие уровни ФНО-β1 после активации макрофагов. Макрофаги костного мозга в течение ночи обрабатывали различными комбинациями IL-4 (20 нг/мл), IL-13 (20 нг/мл) и IL-21 (20 нг/мл). Макрофаги, которые обрабатывали IL-4, IL-13 и IL-21, предварительно, перед обработкой IL-4 и IL-13, в течение 6 часов обрабатывали IL-21. Через 20 часов после активации надосадочную жидкость анализировали способом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на общий и активный ФНО-β1. Во всех группах, за исключением клеток, обработанных только IL-21, обнаружили высокие уровни ФНО-β1 (например, сравните левые панели "IL-4" и "IL-21 "с "Необработанными"). Хотя общая экспрессия ФНО-β1 была высокой, количество активного ФНО-β1 во всех группах было минимальным (правая панель). Приведенные данные являются типичными примерами для 3-х отдельных экспериментов, давших аналогичные результаты.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0044] Чтобы исследовать роль пути передачи сигнала с участием IL-21/IL-21R в патогенезе фиброза, сравнивали иммунные ответы у мышей в отсутствие функционального IL-21R (IL-21R^-/-) и мышей дикого типа с использованием различных моделей воспаления легких и печени. В одной модели интактным или сенсибилизированным антигеном животным путем внутривенных инъекций вводили живые яйца шистосомы, чтобы изучить первичное и вторичное гранулематозное воспаление легких. В другой модели мышей подкожно инфицировали церкариями S.mansoni и наблюдали развитие вызванного яйцами воспаления в печени. В другой модели мышей инфицировали N.brasiliensis. Посредством этих моделей изучали влияние IL-21R на опосредуемую цитокинами 2 типа патологию при развитии острого и хронического заболевания. Результаты демонстрируют важную роль IL-21R в формировании поляризованных ответов 2 типа in vivo, в частности, опосредуемого цитокинами 2-го типа воспаления и фиброза.

[0045] Соответственно настоящее изобретение обеспечивает способы лечения, уменьшения выраженности или профилактики фиброза или ассоциированного с фиброзом нарушения у субъекта (например, человека, например пациента, являющегося человеком) с исп