Способ получения капсулированной формы противотуберкулезных препаратов рифамицинового ряда

Способ получения капсулированной формы противотуберкулезных препаратов рифамицинового ряда

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к способу получения липосомальной формы противотуберкулезных препаратов для лечения туберкулеза.

Для лечения туберкулеза разработана схема терапии, включающая как минимум несколько препаратов. Полусинтетический антибиотик рифампицин (РМ) и его более современный аналог рифабутин (РБ) являются препаратами первого ряда при лечении туберкулеза.

Механизм действия антибиотиков рифамицинового ряда (РМ и РБ) обусловлен их способностью связываться с β-субъединицей бактериальной РНК полимеразы и тем самым подавлять процесс транскрипции в Mycobacterium tuberculosis. Необходимым условием успешной реализации такого механизма является проникновение антибиотика в инфицированный макрофаг.

Однако оба препарата (РМ и РБ) имеют серьезные недостатки. Они мало растворимы в воде (1 мг/мл и 0,01 мг/мл соответственно) и при длительном приеме оказывают выраженный гепатотоксический эффект. Поэтому желательна такая лекарственная форма для антибиотиков, которая бы повысила их содержание в водной фазе. Для этого антибиотики заключают в частицы из природных фосфолипидов (липосомы), либо в наночастицы из биодеградируемых синтетических полимеров. Важным преимуществом липосомных препаратов и полимерных частиц, которые имеют размер от 0,2 до 0,5 мкм, перед традиционными лекарственными формами является их способность взаимодействовать с макрофагами путем эндоцитоза. Эта особенность чрезвычайно важна при лечении туберкулеза, т.к. М. tuberculosis размножаются в основном в макрофагах. Таким образом, с помощью капсулированной формы антибиотиков может быть осуществлена направленная доставка лекарственного препарата в макрофаг, к месту размножения микобактерий.

Следует учесть, что при введении в кровеносное русло капсулированной формы препарата происходит его сильное разбавление, которое приводит к десорбции препарата с поверхности липосом или наночастиц и выходу его из внутреннего водного пространства липосом наружу по градиенту концентраций. Поэтому для противотуберкулезного препарата важным является не столько общее содержание действующего вещества в составе капсулированной формы, сколько количество (процент) его включения в сами капсулы, будь это липосомы или наночастицы, которые затем захватываются макрофагами.

Известно несколько композиций для РМ и РБ, каждый из которых встроен в полимерные наночастицы размером 0,2-0,4 мкм.

Известен способ получения композиции с РБ, включающий раздельное смешение рифабутина с целевыми добавками и наполнителем и другой части рифабутина с недостающим количеством наполнителя, последующее их смешение, опудривание магнием стеариновокислым и капсулирование (Патент RU 2320337, МПК А61К 31/395, А61К 9/48, опубл. 27/03/2008).

Однако в данном исследовании нет сведений о растворимости данного препарата в водной фазе после растворения капсулы.

Известны способы получения композиций (Патент RU 2337711, МПК А61К 47/48, А61К 31/438, опубл. 10/11/2008; Патент ЕА 200801388 А1, МПК А61К 31/438; А61К 9/16; опубл. 28/08/2009, Патент WO 2009002227 А1, МПК А61 К9/395; А61К 31/10 опубл. 31/12/2008), представляющие собой наночастицы из полимеров молочной кислоты и сополимеров молочной и гликолевой кислот с включенным в них РБ. Частицы имели небольшой размер (0.2-0.4 мкм) и высокий процент включения антибиотика.

Однако в данных работах не изучалась кинетика выхода РБ из частиц при попадании в водную среду и содержание антибиотика, который остается в частицах после сильного разбавления.

Известен также способ получения препарата РМ, содержащего 1-22% рифампина (синоним - рифампицин) в липосомальной форме, состоящего из 1-27% лецитина, 1-18% холестерола и 70-100% дистиллированной воды (CN 1319395, МПК А61К 9/127; А61К 31/496, опубл. 31/10/2001).

В данном исследовании также не было определено включение антибиотика в липосомы.

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу получения капсулированной формы РМ является способ получения липосомальной формы РМ, включающий приготовление раствора РМ вместе с фосфолипидами в органическом растворителе, удаление растворителя до получения тонкой пленки, которую диспергируют в водной среде до получения суспензии мультиламелярных везикул с заключенным в них РМ. Полученную суспензию гомогенизируют при высоком давлении или продавливают через фильтр до получения липосом размером 0,1-0,5 мкм. В качестве фосфолипидов берут смесь, содержащую, мас.%: фосфатидилхолина 70-80, остальное - смесь любых других липидов яичного желтка, и/или сои, и/или крупного рогатого скота. Раствор РМ совместно с фосфолипидами готовят при соотношении рифампицин: фосфолипиды, равном 1:3-15 (Патент РФ 2223764, МПК А61К 31/496, А61К 9/127, опубл. 20/02/2004).

Недостатком этого способа является то, что содержание РМ в составе липосом не определяли, а способ получения липосом очень трудоемок и содержит такие энергоемкие операции, как выпаривание органического растворителя и использование специального оборудования для гомогенизации и продавливания МЛВ.

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу получения капсулированной формы РБ является способ получения композиции РБ в липосомах из индивидуального фосфатидилхолина сои и его смеси с другими липидами. Способ заключается в получении липидной пленки, содержащей антибиотик, путем выпаривания органического растворителя из раствора липидов с антибиотиком, диспергировании липидной пленки, в малом объеме водной фазы, затем полученные МЛВ разбавляли в большом объеме водной фазы и центрифугировали. Супернатант продавливали через фильтр с определенным размером пор и получали одноламеллярные везикулы, в которых определяли включение РБ по его содержанию во фракции липосом, которые были отделены от несвязавшегося РБ методом гель-фильтрации. Включение РБ рассчитывали как отношение включенного в липосомы РБ к фосфолипидам липосом, в которых он находился (Gaspar М.М., Neves S., Portaels F., Pedrosa J., Silva M.Т., Cruz M.E. Therapeutic efficacy of liposomal rifabutin in a Mycobacterium avium model of infection // Antimicrob. Agents Chemother. 2000, Vol.44, No.9, pp.2424-2430).

Недостатком этого способа является то, что предложенный расчет показателя включения антибиотика не предполагает возможности достоверно оценить соотношение липосом, содержащих РБ и «пустых» липосом, а способ получения липосом очень трудоемок и содержит такие энергозатратные операции, как выпаривание органического растворителя, центрифугирование и продавливание МЛВ.

Техническим результатом изобретения является разработка технологичного и экономически выгодного способа получения липосомальных форм противотуберкулезных препаратов РМ и РБ, без применения токсичных органических растворителей, а также энергозатратных стадий их удаления.

Указанный технический результат достигается за счет того, что в предложенном нами способе получают липосомы малого размера (не более 0,5 мкм), содержащих РМ или РБ, включенных в липосомы в высокой концентрации.

Антибиотик растворяют в изотоническом растворе со значением pH среды 2-3, а затем на поверхность данного раствора наслаивают порошок смеси липидов, содержащей 50-70% гликосфинголипидов, 30-50% фосфолипидов и 3% холестерина и триацилглицеридов, далее диспергируют при слабом перемешивании при комнатной температуре, доводят pH дисперсии до нейтрального значения добавлением основания, дисперсию нагревают в течение 10-40 мин при температуре 60-70°С с последующей оценкой степени включения антибиотика методом спектрофотометрии после проведения гель-фильтрации.

Для получения липосом используют смесь липидов следующего состава:

- гликосфинголипиды 60%;

- фосфолипиды - 37%;

- холестерин и триацилглицериды - 3%.

В качестве гликолипидов берут смесь цереброзидов и цереброзидсульфатов природного или синтетического происхождения в любых соотношениях.

Денситометрическим анализом ТСХ был определен качественный и количественный состав фосфолипидов препарата. Установили, что в исходном препарате из фосфолипидов присутствуют фосфатидилсерин - 28%; фосфатидилэтаноламин - 8% и следовые количества фосфатидилхолина и сфингомиелина (СМ). Фракция гликосфинголипидов состоит в основном из цереброзидов (Ц - 46%) и цереброзидсульфатов (ЦС - 14%).

Морфология частиц была исследована методом электронной микроскопии. Также оценку размера частиц получали из данных турбидиметрического анализа.

Оптимизацию условий получения липосом с РМ или с РБ проводили, варьируя температуру получения липосом из длинных полунанотрубок от 40 до 80°С. При температуре ниже 55°С наблюдали исходные полунанотрубки, как это показано на фиг.1. Выше 80°С из полунанотрубок образуются сферические частицы (фиг.2), но в этих условиях повышается индекс окисленности липидов от 0.2 до 1.0, что говорит о том, что идет окисление и деградация липидов. Таким образом, диапазон температур находится от 55 до 70°С.

Для получения липосом с РМ или с РБ используют разные соотношения ГСЛ и ФЛ при постоянной концентрации РМ или РБ, равной 5 мг/мл. Для отделения антибиотика, включенного в липосомы, от антибиотика в растворе использовали микроколонку с сорбентом Sephadex G-25. Повышение содержания ФЛ в смеси ГСЛ/ФЛ уменьшает включение антибиотиков в липосомы, так же как и повышение общей концентрации смеси липидов выше 15 мг/мл.

При получении липосом используют содержание РМ или РБ в изотоническом растворе от 1 до 5 мг/мл. Повышение исходной концентрации антибиотика приводит к тому, что их содержание в липосомах увеличивается. Но при повышении концентрации антибиотика до 10 мг/мл образуется осадок, который не диспергируется смесью липидов.

При получении липосом варьируют концентрацию смеси ГСЛ/ФЛ (3:2) в исходной дисперсии от 15 до 40 мг/мл. Увеличение концентрации липидов выше 40 мг/мл приводило к уменьшению включения антибиотиков. Возможно, это происходило потому, что в этих условиях нет полного перехода полунанотрубок в сферические частицы, что следует из данных по размеру частиц.

Наилучший результат получения капсулированной формы антибиотиков РМ и РБ по предложенному способу описан в примере 1.

Пример 1

Сначала в раствор 0,9% NaCl добавляют 0,01 М HCl так, что pH раствора становится 3,0 или ниже. В этот раствор добавляют РМ или РБ так, чтобы достичь конечной концентрации антибиотиков 5 мг/мл. Далее на поверхность раствора наслаивают порошок смеси липидов и диспергируют при слабом перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре в течение 30 мин. Используемая смесь гликосфинголипидов и фосфолипидов (ГСЛ/ФЛ) при соотношении 3:2 при таком способе диспергирования образует в водных растворах протяженные структуры диаметром 200 нм и длиной более микрона. Они имеют вид желоба и их называют полунанотрубками (фиг.1). Полученную дисперсию доводят раствором основания до pH 6,0-7,0 и нагревают в течение 10 мин при температуре 60°С. При этом происходит превращение полунанотрубок в сферические наночастицы - липосомы (фиг.2). Получают гомогенную эмульсию липосом, имеющих размер не более 0,5 мкм и содержащих высокий процент антибиотиков РМ или РБ после сильного разбавления препарата в ходе проведения процесса гель-фильтрации.

Оценку степени включения антибиотика в липосомы осуществляют спектрофотометрически, основываясь на зависимости светопоглощения при определенных длинах волн от концентрации, которая подчиняется закону Ламберта-Бугера-Бера в интересующем диапазоне концентраций. В частности, содержание РМ можно определить из величины светопоглощения при длине волны 475 нм, принимая молекулярный показатель поглощения равным 15300 л·моль^-1·см^-1. Содержание РБ вычисляют по светопоглощению раствора при длине волны 500 нм (молекулярный показатель поглощения принимается равным 3100 л·моль^-1·см^-1).

Для определения количества (процента) включения РМ или РБ в липосомы методом гель-фильтрации отделяют липосомы, содержащие противотуберкулезные препараты, от их водных форм. Для этого липосомальные препараты антибиотиков наносят на колонку, заполненную Sephadex G-25, и проводят элюцию физиологическим раствором или трис-буфером.

В первых фракциях, собранных с колонки, содержались липосомы с включенным лекарственным препаратом и липосомы, не содержащие препарат («пустые» липосомы), а затем следовали фракции, в которых находился свободный лекарственный препарат, не включенный в липосомы. Содержание обоих компонентов (липосом и антибиотика) определяли методом спектрофотометрии. Наличие липосом подтверждали, фиксируя мутность инкубационной среды при 780 нм. Для определения количества антибиотиков, связанных с липосомами, производили их разрушение детергентом, для чего к 3 мл липосом добавляли 0,2 мл 5,4%-ного раствора дезоксихолата натрия.

Примеры 2-6

Гомогенные эмульсии липосом, включающие РМ и РБ, получали аналогично примеру 1, их характеристики, такие как соотношение антибиотик:липосомы и оценка эффективности включения антибиотиков в липосомы, приведены в таблице.

Таблица
Характеристики липосом, содержащих РМ или РБ, из смеси ГСЛ/ФЛ, полученных при разных условиях
Липидный компонент	Исходная конц-я антибиотика мг/мл	Липиды мг/мл	Эффективность включения. РМ, %	Эффективность включения. РБ, %	Размер частиц, нм
ГСЛ/ФЛ (1:2)	5	15	17	10	325
ГСЛ/ФЛ (1:1)	5	15	25	20	370
ГСЛ/ФЛ (3:2)	1	15	15	23	250
ГСЛ/ФЛ (3:2)	5	15	30	33	250
ГСЛ/ФЛ (3:2)	10 осадок	15	-	-	-
ГСЛ/ФЛ (3:2)	5	40	25	28	Выше 1 мкм

1. Способ получения капсулированной формы антибиотиков рифамицинового ряда рифампицина (РМ) или рифабутина (РБ) в виде липосом, отличающийся тем, что антибиотик растворяют в изотоническом растворе со значением pH среды 2-3, а затем на поверхность данного раствора наслаивают порошок смеси липидов, содержащей 50-70% гликосфинголипидов, 30-50% фосфолипидов и 3% холестерина и триацилглицеридов, и диспергируют при слабом перемешивании при комнатной температуре, доводят pH дисперсии до нейтрального значения добавлением основания, дисперсию нагревают в течение 10-40 мин при температуре 60-70°С с последующей оценкой степени включения антибиотика методом спектрофотометрии после проведения гель-фильтрации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что все указанные действия проводят в стерильных условиях, применяя изотонический стерильный раствор NaCl.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве гликолипидов берут цереброзиды и цереброзидсульфаты природного или синтетического происхождения в любых соотношениях.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что раствор антибиотика совместно со смесью липидов готовят при соотношении антибиотик: липиды от 1:3 до 1:15 (мас.).

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что определение включенных в липосомы РМ или РБ проводят во фракции липосом, отделенной от свободного РМ или РБ с помощью метода гель-фильтрации, и определение содержания РМ или РБ в полученной фракции липосом проводят спектрофотометрически.