Способ производства l-аминокислот

Способ производства l-аминокислот

Реферат

Область техники

Данное изобретение относится к способам получения L-аминокислот с применением бактерий и, конкретнее, к способу получения таких L-аминокислот, как L-лизин, L-треонин и L-глутаминовая кислота. L-лизин и L-треонин применяются как добавки в корм для животных, диетическое питание, экстракты, содержащие аминокислоты, и тому подобное. L-глутаминовая кислота применяется в качестве приправы к пище.

Уровень техники

L-аминокислоты промышленно производятся с помощью ферментации, с применением бактерий, принадлежащих к родам Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia или им подобным. Способы получения L-лизина описаны в EP 0643135 B, EP 0733712 B, EP 1477565 A, EP 0796912 A, EP 0837134 A, WO 01/53459, EP 1170376 A и WO 2005/010175. В этих способах применяются природные бактериальные штаммы либо их искусственные мутанты, также как бактериальные штаммы, модифицированные с помощью технологий рекомбинантных ДНК для повышения активности ферментов, синтезирующих L-аминокислоты.

Ацетил-CoA синтаза катализирует реакцию получения ацетил-CoA, пирофосфата и АМФ из уксусной кислоты, коэнзима А и АТФ, и кодируется геном acs (J Bacteriol. 1995 May; 177(10):2878-86). Однако до сих пор в печати не было сообщений о том, что повышение активности ацетил-CoA синтазы может быть полезно для продукции L-аминокислот.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью данного изобретения является предоставление бактерии, способной к эффективной продукции L-аминокислот, и способа эффективной продукции L-аминокислот с применением данной бактерии.

Авторы настоящего изобретения провели подробные исследования для достижения вышеуказанной цели. В результате, они обнаружили, что продукция L-аминокислот повышается при увеличении количества копий гена acs, кодирующего ацетил-CoA синтазу, в бактериях, продуцирующих L-аминокислоты, и таким образом, осуществили данное изобретение.

Данное изобретение раскрыто, как указано ниже.

Целью данного изобретения является предоставление способа продукции L-аминокислот, включая культивирование бактерий в среде, и получение L-аминокислот из среды либо бактериальных клеток, где указанные бактерии являются производящими L-аминокислоты бактериями, относящимися к семейству Enterobacteriaceae, которые были модифицированы для повышения активности ацетил-CoA синтазы.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, где активность ацетил-CoA синтазы повышена за счет увеличения числа копий гена acs, кодирующего ацетил-CoA синтазу, либо путем модификации последовательностей, регулирующих экспрессию указанного гена.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, где указанный ген acs выбран из группы, включающей:

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3; и

(b) ДНК, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, либо с зондом, полученным из данной нуклеотидной последовательности, в жестких условиях, и где указанная ДНК кодирует белок, обладающий ацетил-CoA синтазной активностью.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, где L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из: L-лизина, L-аргинина, L-гистидина, L-изолейцина, L-валина, L-лейцина, L-треонина, L-фенилаланина, L-тирозина, L-триптофана, L-цистеин, L-глутаминовой кислоты и их комбинации.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, где указанные бактерии принадлежат родам Escherichia, Pantoea, или Enterobacter.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Данное изобретение будет далее описано более подробно.

Бактерии данного изобретения

Бактерии данного изобретения относятся к семейству Enterobacteriaceae, способны к продукции L-аминокислот и модифицированы так, что у них повышена активность ацетил-CoA синтазы (ACS). В этом тексте термин «способность к продукции L-аминокислот» относится к способности продуцировать и аккумулировать L-аминокислоты в среде в количестве, достаточном для выделения, когда бактерии данного изобретения культивируются в среде. Бактерии данного изобретения могут быть способны к продукции множества L-аминокислот. Способность бактерий к продукции L-аминокислот может быть природной, либо получена путем модифицирования бактерии мутированием или с помощью технологий рекомбинантных ДНК, для сообщения бактерии способности к продукции L-аминокислот.

Тип L-аминокислот не ограничен конкретным типом, и примеры их включают основные L-аминокислоты, как L-лизин, L-орнитин, L-аргинин, L-гистидин и L-цитруллин; алифатические L-аминокислоты, как L-изолейцин, L-аланин, L-валин, L-лейцин и L-глицин; гидрокси моноаминокарбоновые кислоты, такие как L-треонин и L-серин; циклические L-аминокислоты, как L-пролин; ароматические L-аминокислоты, такие как L-фенилаланин, L-тирозин, L-триптофан; серосодержащие L-аминокислоты, такие как L-цистеин, L-цистин, L-метионин; кислые L-аминокислоты, такие как L-глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-аспарагин. Бактерии данного изобретения могут быть способны к продукции двух и более типов L-аминокислот.

Обеспечение способности к продукции L-аминокислот

Далее будут описаны способы обеспечения способности к продукции L-аминокислот, также как примеры бактерий, которым может быть придана способность к продукции L-аминокислот. Однако перечень бактерий ими не ограничен при условии, что они обладают способностью к продукции L-аминокислот.

Бактерии, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, включая принадлежащих к родам Escherichia или Pantoea, могут быть использованы как родительский штамм, из которого производятся бактерии данного изобретения. Другие примеры бактерий, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, включают γ-Proteobacteria, такие как Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella и Morganella.

Применяться могут такие бактерии рода Escherichia; опубликованы в Neidhardt et al. ((Backmann, B.J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p.2460-2488. Table 1. In F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.), в частности Escherichia coli. Примеры штаммов Escherichia coli дикого типа включают штамм K-12 или его производные, Escherichia coli штамм MG1655 (ATCC No. 47076), и штамм W3110 (ATCC No. 27325). Эти штаммы доступны в American Type Culture Collection (ATCC) (Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America).

Примеры бактерий Enterobacter включают Enterobacter agglomerans и Enterobacter aerogenes, а примером бактерии Pantoea является Pantoea ananatis. Недавно, Enterobacter agglomerans в некоторых случаях была классифицирована как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рибосомальной РНК. Следовательно, бактерии данного изобретения могут относиться к любому роду Enterobacter или роду Pantoea, при условии, что они классифицированы как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae. Когда Pantoea ananatis выведены с применением технологий генной инженерии, могут быть использованы штамм Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), штамм AJ13356 (FERM BP-6615), штамм AJ13601 (FERM BP-7207), их производные и им подобные. Эти штаммы были идентифицированы и представлены для регистрации как Enterobacter agglomerans, когда они были выделены, но как описано выше, эти штаммы были переклассифицированы как Pantoea ananatis на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рибосомальной РНК.

Способность к продукции L-аминокислот может быть придана родительским штаммам следующим образом.

С целью обеспечения способности к продукции L-аминокислот могут применяться методики, используемые при традиционном разведении Escherichia coli либо им подобных, такие как получение ауксотрофных мутантов, штаммов, устойчивых к аналогам, или штаммов, мутантных по регуляции обмена веществ; либо создание рекомбинантных штаммов, имеющих повышенную экспрессию ферментов, синтезирующих L-аминокислоты (Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press, first edition publication: May 30, 1986, p.77 to 100). В данном изобретении такие свойства, как ауксотрофность, устойчивость к аналогам, мутации регуляции метаболизма, могут быть сообщены бактериям независимо либо в комбинации со способностью к продукции L-аминокислот. Более того, может быть усилена экспрессия одного или более фермента, синтезирующего L-аминокислоты. Кроме того, сообщение бактериям таких свойств как ауксотрофность, устойчивость к аналогам, мутации регуляции метаболизма может быть скомбинировано с повышенной экспрессией ферментов, синтезирующих L-аминокислоты.

Ауксотрофные мутантные штаммы, штаммы, устойчивые к аналогам L-аминокислот, и штаммы, несущие мутации в регуляции метаболизма, которые обладают способностью к продукции L-аминокислот, могут быть получены следующим образом. Родительский штамм либо штамм дикого типа подвергается типичной мутагенной обработке, такой как облучение рентгеновскими или ультрафиолетовыми лучами, или подвергается воздействию мутагена, включая N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) и этилметансульфонат (EMS), с последующей селекцией штаммов, демонстрирующих ауксотрофность, устойчивость к аналогам или мутации регуляции метаболизма и обладающих способностью к продукции L-аминокислот.

Методики генной рекомбинации включают повышение экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в биосинтез целевой L-аминокислоты, и снижение экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в деградацию целевой L-аминокислоты.

В дальнейшем в этом документе будут представлены примеры бактерий, которым сообщена способность к продукции L-аминокислот, но разновидности бактерий, применяемых в способе изобретения, не ограничены этими примерами.

Бактерии, продуцирующие L-треонин

Примеры родительских штаммов для производства L-треонина-продуцирующих бактерий данного изобретения включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (патент США No. 5175107, патент США No. 5705371), E.coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (патент США No. 5631157), E.coli NRRL-21593 (патент США No. 5939307), E.coli FERM BP-3756 (патент США No. 5474918), E.coli FERM BP-3519 и FERM BP-3520 (патент США No. 5376538), E.coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)), E.coli VL643 и VL2055 (EP 1149911 A) и подобные.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, а также сахарозо-усваивающим, а ген ilvA имеет мутацию с сохранением остаточного уровня экспрессии. Этот штамм также имеет мутацию в гене rhtA, которая придает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм B-3996 содержит pVIC40, полученный инсерцией оперона thrA*BC, содержащего мутантный ген thrA, в вектор - производный RSF1010. Этот мутантный ген thrA кодирует аспартокиназу гомосерин дегидрогеназу I, которая существенно снижает восприимчивость к ингибированию треонином по принципу обратной связи. Штамм B-3996 был представлен к регистрации 19 ноября 1987 во Всесоюзном Научном Центре Антибиотиков (ул. Нагатинская 3-A, 117105 Москва, Российская Федерация) под инвентарным номером RIA 1867. Этот штамм также был представлен к регистрации в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) (Россия, 117545 Москва, Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 под инвентарным номером B-3996.

E.coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) также может быть использован для получения бактерий данного изобретения, продуцирующих L-треонин. Штамм B-5318 является прототрофным относительно изолейцина, а регуляторная область треонинового оперона в плазмиде pVIC40 замещена температуро-зависимым репрессором С1 и PR промотором фага лямбда. Штамм VKPM B-5318 был представлен к регистрации в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) (Россия, 117545 Москва, Дорожный проезд, 1) 3 мая 1990 под инвентарным номером VKPM B-5318.

Предпочтительно, бактерии данного изобретения дополнительно модифицированы с целью повышения экспрессии одного или более генов из следующего списка:

- мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу гомосерин дегидрогеназу I, которая обеспечивает устойчивость к ингибированию треонином по принципу обратной связи;

- ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу;

- ген thrC, кодирующий треонинсинтазу;

- ген rhtA, кодирующий предполагаемый трансмембранный белок;

- ген asd, кодирующий аспартат-β-семиальдегид дегидрогеназу; и

- ген aspC, кодирующий аспартат аминотрансферазу (аспартат трансаминазу).

Последовательность гена Escherichia coli thrA, который кодирует аспартокиназу гомосерин дегидрогеназу I, была установлена (номера нуклеотидов с 337 по 2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). Ген thrA расположен между генами thrL и thrB на хромосоме E.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена Escherichia coli thrB, который кодирует гомосерин киназу, была установлена (номера нуклеотидов с 2801 по 3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). Ген thrB расположен между генами thrA и thrC на хромосоме E.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена Escherichia coli thrC, который кодирует треонин синтазу, была установлена (номера нуклеотидов с 3734 по 5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). Ген thrC расположен между геном thrB и открытой рамкой считывания yaaX на хромосоме E.coli K-12. Все три гена функционируют вместе как треониновый оперон. Чтобы повысить экспрессию треонинового оперона, область аттенюатора, которая прерывает транскрипцию, может быть удалена из оперона (WO2005/049808, WO2003/097839).

Мутированный ген thrA, кодирующий аспартокиназу гомосерин дегидрогеназу I, обеспечивающую устойчивость к ингибированию треонином по принципу обратной связи, также как гены thrB и thrC, могут быть получены как один оперон из хорошо известной плазмиды pVIC40. Эта плазмида присутствует в штамме E.coli VKPM B-3996, продуцирующем треонин, и подробно описана в патенте США №5705371.

Ген rhtA расположен на 18 мин на хромосоме E.coli, близко к оперону glnHPQ, кодирующему компоненты системы транспорта глутамина. Ген rhtA идентичен ORPl (ybiF ген, номера нуклеотидов с 764 по 1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181) и расположен между генами pexB и ompX. Последовательность, ответственная за экспрессию белка, кодируемого ORFl, была обозначена ген rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine) (устойчивость к гомосерину и треонину). Также, мутация rhtA23 - это замена A-на-G в позиции -1 относительно старт-кодона ATG (ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).

Нуклеотидная последовательность гена asd E.coli уже определена (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307), и может быть получена методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), используя праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.

Также, нуклеотидная последовательность гена aspC E.coli уже определена (номера нуклеотидов с 983742 по 984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895), и может быть получена методом ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.

Бактерии, продуцирующие L-лизин

Примеры бактерий, продуцирующих L-лизин и относящихся к роду Escherichia включают мутантов, обладающих устойчивостью к аналогам L-лизина. Аналоги L-лизина подавляют рост бактерий, относящихся к роду Escherichia, но это подавление полностью или частично снижено, когда L-лизин также присутствует в среде. Примеры аналогов L-лизина включают, но не ограничены, оксализин, лизин гидроксамат, S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (AEC), γ-метил лизин, α-хлоркапролактам и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к этим аналогам лизина, могут быть получены путем подвержения бактерий рода Escherichia стандартной искусственной мутагенной обработке. Конкретные примеры штаммов бактерий, применяемых для продукции L-лизина, включают Escherichia coli AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; см патент США No. 4346170) и Escherichia coli VL611. У этих микроорганизмов снижена чувствительность к ингибированию аспартокиназы L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC 196 может применяться как продуцирующие L-лизин бактерии вида Escherichia coli. Этот бактериальный штамм был выведен путем сообщения штамму W3110, происходящему из Escherichia coli K-12, свойства устойчивости к AEC. Полученный итоговый штамм был обозначен Escherichia coli AJ 13069 и был представлен к регистрации в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (currently National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 6 декабря 1994 и получил инвентарный номер FERM P- 14690. Затем он был конвертирован в международный депозит по условиям Будапештского соглашения 29 сентября 1995, и получил инвентарный номер FERM BP-5252 (патент США No. 5827698).

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-лизин, также включают штаммы, в которых повышена экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты, синтезирующих L-лизин. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничены, дигидро дипиколинат синтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидро дипиколинат редуктазу (dapB), диамино пимелат декарбоксилазу (lysA), диамино пимелат дегидрогеназу (ddh) (патент США No. 6040160), фосфоенолпируват карбоксилазу (ppc), аспартат семиальдегид дегидрогеназу (asd) и аспартазу (aspA) (EP 1253195 A). Дополнительно, родительский штамм может иметь повышенную экспрессию гена, вовлеченного в энергетический обмен (cyo) (EP 1170376 A), гена, кодирующего никотинамид нуклеотид трансгидрогеназу (pntAB) (патент США No. 5830716), гена ybjE (WO 2005/073390), гена gdh (Gene23: 199-209(1983)), гена arcA (EP 1382686 A) или их комбинации.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-лизин, также включают штаммы, имеющие сниженную либо элиминированную активность ферментов, катализирующих реакцию синтеза другого вещества, кроме L-лизина, при ответвлении в биосинтетическом пути метаболизма L-лизина. Примеры ферментов, катализирующих реакцию синтеза другого вещества, кроме L-лизина, при ответвлении в биосинтетическом пути метаболизма L-лизина, включают гомосерин дегидрогеназу (WO 95/23864), лизин декарбоксилазу (патент США No. 5827698) и декарбоксилирующую малатдегидрогеназу (WO 2005/010175).

У Escherichia coli лизин декарбоксилазы кодируются геном cadA (Genbank Accession No. NP_418555, SEQ ID NO: 5) и геном ldcC (Genbank Accession No. NP_414728, SEQ ID NO: 7) (WO 96/17930), следовательно, эти гены могут быть нарушены с целью повышения способности к продукции L-лизина. Молекулы ДНК, гомологичные, генам cadA и ldcC, могут применяться ввиду того, что они способны приводить к гомологичной рекомбинации с генами cadA и ldcC на хромосоме бактерии-хозяина. Например, молекула ДНК, гомологичная гену cadA, может гибридизоваться с комплементарной цепью SEQ ID NO: 5 в жестких условиях, а молекула ДНК, гомологичная гену ldcC, может гибридизоваться с комплементарной цепью SEQ ID NO: 7 в жестких условиях.

Бактерии, продуцирующие L-цистеин

Примеры родительских штаммов для производства L-цистеин-продуцирующих бактерий данного изобретения включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli JM 15, трансформированный разными аллелями cysE, кодирующих устойчивые к регуляции по принципу обратной связи серин ацетилтрансферазы (патент США No. 6218168, патентная заявка России 2003121601), E.coli W3110, у которого повышена экспрессия генов, кодирующих белки, участвующие в секреции токсичных веществ (патент США No. 5972663), штаммы E.coli со сниженной активностью цистеин десульфогидразы (JP11155571A2); E.coli W3110 с повышенной активностью положительного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (WO 0127307A1), и тому подобные.

Бактерии, продуцирующие L-лейцин

Примеры родительских штаммов для производства L-лейцин-продуцирующих бактерий данного изобретения включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы E.coli, устойчивые к лейцину (например, штамм 57 (VKPM B-7386, патент США No. 6124121)) или аналогам лейцина, включая β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин, 5,5,5-трифторлейцин (JP 62-34397 B и JP 8-70879 A); штаммы E.coli, полученные по методикам генной инженерии (описаны в WO 96/06926); E.coli H-9068 (JP 8-70879 A) и подобные.

Бактерии данного изобретения могут быть улучшены путем повышения экспрессии одного или более генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры этих генов включают таковые из оперона leuABCD, который предпочтительно содержит мутированный leuA ген, кодирующий изопропилмалат синтазу, устойчивую к регуляции L-лейцином по принципу обратной связи (патент США 6403342). В дополнение, бактерии данного изобретения могут быть улучшены путем повышения экспрессии одного или более генов, кодирующих белки, которые выводят L-аминокислоты из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (EP 1239041 A2).

Бактерии, продуцирующие L-гистидин

Примеры родительских штаммов для производства L-гистидин-продуцирующих бактерий данного изобретения включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli штамм 24 (VKPM B-5945, RU2003677); E.coli штамм 80 (VKPM B-7270, RU2119536); E.coli NRRL B-12116 - B12121 (патент США No. 4388405); E.coli H-9342 (FERM BP-6675) и H-9343 (FERM BP-6676) (патент США No. 6344347); E.coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087); E.coli AI80/pFM201 (патент США No. 6258554) и подобные.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-гистидин, также включают штаммы, в которых повышена экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры этих ферментов биосинтеза L-гистидина включают АТФ фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил АМФ циклогидролазу (hisl), фосфорибозил-АТФ пирофосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазол карбоксамид риботид изомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинол фосфат аминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и так далее.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI) ингибируются L-гистидином, и, следовательно, L-гистидин-продуцирующая способность также может быть эффективно повышена введением мутации в АТФ фосфорибозилтрансферазу (hisG), обеспечивающей устойчивость к ингибированию по принципу обратной связи (патенты РФ №№.2003677 и 2119536).

Конкретные примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают E.coli FERM-P 5038 и 5048, которые были трансформированы вектором, несущим кодирующую ДНК для фермента биосинтеза L-гистидина (JP 56-005099 A), штаммы E.coli, трансформированные rht, геном для экспорта аминокислот (EP 1016710 A), штамм E.coli 80, обеспеченный сульфагуанидином, DL-1,2,4-триазол-3-аланином, и устойчивостью к стрептомицину (VKPM B-7270, патент РФ No. 2119536) и так далее.

Бактерии, продуцирующие L-глутаминовую кислоту

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli VL334thrC⁺ (EP 1172433). E.coli VL334 (VKPM B-1641) являются ауксотрофами по L-изолейцину и L-треонину, и мутированы по генам thrC и ilvA (патент США No. 4278765). Аллель дикого типа гена thrC был передан неспецифической трансдукцией с применением бактериофага P1, растущем на штамме дикого типа E.coli K12 (VKPM B-7). В результате, был получен ауксотрофный по L-изолейцину штамм VL334thrC⁺ (VKPM B-8961).

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, включают (но не ограничены ими) штаммы, в которых повышена экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры ферментов биосинтеза L-глутаминовой кислоты включают глутаматдегидрогеназу (gdhA), глутаминсинтазу (glnA), глутаматсинтазу (gltAB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируват карбоксилазу (ppc), пируватдегидрогеназу (aceEF, lpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируват синтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA), фосфоглицерат киназу (pgk), глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (gapA), триозо фосфат изомеразу (tpiA), фруктозобифосфат альдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pfkA, pfkB) и глюкозофосфат изомеразу (pgi).

Примеры штаммов, модифицированных так, что повышена экспрессия генов цитрат синтазы, фосфоенолпируват карбоксилазы и/или глутамат дегидрогеназы, включают таковые, раскрытые в EP 1078989 A, EP 955368 A и EP 952221 A.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, также включают штаммы, имеющие сниженную либо элиминированную активность ферментов, катализирующих реакцию синтеза другого вещества, кроме L-глутаминовой кислоты, при ответвлении в биосинтетическом пути метаболизма L-глутаминовой кислоты. Примеры подобных ферментов включают изоцитрат лиазу, α-кетоглутарат дегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетат киназу, синтазу ацетогидроксикислот, ацетолактат синтазу, формат ацетилтрансферазу, лактат дегидрогеназу и глутамат декарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие роду Escherichia, дефицитные по активности α-кетоглутарат дегидрогеназы, либо имеющие сниженную активность α-кетоглутарат дегидрогеназы, и способы их получения описаны в патент США №№5378616 и 5573945.

Конкретнее, эти штаммы включают следующие:

E.coli W3110sucA::Kmr

E.coli AJ12624 (FERM BP-3853)

E.coli AJ12628 (FERM BP-3854)

E.coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E.coli W3110sucA::Kmr получен при нарушении гена α-кетоглутарат дегидрогеназы (далее в этом тексте называемый "ген sucA") в E.coli W3110. Этот штамм полностью дефицитен по α-кетоглутарат дегидрогеназе.

Другие примеры родительских штаммов для производства бактерий, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, включают таковые, принадлежащие к роду Escherichia, и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты. Эти штаммы также могут быть дефицитны по активности α-кетоглутарат дегидрогеназы и включают, к примеру, E.coli AJ13199 (FERM BP-5807) (патент США No. 5908768), FERM P-12379, у которого дополнительно снижена интенсивность разложения L-глутаминовой кислоты (патент США №5393671); AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США No. 6,110,714) и подобные.

Примеры бактерий, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, включают мутантные штаммы, относящиеся к роду Pantoea, дефицитные по активности α-кетоглутарат дегидрогеназы, либо имеющие сниженную активность α-кетоглутарат дегидрогеназы, и могут быть получены, как описано выше. Такие штаммы включают Pantoea ananatis AJ13356 (патент США No. 6331419). Pantoea ananatis AJ13356 был представлен к регистрации в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (сейчас, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля 1998 под инвентарным номером FERM P-16645. Затем он был конвертирован в международный депозит по условиям Будапештского Соглашения 11 января 1999, и получил инвентарный номер FERM BP-6615.

Pantoea ananatis AJ13356 дефицитны по активности α-кетоглутарат дегидрогеназы, как результат нарушения гена субъединицы αKGDH-El (suсA). Вышеуказанный штамм был идентифицирован как Enterobacter agglomerans, когда он был выделен и представлен к регистрации как Enterobacter agglomerans AJ13356. Однако недавно он был переклассифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рибосомальной РНК и так далее. Хотя AJ13356 был представлен к регистрации в вышеуказанный депозитарий как Enterobacter agglomerans, в целях описания изобретения, они описаны как Pantoea ananatis.

Бактерии, продуцирующие L-фенилаланин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-фенилаланин, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli AJ12739 (tyrA::Tnl0, tyrR) (VKPM B-8197); E.coli HW1089 (ATCC 55371), содержащий ген pheA34 (патент США №5354672); E.coli MWEC101-b (KR8903681); E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 и NRRL B-12147 (патент США №4407952). Также, в качестве родительского штамма могут применяться E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB], называемый AJ 12604 (FERM BP-3579), (EP 488424 B1). Кроме того могут применяться L-фенилаланин - продуцирующие бактерии, относящиеся к роду Escherichia, у которых повышена активность белка, кодируемого генами yedA или yddG (патентные заявки США 2003/0148473 A1 и 2003/0157667 A1).

Бактерии, продуцирующие L-триптофан

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-триптофан, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), дефицитные по триптофан тРНК синтазе, кодируемой мутантным геном trpS (патент США No. 5756345); E.coli SV 164 (pGH5), имеющий аллель гена serА, кодирующий фосфоглицерат дегидрогеназу, устойчивую к ингибированию по принципу обратной связи серином, и аллель trpE, кодирующий антранилат синтазу, устойчивую к ингибированию по принципу обратной связи триптофаном (патент США №6180373); E.coli AGXl7 (pGX44) (NRRL B-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), дефицитные по ферменту триптофаназе (патент США №4371614); E.coli AGXl7/рGX50, pACKG4-pps, в котором повышена способность к продукции фосфоенолпирувата (WO9708333, патент США №6319696), и подобные. Кроме того, могут применяться бактерии, продуцирующие L-триптофан, относящиеся к роду Escherichia, у которых повышена активность белка, кодируемого генами yedA или yddG (патентные заявки США 2003/0148473 A1 и 2003/0157667 A1).

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L- триптофан, также включают штаммы, у которых повышена активность одного или более фермента из списка: антранилатсинтаза (trpE), фосфоглицерат дегидрогеназа (serA) и триптофансинтаза (trpAB). Антранилат синтаза и фосфоглицерат дегидрогеназа обе являются мишенью ингибирования по принципу обратной связи триптофаном или серином, так что мутации, снижающие чувствительность к регуляции по принципу обратной связи, могут быть введены в гены этих ферментов. Конкретные примеры штаммов, несущих подобные мутации, включают E.coli SV 164, у которого снижена чувствительность антранилат синтазы, и штамм, полученный трансформацией плазмидой pGH5 в E.coli SVl64 (WO 94/08031), содержащей ген serА, мутированный таким образом, что у кодируемой фосфоглицерат дегидрогеназы снижена чувствительность к регуляции по принципу обратной связи.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-триптофан, также включают штаммы, трансформированные триптофановым опероном, который содержит ген, кодирующий нечувствительную антранилатсинтазу (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, патент США №4371614). Более того, способность к продукции L-триптофана может быть сообщена путем увеличения экспрессии гена, кодирующего триптофан синтазу, внутри триптофанового оперона (trpBA). Триптофан синтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются генами trpA и trpB, соответственно. Дополнительно, способность к продукции L-триптофана может быть усилена путем повышения экспрессии изоцитрат лиазного - малатсинтазного оперона (WO 2005/103275).

Бактерии, продуцирующие L-пролин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-пролин, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli 702ilvA (VKPM B-8012), который дефицитен по гену ilvA и способен продуцировать L-пролин (EP 1172433).

Бактерии данного изобретения могут быть улучшены путем повышения экспрессии одного или более гена, вовлеченного в биосинтез L-пролина. Примеры предпочтительных генов для L-пролин - продуцирующих бактерий включают ген proB, кодирующий глутамат киназу, нечувствительную к регуляции по принципу обратной связи L-пролином (DE Patent 3127361). Дополнительно, бактерии данного изобретения могут быть улучшены путем повышения экспрессии одного или более генов, кодирующих белки, участвующие в выводе L-аминокислот из бактериальной клетки. Такие гены включают b2682 и b2683 (ygaZH гены) (EP 1239041 A2).

Примеры бактерий, относящихся к роду Escherichia, которые способны продуцировать L-пролин, включают следующие штаммы E.coli: NRRL B-12403 и NRRL B-12404 (патент GB 2075056), VKPM B-8012 (патентная заявка России 2000124295), мутанты плазмид, описанные в патенте DE 3127361, мутанты плазмид, описанные Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные.

Бактерии, продуцирующие L-аргинин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-аргинин, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli штамм 237 (VKPM B-7925) (патентная заявка США 2002/058315 A1) и его производные штаммы, несущие мутантную N-ацетилглутамат синтазу (патентная заявка России №2001112869), E.coli штамм 382 (VKPM B-7926) (EP 1170358 A1), аргинин - продуцирующий штамм, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутамат синтазу (EP1170361A1) и подобные.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-аргинин, также включают штаммы, в которых повышена экспрессия одного или более гена, вовлеченного в биосинтез L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамил фосфат редуктазу (argC), орнитин ацетил трансферазу (argJ), N-ацетилглутамат киназу (argB), ацетилорнитин трансаминазу (argD), орнитин карбамоил трансферазу (argF), аргининсукцинат синтазу (argG), аргининсукцинат лиазу (argH), и карбамоилфосфат синтазу (carAB).

Бактерии, продуцирующие L-валин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-валин, включают (но не ограничены ими) штаммы, модифицированные для гиперэкспрессии оперона ilvGMEDA (патент США No. 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, которая необходима для аттенюации, так чтобы экспрессия оперона не прерывалась уже произведенным L-валином. Кроме того, ген ilvA в опероне желательно нарушить, так чтобы снизилась активность треониндеаминазы. Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-валин, также включают мутанты по амино - ацил тРНК синтазе (патент США No. 5658766). Например, может применяться E.coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин тРНК синтазу. E.coli VL 1970 был представлен к регистрации в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) (Россия, 113545, Москва, Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 под инвентарным номером VKPM B-4411.

Кроме того, могут использоваться мутанты, которым для роста требуется липоевая кислота, и/или не имеющие H⁺-АТФазу (WO 96/06926).

Бактерии, продуцирующие L-изолейцин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-изолейцин, включают (но не ограничены ими) мутанты, обладающие устойчивостью к 6-диметиламинопурину (JP 5-304969 A), мутанты, обладающие устойчивостью к аналогам изолейцина, таким как тиаизолейцин и изолейцин гидроксамат, и мутанты, дополнительно обладающие устойчивостью к DL-этионину и/или аргинин гидроксамату (JP 5-130882 A). В дополнение, также могут применяться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, которые кодируют белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцин, такие как треонин деаминаза и ацетогидроксат синтаза (JP 2-458 A, FR 0356739, и патент США No. 5998178).

Повышение активности ACS

Бактерии данного изобретения могут быть получены путем модификации бактерий, обладающих способностью к продукции L-аминокислот, как описано выше, таким образом, что повышается активность ACS. Однако способность к продукции L-аминокислот может быть сообщена бактериям после модификации, увеличивающей активность ACS. Как описано ниже, активность ACS может быть усилена путем повышения экспрессии гена, кодирующего белок с активностью ACS, что достигается при повышении экспрессии эндогенного гена с помощью модификаций областей, регулирующих экспрессию, таких как промотор, либо при повышении экспрессии экзогенного гена с помощью введения плазмиды, содержащей ген, или подобное. Дополнительно, эти способы могут быть скомбинированы.

В настоящем изобретении термин «активность ACS» обозначает способность (EC 6.2.1.1) катализировать реакцию получения ацетил-CoA, пирофосфата и АМФ из уксусной кислоты, коэнзима А (CoA) и АТФ.

уксусная кислота + коэнзим А (CoA) + АТФ = ацетил-CoA + пирофосфат + АМФ

Также, было опубликовано, что ACS катализирует реакцию получения пропионил-CoA из пропионовой кислоты (Eur J Biochem 2002; 269(24); 6184-94), и было опубликовано, что ACS может функционировать в качестве 4-кумарат-CoA лигазы (Genome Biol 4(9); R54).

коэнзим А + пропионовая кислота + АТФ = пропионил-CoA + пирофосфат + АМФ

коэнзим А + 4-кумарат + АТФ = кумароил-CoA + пирофосфат + АМФ

Повышение активности ACS может быть подтверждено при измерении количества ацетогидроксамовой кислоты, получаемой преобразованием ацетил-CoA, произведенным in vitro с помощью вышеуказанной реакции (Meth. Enzymol. 1, 585-591).

Фраза «модифициро