Протеазы для фармацевтического применения

Протеазы для фармацевтического применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтическому применению протеаз, относящихся к сериновой протеазе, происходящей из Bacillus licheniformis (аминокислоты 1-274 SEQ ID NO: 2), необязательно в сочетании с липазой и/или амилазой. Примерами медицинских показаний является лечение нарушений пищеварения, недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы (PEI), панкреатита, кистозного фиброза, диабета I типа и/или диабета II типа.

Известный уровень техники

Известно несколько имеющихся в продаже лекарственных препаратов в форме добавок панкреатических ферментов для лечения недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы. Активными ингредиентами этих продуктов являются пищеварительные ферменты, главным образом, амилаза, липаза и протеаза, которые обычно продуцируются в поджелудочной железе и экскретируются в верхнюю часть тонкого кишечника (двенадцатиперстную кишку). Ферменты, применяемые в таких лекарственных препаратах, происходят из поджелудочной железы быка или свиньи, однако на рынке существуют также продукты с микробными ферментами, например, продукт Nortase®, который содержит липазу из Rhiropus oryzae, протеазу из Aspergillus oryzae и амилазу из Aspergillus oryzae.

В US 5614189 (EP 600868) описывается применение, среди прочего, липазы, происходящей из Humicola lanuginose, в заместительной терапии панкреатическими ферментами, например, при лечении больных, страдающих кистозным фиброзом. Эта липаза происходит из Humicola lanuginosa DSM 4109 и имеет аминокислотную последовательность из аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 14.

В публикации WO 00/54799 описывается применение физиологически приемлемых смесей ферментов, обладающих липолитической, протеолитической и амилолитической активностью при лечении сахарного диабета I и II типа.

В публикации WO 02/060474 описывается применение концентрированной липазы из Rhizopus delemar, нейтральной липазы из Aspergillus melleus и амилазы из Aspergillus oryzae при лечении нарушений пищеварения.

В публикации WO 01/62280 описывается применение определенного кристалла негрибковой липазы, поперечно сшитого с многофункциональным поперечно сшивающим агентом, протеазой и амилазой, где кристалл липазы активен в диапазоне рН от 2,0 до 9,0, для лечения или профилактики нарушения желудочно-кишечного тракта у млекопитающего. Предпочтительной является липаза из Pseudomonas, предпочтительными являются амилазы из Bacillus или Aspergillus, предпочтительными протеазами являются бромелайн, папаин или фицин.

В EP 0828509 описывается применение некоторых кислотоустойчивых амилаз необязательно в сочетании с некоторыми кислотоустойчивыми липазами и/или протеазами для лечения недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы. Предпочтительной является амилаза из Aspergillus niger, и предпочтительными являются липазы из Rhizopus arrhizus или Rhizopus javanicus.

В публикации WO 91/00345 описывается ряд сериновых субтилизиновых протеаз и их улучшенные варианты для применения в композициях детергентов.

В публикации WO 2005/115445 (опубликованной после дат приоритета настоящей заявки) описывается фармацевтическое применение протеаз, относящихся к протеазе, происходящей из Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (эта протеаза имеет аминокислотную последовательность аминокислот 1-188 SEQ ID NO: 1 в этой ссылке), необязательно в сочетании с липазой и/или амилазой. Медицинские показания являются теми же, что и в настоящем изобретении.

В публикации WO 02/077187 раскрываются варианты субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, обладающие измененным Т-клеточным эпитопом, и различное их применение. Заявляются фармацевтические композиции.

В публикации WO 01/12795 раскрывается фармацевтическое применение композиций протеолитических ферментов. Предпочтительными являются протеазы из Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus sojae, Aspergillus flavus, Aspergillus awamori или Bacillus subtilis.

В публикации WO 2004/078773 раскрывается, как поддерживать протеазы, такие как субтилизиновые протеазы, в неактивном состоянии, которые можно активировать при необходимости с помощью внешнего сигнала. Среди других вариантов применения раскрыто применение просубтилизина в составах для очищения ран и как вызвать образование активного субтилизина. Предпочтительный протеазный фермент представляет собой ProD-субтилизин или ProD-нагруженный субтилизин (Yabuta et al., J. Biol. Chem. 278:15246-51, 2003).

В US 2002/0081703 раскрывается способ снижения аллергенности белков, происходящих не от человека, где эпитоп идентифицируется и замещается на аналогичную область в субтилизине человека. Заявляются фармацевтические композиции, включающие субтилизин человека.

В данной области техники существует потребность в альтернативных, предпочтительно улучшенных ферментах для фармацевтического применения, в частности для указанных выше медицинских показаний.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предлагаются альтернативные, предпочтительно улучшенные ферменты для фармацевтического применения, в частности для лечения нарушений пищеварения, недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы (PEI), панкреатита, кистозного фиброза, диабета I типа и/или диабета II типа. Новые ферменты представляют собой протеазы, амилазы и липазы. Предпочтительно ферменты для применения в соответствии с изобретением имеют улучшенную эффективность in vivo и/или in vitro; улучшенный профиль рН-стабильности; улучшенный профиль рН-активности; являются стабильными в отношении разрушения протеазами; являются стабильными в присутствии солей желчных кислот; и/или имеют пониженную аллергенность.

Настоящее изобретение относится к протеазе с, по меньшей мере, 50% идентичностью с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, для применения в качестве лекарственного средства, необязательно в сочетании с липазой и/или амилазой.

Изобретение также относится к применению таких протеаз для получения лекарственного средства для лечения нарушений пищеварения, PEI, панкреатита (острого и/или хронического), кистозного фиброза, диабета I типа и/или диабета II типа, эти применения необязательно дополнительно включают применение липазы и/или амилазы.

Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, включающей такие протеазы, совместно с, по меньшей мере, одним фармацевтически приемлемым дополнительным веществом, необязательно включающим липазу и/или амилазу.

Изобретение также относится к способу лечения нарушений пищеварения, PEI, панкреатита (острого и/или хронического), кистозного фиброза, диабета I типа и/или диабета II типа с помощью введения терапевтически эффективного количества таких протеаз, необязательно совместно с липазой и/или амилазой.

Подробное описание изобретения

Ферменты

Настоящее изобретение относится к фармацевтическому применению протеаз, обладающих, по меньшей мере, 50% идентичностью с протеазой с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, сериновой протеазой, происходящей от Bacillus licheniformis, которая также обозначается как субтилизин Карлсберга. Изобретение также относится к применению таких протеаз для получения лекарственного средства для лечения нарушений пищеварения, PEI, панкреатита, кистозного фиброза, диабета I типа и/или диабета II типа. Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, включающей такие протеазы, совместно с, по меньшей мере, одним фармацевтически приемлемым дополнительным веществом, а также к способу лечения указанных выше заболеваний с помощью введения терапевтически эффективного количества таких протеаз.

В последующем протеазы для применения в композициях, способах и применениях по изобретению обозначаются как «протеазы по изобретению».

В предпочтительных осуществлениях протеаза по изобретению имеет степень идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, по меньшей мере, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% или, по меньшей мере, 60%. В других предпочтительных осуществлениях протеаза по изобретению имеет степень идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, по меньшей мере, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% или, по меньшей мере, 70%. В еще одних предпочтительных осуществлениях протеаза по изобретению имеет степень идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, по меньшей мере, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% или, по меньшей мере, 80%. В дополнительных предпочтительных осуществлениях протеаза по изобретению имеет степень идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, по меньшей мере, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или, по меньшей мере, 90%. В наиболее предпочтительных осуществлениях протеаза по изобретению имеет степень идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, по меньшей мере, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или, по меньшей мере, 99%.

Термин «протеаза» определяется здесь как фермент, который гидролизует пептидные связи. Он включает любой фермент, принадлежащий к группе ферментов EC 3.4 (включая каждый из тринадцати ее подклассов, эти ферменты будут в последующем обозначаться как «принадлежащие к группе EC 3.4.-.-.»). Номер EC относится к номенклатуре ферментов 1992 из NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, включая приложения 1-5, опубликованные в Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; и Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; соответственно. Номенклатура регулярно дополняется и обновляется; см., например, World Wide Web на http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

Протеазы подразделяются на основе их каталитического механизма на следующие группы: сериновые протеазы (S), цистеиновые протеазы (C), аспарагиновые протеазы (A), металлопротеазы (M) и неизвестные или еще не классифицированные протеазы (U), см. Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (eds), Academic Press (1998) (в последующем именуемое как «руководство»), особенно общую часть введения.

В другом осуществлении протеаза по изобретению представляет собой сериновую протеазу. Термин сериновая протеаза относится к сериновым пептидазам и их группам, как определено в руководстве, см. в частности главы 1-175. Сериновая протеаза представляет собой пептидазу, в которой каталитический механизм зависит от гидроксильной группы серинового остатка, действующего как нуклеофил, который разрушает пептидную связь.

В еще одном изобретении протеаза по изобретению представляет собой субтилизин и/или происходит из семейства субтилизина. Термины субтилизин или семейство субтилизина включают все сериновые протеазы группы SB, в особенности их семейство S8 (группа SB рассматривается в главе 93 руководства). Для определения того, является ли данная протеаза субтилизином или нет, делается ссылка на руководство и указанные в нем принципы. Такое определение может быть осуществлено для всех типов протеаз, являются ли они природными протеазами или протеазами дикого типа; или генетически сконструированными или синтетическими протеазами. В конкретном осуществлении порядок каталитической триады в протеазе по изобретению представляет собой Asp-His-Ser. В другом конкретном осуществлении третичная структура протеазы по изобретению включает как альфа-спирали, так и бета-складки. Группа SB включает эндопептидазы и экзопептидазы. В еще одном конкретном осуществлении протеаза по изобретению представляет собой эндопептидазу. Эндопептидазы проявляют активность в отношении пептидных субстратов, блокированных на N- и C-конце, что существенно для специфичности рассматриваемой протеазы.

В конкретном осуществлении протеаза по изобретению не представляет собой ProD-субтилизин или Pro-D-нагруженный субтилизин (Yabuta et al., J. Biol. Chem. 278:15246-51, 2003). В другом конкретном осуществлении протеаза по изобретению не представляет собой субтилизин Bacillus subtilis дикого типа и/или не происходит от Bacillus subtilis.

Соответственно, в первом аспекте протеаза по изобретению выбрана из группы, состоящей из: (a) протеаз, принадлежащих к группе ферментов EC 3.4.-.-.; (b) сериновых протеаз; (c) субтилизиновых протеаз или пептидаз группы SB; и (d) субтилизиновых протеаз семейства S8.

Во втором аспекте протеаза по изобретению происходит из микроорганизма, например, из грибка или из бактерии. Примерами бактерий являются штаммы Bacillus, такие как штаммы Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus clausii, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus natto, Bacillus pumilus, Bacillus sp., Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis var natto или Bacillus thuringiensis; в особенности штаммы Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus mesentericus, Bacillus natto, Bacillus pumilus, Bacillus sp., Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus subtilis var natto; предпочтительно штамм Bacillus licheniformis. В этом контексте термин «происходящий из» включает ферменты, доступные или получаемые из штаммов дикого типа; а также предпочтительно их варианты, имеющие, по меньшей мере, одну замену, вставку и/или делецию, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка. Термин вариант также включает ферменты с перетасованными фрагментами, гибридные, химерные ферменты и консенсусные ферменты. Варианты могут быть получены с помощью любого способа, известного в данной области техники, такого как сайт-направленный мутагенез, неспецифический мутагенез, способы консенсусной дериватизации (EP 897985) и перетасовка генов (WO 95/22625, WO 96/00343) и т.д.

Последующее представляет собой примеры протеаз по изобретению, происходящих из штаммов Bacillus и относящихся к протеазе с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2: Swissprot subt_bacli, № доступа P00780 (происходящей из Bacillus licheniformis, аминокислоты 1-274 SEQ ID NO: 5); Swissprot subn_bacna, № доступа P35835 (происходящей из Bacillus natto, аминокислоты 1-275 SEQ ID NO: 6); Swissprot subt_bacpu, № доступа P07518 (происходящей из Bacillus pumilus, аминокислоты 1-275 SEQ ID NO: 7); Swissprot subt_bacsu, № доступа P04189 (происходящей из Bacillus subtilis, аминокислоты 1-275 SEQ ID NO: 8); Swissprot subt_bacst, № доступа P29142 (происходящей из Bacillus stearothermophilus, аминокислоты 1-275 SEQ ID NO: 9); Swissprot subt_bacam, № доступа P00782 (происходящей из Bacillus amyloliquefaciens, аминокислоты 1-275 SEQ ID NO: 10); Swissprot subs_bacle, № доступа P29600 (происходящей из Bacillus lentus, аминокислоты 1-269 SEQ ID NO: 11); Swissprot elya_baccs, № доступа P41362 (происходящей из Bacillus clausii, аминокислоты 1-269 SEQ ID NO: 12); и Swissprot elya_bacya, № доступа P20724 (происходящей из Bacillus sp., аминокислоты 1-268 SEQ ID NO: 13); а также их варианты, как определено выше.

Дополнительными конкретными примерами протеаз по изобретению являются протеазы, содержащиеся в следующих коммерческих продуктах: Purafect MA, Purafect, Purafect Ox (вариант M222S), Purafect Prime (Y217L), Properase (S87N + S101G + V104N), FN3 (N76D + S103A + V104I), FN4 (S101G + S103A + V104I + G159D + A232V + Q236H + Q245R + N248D + N252K) - все предпочтительно варианты зрелой части SEQ ID NO: 10 и коммерчески доступные от Genencor/Danisco; Blap (зрелая часть SEQ ID NO: 11 с S99D + S101 R + S103A + V104I + G160S), BLAP R (Blap с S3T + V4I + V199M + V205I + L217D), и BLAP X (Blap с S3T + V4I + V205I) - все от Henkel/Kemira; и KAP (A230V + S256G + S259N) от Kao.

В третьем аспекте протеаза по изобретению представляет собой или может быть рассмотрена как вариант протеазы SEQ ID NO: 2, т.е. она включает, по меньшей мере, одну замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот в аминокислотах 1-274 SEQ ID NO: 2. Предпочтительно, чтобы замены были минорной природы, что означает замены или вставки консервативных аминокислот, которые существенно не влияют на укладку и/или активность белка; небольшие делеции; небольшие амино- или карбоксиконцевые удлинения; такие как аминоконцевой остаток метионина; небольшой линкерный пептид; или небольшое удлинение, которое облегчает очистку путем изменения суммарного заряда или другой функции, такой как полигистидиновый тракт, антигенный эпитоп или связывающий домен. В этом контексте термин «небольшой» независимо обозначает количество до 25 аминокислотных остатков. В предпочтительных осуществлениях термин «небольшой» независимо обозначает до 24, 23, 22, 21 или до 20 аминокислотных остатков. В дополнительных предпочтительных осуществлениях термин «небольшой» независимо обозначает до 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или до 10 аминокислотных остатков. В еще одних предпочтительных осуществлениях термин «небольшой» независимо обозначает до 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или до 1 аминокислотного остатка. В альтернативных осуществлениях термин «небольшой» независимо обозначает до 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27 или до 26 аминокислотных остатков.

Примеры консервативных замен находятся в пределах группы основных аминокислот (аргинина, лизина и гистидина), кислых аминокислот (глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), полярных аминокислот (серина, треонина, глутамина и аспарагина), гидрофобных аминокислот (лейцина, изолейцина, валина и аланина), ароматических аминокислот (фенилаланина, триптофана и тирозина) и малых аминокислот (глицина, аланина, пролина, серина, треонина, цистеина и метионина).

Альтернативно, примеры консервативных замен находятся в пределах группы основных аминокислот (аргинина, лизина и гистидина), кислых аминокислот (глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), полярных аминокислот (глутамина и аспарагина), гидрофобных аминокислот (лейцина, изолейцина и валина), ароматических аминокислот (фенилаланина, триптофана и тирозина) и малых аминокислот (глицина, аланина, серина, треонина и метионина). Аминокислотные замены, которые в целом не изменяют специфическую активность, известны в данной области техники и описаны, например, H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Наиболее часто осуществляемыми заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

Предпочтительные варианты любой из зрелых протеазных частей SEQ ID NO: 5-13, таких как, например, аминокислоты 1-268 SEQ ID NO: 13, включают, по меньшей мере, одну замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот (по сравнению с родительским или предшествующим ферментом, как, например, аминокислоты 1-268 SEQ ID NO: 13), как объяснялось выше для вариантов аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно, эти варианты имеют консервативные аминокислотные замены или вставки, небольшие делеции, небольшие линкеры или имеют небольшие удлинения, как также подробно объяснялось выше для вариантов аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2. Конкретным примером варианта протеазы по изобретению является вариант 99aE SEQ ID NO: 11 (см. пример 4).

В четвертом аспекте протеаза по изобретению имеет аминокислотную последовательность, которая отличается не более чем на 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 или не более чем на 11 аминокислот от аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2; или она отличается от аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2 не более чем на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или не более чем на 1 аминокислоту. В альтернативных осуществлениях протеаза по изобретению имеет аминокислотную последовательность, которая отличается не более чем на 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27 или не более чем на 26 аминокислот от аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2.

Предпочтительные варианты любой из зрелых частей протеазы SEQ ID NO: 5-13, такие как, например, аминокислоты 1-275 SEQ ID NO: 7, имеют аминокислотную последовательность, которая отличается не более чем на 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 или не более чем на 11 аминокислот от зрелых частей любой из SEQ ID NO: 5-13, таких как, например, аминокислоты 1-275 SEQ ID NO: 7; или они отличаются от зрелых частей любой из SEQ ID NO: 5-13, таких как, например, аминокислоты 1-275 SEQ ID NO: 7, не более чем на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или не более чем на 1 аминокислоту.

В пятом аспекте протеаза по изобретению представляет собой аллельный вариант SEQ ID NO: 2 (предпочтительно аллельный вариант ее зрелой части), аллельный вариант любой из SEQ ID NO: 5-13 (предпочтительно аллельный вариант любой из их зрелых частей), или фрагмент любой из них, который обладает протеазной активностью. Термин аллельный вариант обозначает любую из двух или более альтернативных форм гена, встречающихся в том же самом хромосомном локусе. Аллельный вариант возникает естественным образом в результате мутации и может приводить к полиморфизму в популяциях. Мутации гена могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена. Термин фрагмент определяется здесь как полипептид с одной или несколькими аминокислотами, удаленными с амино- или карбоксиконца аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2, или с амино- или карбоксиконца любой из SEQ ID NO: 5-13, предпочтительно из их зрелых частей. Предпочтительно, удаляется небольшое количество аминокислот, причем небольшое определяется, как было объяснено выше. Более предпочтительно фрагмент содержит, по меньшей мере, 244, 245, 246, 247, 248, 249 или, по меньшей мере, 250 аминокислотных остатков. Наиболее предпочтительно фрагмент содержит, по меньшей мере, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272 или, по меньшей мере, 273 аминокислотных остатка.

Таким образом, одно осуществление настоящего изобретения относится к протеазе для фармацевтического применения, где a) протеаза включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2, аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 5, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 6, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 7, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 8, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 9, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 10, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 11, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 12 и аминокислот 1-268 SEQ ID NO: 13; и/или b) протеаза представляет собой вариант аминокислотной последовательности, выбранный из группы, состоящей из аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2, аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 5, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 6, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 7, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 8, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 9, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 10, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 11, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 12 и аминокислот 1-268 SEQ ID NO: 13, где вариант отличается от соответствующей аминокислотной последовательности не более чем на двадцать пять аминокислот и где: (i) вариант включает, по меньшей мере, одну замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью; и/или (ii) вариант включает, по меньшей мере, одну небольшую делецию по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью; и/или (iii) вариант включает, по меньшей мере, одно небольшое N- или C-концевое удлинение по сравнению с соответствующей аминокислотной последовательностью; и/или c) протеаза представляет собой аллельный вариант протеазы, имеющей аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2, аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 5, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 6, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 7, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 8, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 9, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 10, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 11, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 12 и аминокислот 1-268 SEQ ID NO: 13; и/или d) протеаза представляет собой фрагмент протеазы, имеющей аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2, аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 5, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 6, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 7, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 8, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 9, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 10, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 11, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 12 и аминокислот 1-268 SEQ ID NO: 13.

В частности настоящее изобретение относится к протеазе для фармацевтического применения, где протеаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 2, аминокислот 1-274 SEQ ID NO: 5, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 6, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 7, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 8, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 9, аминокислот 1-275 SEQ ID NO: 10, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 11, аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 12 и аминокислот 1-268 SEQ ID NO: 13.

В другом конкретном осуществлении протеаза по изобретению может быть применена в сочетании с дополнительной протеазой. Примерами дополнительных протеаз являются протеазы млекопитающих и микробные протеазы. Предпочтительная протеаза млекопитающих представляет собой экстракт поджелудочной железы, например, свиньи или быка, такой как панкреатин. Панкреатин может быть применен в форме не покрытого (сырого) продукта или в форме продукта состава (покрытого для всасывания в кишечнике (для обеспечения устойчивости к кислоте желудка) или покрытого не функционально (покрытого, но не придающего устойчивость к кислоте желудка)). Панкреатин потенциально еще включает дополнительные ферментативно активные составляющие, такие как панкреатическая липаза, BSSL (липаза, стимулируемая солями желчных кислот) и/или панкреатическая амилаза. Предпочтительные микробные протеазы происходят из штаммов бактерий или грибов, например, из штамма Aspergillus, такого как Aspergillus oryzae или Aspergillus melleus, в частности продукт Prozyme 6™ (нейтральная, щелочная протеаза EC 3.4.21.63), которая коммерчески доступна от Amano Pharmaceuticals, Japan.

Необязательно протеазу по изобретению применяют в сочетании с липазой с или без амилазы, как дополнительно объясняется ниже.

В настоящем контексте липаза означает гидролазу карбонового сложного эфира EC 3.1.1.-, которая включает активности, такие как активности триацилглицероллипазы EC 3.1.1.3, фосфолипазы A1 EC 3.1.1.4, лизофосфолипазы EC 3.1.1.5, галактолипазы EC 3.1.1.26, фосфолипазы A1 EC 3.1.1.32, ферулоилэстеразы EC 3.1.1.73. В конкретном осуществлении липаза представляет собой триацилглицероллипазу EC 3.1.1.3.

В конкретных осуществлениях липаза являются липазой млекопитающих, например, экстрактом поджелудочной железы, например, свиньи или быка, такой как панкреатин. Панкреатин может быть применен в форме не покрытого (сырого) продукта или в форме продукта состава (покрытого для всасывания в кишечнике или покрытого не функционально, как определено выше). Панкреатин потенциально еще включает дополнительные ферментативно активные составляющие, такие как панкреатическая протеаза, BSSL (липаза, стимулируемая солями желчных кислот) и/или панкреатическая амилаза. Липаза может также быть микробной липазой, например, происходящей от штаммов бактерий или грибов, таких как Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus или Rhizopus. Липаза может в частности происходить из штамма Rhizopus, такого как Rhizopus javanicus, Rhizopus oryzae или Rhizopus delemar, например, продукт липаза D Amano 2000™ (также обозначаемый липазой D2™), который коммерчески доступен от Amano Pharmaceuticals, Japan.

В дополнительных конкретных осуществлениях липаза представляет собой микробную липазу, полученную рекомбинантным способом, например, происходящую из грибка, такого как Humicola или Rhizomucor, из дрожжей, таких как Candida или из бактерий, таких как Pseudomonas. В предпочтительном осуществлении липаза происходит из штамма Humicola lanuginosa или Rhizomucor miehei.

Липаза Humicola lanuginosa (синоним Thermomyces lanuginosus) (SEQ ID NO: 14) описана в EP 305216, и конкретные варианты липазы описаны, например, в WO 92/05249, WO 92/19726, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83770, WO 02/055679 и WO 02/066622. Предпочтительный вариант липазы Humicola lanuginosa представляет собой липазу, включающую аминокислоты 1-269 или 2-269 SEQ ID NO: 15, такие как следующие: (i) аминокислоты с +1 по +269 SEQ ID NO: 15, (ii) аминокислоты с -5 по +269 SEQ ID NO: 15, (iii) аминокислоты с -4 по +269 SEQ ID NO: 15; (iv) аминокислоты с -3 по +269 SEQ ID NO: 15; (v) аминокислоты с -2 по +269 SEQ ID NO: 15; (vi) аминокислоты с -1 по +269 SEQ ID NO: 15, (vii) аминокислоты с +2 по +269 SEQ ID NO: 15, а также (viii) любую смесь двух или более липаз (i)-(vii) - а также их варианты. В конкретном осуществлении липаза выбрана из липаз (i), (ii) и любой смеси (i) и (ii). Предпочтительные смеси (i) и (ii) включают, по меньшей мере, 5%, предпочтительно, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или, по меньшей мере, 95% липазы (i), причем проценты определяются секвенированием с N-конца с применением метода Эдмана, как описано в примере 5 заявки PCT, по которой испрашивается приоритет патентной заявки DK 2005 00929. Другие предпочтительные смеси представляют собой: (a) композиции, включающие 35-75%, предпочтительно 40-70%, более предпочтительно 45-65% липазы (ii); (b) композиции, включающие 20-60%, предпочтительно 25-55%, более предпочтительно 30-50%, наиболее предпочтительно 35-47% липазы (i); (c) композиции, включающие до 30%, предпочтительно до 25%, более предпочтительно до 20%, наиболее предпочтительно до 16% липазы (vii); и (d) любое сочетание (a), (b) и/или (c), такое как композиция, включающая 45-65% липазы (ii), 35-47% липазы (i) и до 16% липазы (vii).

Липазы SEQ ID NO: 14 и 15 можно, например, получить как описано в патенте США № 5869438 (SEQ ID NO: 1 в патенте США, на который ссылаются, представляет собой последовательность ДНК, кодирующую липазу SEQ ID NO: 14). Липазу SEQ ID NO: 15 можно, например, получить с помощью рекомбинантной экспрессии в подходящей клетке-хозяине последовательности ДНК, которая представляет собой модификацию SEQ ID NO: 1 патента США, модификацию, отражающую здесь аминокислотные различия между SEQ ID NO: 14 и 15. Такие модификации могут быть получены с помощью сайт-направленного мутагенеза, известного в данной области техники.

Еще одними примерами липаз грибков являются кутиназа из Humicola insolens, которая описана в EP 785994, и фосфолипаза из Fusarium oxysporum, которая описана в EP 869167. Примерами липаз дрожжей являются липаза A и B из Candida Antarctica, из которых липаза A описана в EP 652945, и липаза B описана, например, Uppenberg et al в Structure, 2 (1994), 293. Примером бактериальной липазы является липаза, происходящая из Pseudomonas cepacia, которая описана в EP 214761.

В предпочтительном осуществлении липаза характеризуется, по меньшей мере, 70% идентичностью липазе SEQ ID NO: 15, предпочтительно ее аминокислотам 1-269. В дополнительных предпочтительных осуществлениях степень идентичности SEQ ID NO: 15, предпочтительно ее аминокислотам 1-269, составляет, по меньшей мере, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или, по меньшей мере, 99%. В альтернативных осуществлениях степень идентичности SEQ ID NO: 15, предпочтительно ее аминокислотам 1-269, составляет, по меньшей мере, приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68% или, по меньшей мере, 69%.

В еще одном предпочтительном осуществлении липаза, такая как панкреатическая липаза млекопитающих, является специфической липазой в 1,3-положениях.

Необязательно протеаза по изобретению, с или без описанной здесь липазы, применяется в сочетании с амилазой.

В настоящем контексте амилаза представляет собой фермент, который катализирует эндогидролиз крахмала и других линейных или разветвленных олиго- и полисахаридов. Амилазная часть крахмала обогащена 1,4-альфа-глюкозидными связями, в то время как амилопектинная часть является более разветвленной, содержащей не только 1,4-альфа-, но также 1,6-альфа-глюкозидные связи. В конкретном осуществлении амилаза представляет собой фермент, принадлежащий к группе EC 3.2.1.1.

В конкретных осуществлениях амилаза представляет собой амилазу млекопитающих, например, экстракт поджелудочной железы, свиньи или быка, такой как панкреатин. Панкреатин может быть применен в форме не покрытого (сырого) продукта или в форме продукта состава (покрытого для всасывания в кишечнике или покрытого не функционально, как определено выше). Панкреатин потенциально включает еще дополнительные ферментативно активные составляющие, такие как панкреатическая протеаза, BSSL и/или панкреатическая липаза. Амилаза может быть также микробной амилазой, например, происходящей из штаммов бактерий или грибов, таких как Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus или Rhizopus.

Амилаза может, в частности, происходить из штамма Aspergillus, такого как Aspergillus niger, Aspergillus oryzae или Aspergillus melleus, например, либо из продуктов Amylase A1™, происходящих из Aspergillus oryzae, который коммерчески доступен от Amano Pharmaceuticals, Japan, либо Amylase EC™, происходящей из Aspergillus melleus, который коммерчески доступен от Extract-Chemie, Germany.

Другими примерами амилазы грибков являются амилаза Aspergillus niger (SWISSPROT P56271), которая также описана в примере 3 WO 89/01969, и амилаза Aspergillus oryzae. Примеры вариантов амилазы Aspergillus oryzae описаны в WO 01/34784.

Альфа-амилаза, происходящая из Bacillus licheniformis, является примером бактериальной альфа-амилазы. Эта амилаза описана, например, в WO 99/19467, вместе с другими гомологичными бактериальными альфа-амилазами, происходящими из, например, Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus stearothermophilus, а также с их вариантами. Примерами дополнительных вариантов амилаз являются описанные в патенте США № 4933279; EP 722490 и EP 904360.

Предпочтительными амилазами является амилаза, включающая аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 16 (такие как ее аминокислоты 1-481, 1-484 или 1-486), аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 17 и/или аминокислоты 1-483 SEQ ID NO: 18. В предпочтительном осуществлении амилаза, по меньшей мере, на 70% идентична или (i) аминокислотам 1-481 SEQ ID NO: 16, (ii) аминокислотам 1-481 SEQ ID NO: 17 и/или (iii) аминокислотам 1-483 SEQ ID NO: 18. Амилазы SEQ ID NO: 16-18 можно, например, получить как описано в находящейся одновременно на рассмотрении заявке DK № 2005 00931, озаглавленной «Амилазы для фармацевтического применения» и поданной 24 июня 2005 г. Solvay Pharmaceuticals GmbH и Novozymes A/S.

В дополнительных предпочтительных осуществлениях либо (i), (ii), либо (iii), степени идентичности соответствующим частям SEQ ID NO: 16, 17 или 18 составляет, по меньшей мере, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или, по меньшей мере, 99%. В альтернативных осуществлениях степень идентичности соответствующим частям SEQ ID NO: 16, 17 или 18 составляет, по меньшей мере, приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68% или, по меньшей мере, 69%.

Для целей настоящего изобретения особенно предпочтительными сочетаниями ферментов являются следующие: (i) протеаза с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2 в сочетании с липазой, включающей аминокислоты 1-269 или 2-269 SEQ ID NO: 15; (ii) протеаза с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2 в сочетании с амилазой, включающей аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 16 (такие как ее аминокислоты 1-481, 1-484 или 1-486); (iii) протеаза с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2 в сочетании с амилазой, имеющей аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 17; (iv) протеаза с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2 в сочетании с амилазой, имеющей аминокислоты 1-483 SEQ ID NO: 18; (v) протеаза с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2 в сочетании с амилазой, включающей аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 16 (такие как ее аминокислоты 1-481, 1-484 или 1-486), и липазой, включающей аминокислоты 1-269 или 2-269 SEQ ID NO: 15; (vi) протеаза с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2 в сочетании с амилазой, имеющей аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 17, и липазой, включающей аминокислоты 1-269 или 2-269 SEQ ID NO: 15; и (vii) протеаза с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2 в сочетании с амилазой, имеющей аминокислоты 1-483 SEQ ID NO: 18, и липазой, включающей аминокислоты 1-269 или 2-269 SEQ ID NO: 15.

Соответственно, в одном осуществлении настоящее изобретение относится к протеазе в сочетании с липазой и/или амилазой для фармацевтического применения, где (i) протеаза представляет собой протеазу, как здесь указано; (ii) липаза включает аминокислоты 2-269 SEQ ID NO: 15; и (iii) амилаза представляет собой амилазу, выбранную из группы, состоящей из a) амилазы, включающей аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 16, b) амилазы, имеющей аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 17, и c) амилазы, имеющей аминокислоты 1-483 SEQ ID NO: 18.

В конкретном осуществлении настоящее изобретение относится к протеазе в сочетании с липазой и/или амилазой для фармацевтического применения, где (i) протеаза включает или предпочтительно представляет собой или имеет аминокислоты 1-274 SEQ ID NO: 2; (ii) липаза включает аминокислоты 2-269 SEQ ID NO: 15; и (iii) амилаза представляет собой амилазу, выбранную из группы, состоящей из a) амилазы, включающей аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 16, b) амилазы, имеющей аминокислоты 1-481 SEQ ID NO: 17, и c) амилазы, имеющей аминокислоты 1-483 SEQ ID NO: 18.

Другими предпочтительными сочетаниями ферментов являются следующие: (i) протеаза, имеющая, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, в сочетании с липазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-269 SEQ ID NO: 15; (ii) протеаза, имеющая, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, в сочетании с амилазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-481 SEQ ID NO: 16; (iii) протеаза, имеющая, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, в сочетании с амилазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-481 SEQ ID NO: 17; (iv) протеаза, имеющая, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, в сочетании с амилазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-483 SEQ ID NO: 18; (v) протеаза, имеющая, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, в сочетании с амилазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-481 SEQ ID NO: 16, и с липазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-269 SEQ ID NO: 15; (vi) протеаза, имеющая, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, в сочетании с амилазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-481 SEQ ID NO: 17, и с липазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-269 SEQ ID NO: 15; и (vii) протеаза, имеющая, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-274 SEQ ID NO: 2, в сочетании с амилазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-483 SEQ ID NO: 18, и с липазой, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности с аминокислотами 1-269 SEQ ID NO: 15. В предпочтительных осуществлениях (i)-(vii) степень идентичности каждого независимо составляет, по меньшей мере, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или, по меньшей мере, 99%.

Соответственно, одно осуществление настоящего изобретения относится к протеазе в сочета