Способ получения нелетучих продуктов микробного метаболизма в твердой форме

Способ получения нелетучих продуктов микробного метаболизма в твердой форме

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение касается ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма в твердой форме посредством размола, сжижения и осахаривания источников крахмала, выбираемых из зерен злаковых культур, и использования полученной при этом содержащей сахар жидкой среды для ферментации.

Способы получения нелетучих продуктов микробного метаболизма, например, аминокислот, витаминов и каротиноидов, посредством микробной ферментации, в общем, известны. В зависимости от условий процесса при этом используют различные источники углерода. Разнообразные варианты включают в себя чистую сахарозу, мелассу из свекловичного и тростникового сахара, так называемые „high test molasses" (высокосахаристые мелассы, обращенные тростниково-сахарные мелассы), вплоть до глюкозы из гидролизатов крахмала. Кроме того, для биотехнологического производства L-лизина в качестве дополнительных субстратов, применение которых возможно в технических масштабах, применяют уксусную кислоту и этанол (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol.79 (2003), 59-112).

На использовании указанных источников углерода основаны различные методы и способы ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма на базе сахара. На примере L-лизина, Pfefferle et al. (указ. соч.) описывают эти процессы с точки зрения развития штаммов, процесса и промышленного производства.

Важный источник ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма, опосредованного микроорганизмами, - это крахмал. Прежде чем его можно будет использовать как источник углерода в ферментации, на предшествующих этапах реакции его необходимо подвергнуть сжижению и осахариванию. Крахмал для этих целей получают из натуральных источников крахмала, например картофеля, маниока, злаков, например пшеницы, кукурузы, ячменя, ржи, тритикале или риса, обычно прошедших предварительную очистку, а затем ферментативным способом сжижают и осахаривают, чтобы использовать его затем собственно в ферментации для производства желаемых продуктов метаболизма.

Помимо использования источников крахмала, прошедших такую предварительную очистку, описано также применение источников крахмала, не прошедших предварительную обработку, для создания источников углерода для ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма. Обычно источники крахмала при этом сначала измельчают размолом. Продукт помола затем подвергают сжижению и осахариванию. Поскольку этот продукт помола, естественно, состоит помимо крахмала еще и из ряда не содержащих крахмала компонентов, оказывающих отрицательное влияние на ферментацию, эти компоненты перед ферментацией обычно отделяют. Отделение можно проводить либо непосредственно после размола (международная заявка WO 02/277252; патентные заявки Японии JP 2001-072701; JP 56-169594; патент КНР CN 1218111), после сжижения (международная заявка WO 02/277252; патент КНР CN 1173541) или после осахаривания (патент КНР CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp.Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229). Во всех вариантах, однако, в ферментации используют гидролизат крахмала высокой очистки.

В более новых способах используют, в частности, улучшенные методы, которые должны обеспечить возможность очищать, например, сжиженные и осахаренные растворы крахмала перед ферментацией (патент Японии JP 57159500) и ферментационные среды из возобновляемых ресурсов (европейский патент ЕР 1205557).

С другой стороны, широко известно масштабное применение необработанных источников крахмала при ферментативном получении биоэтанола. При этом получил широкое промышленное применение способ, известный как „Dry-milling" («сухой размол»), включающий в себя сухой размол, сжижение и осахаривание источников крахмала. Описание этого процесса приведено, например, в „The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, и в McAloon et al., „Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks", NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.

В способе сухого размола на первом этапе цельные зерна злаков, предпочтительно кукурузы, пшеницы, ячменя, проса и ржи, подвергают тонкому помолу. В отличие от способа влажного размола, так называемого „Wet-Milling", при этом не добавляют жидкость. Размол на мелкие частицы предназначен для того, чтобы обеспечить доступ воды и ферментов к содержащемуся зернах крахмалу в последующих процессах сжижения и осахаривания.

Поскольку при ферментативном получении этанола биологического происхождения конечный продукт получают дистилляцией, использование источников крахмала в неочищенной форме после процессов сухого размола не представляет особой проблемы. При использовании же способа сухого размола для получения нелетучих продуктов микробного метаболизма возникает проблема, состоящая в потоке твердого вещества, вносимого сахарным раствором в ферментацию, поскольку оно может как отрицательно сказаться на ферментации, так и существенно осложнить последующую переработку.

Так, для многих видов ферментации лимитирующим фактором является снабжение кислородом применяемых микроорганизмов, в особенности, когда их потребность в кислороде высока. О влиянии высокого содержания твердых веществ на переход кислорода из газовой фазы в жидкую и, таким образом, на уровень кислородного обмена известно в общем мало. С другой стороны, известно, что рост вязкости, связанный с повышением концентрации твердых веществ, снижает уровень кислородного обмена. Если, кроме того, в ферментационную среду с твердыми веществами вводят поверхностно-активные вещества, последние влияют на склонность пузырьков газа к коагуляции. Обусловленная этим величина пузырьков, в свою очередь, существенно влияет на кислородный обмен (Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370).

Из-за внесения твердых веществ уже при создании крахмалсодержащей суспензии возможно достижение критических величин вязкости используемой среды, поскольку гомогенное перемешивание, например, суспензии, содержащей более 30% масс. кукурузной муки в воде, невозможно (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T.Godfrey, S.West, 1996). Поэтому концентрация глюкозы при использовании обычных технологий ограничена. По экономическим причинам, как правило, не выгодно работать с растворами более низкой концентрации, поскольку это ведет к чрезмерному разбавлению ферментационного бульона. Это обуславливает снижение достижимой конечной концентрации итоговых продуктов, что ведет к дополнительным расходам при получении их из ферментационной среды, а пространственно-временной выход снижается, что ведет к потребности в больших объемах, т.е. к росту инвестиций при неизменной производительности.

Ввиду этих сложностей известные доныне варианты способов сухого размола непригодны для подготовки источников крахмала для ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма, а поэтому не имеют заметного экономического значения. На настоящий момент имеются описания попыток переноса концепции сухого размола и принципиальных преимуществ, связанных с этим способом, на получение нелетучих продуктов микробного метаболизма в промышленных масштабах только при использовании маниока в качестве источника крахмала.

Так, в патентной заявке Японии JP 2001/275693 описан способ ферментативного получения аминокислот, при котором в качестве источника крахмала используют очищенные от кожуры клубни маниока, которые размалывают в сухом виде. Для проведения процесса по этому способу, однако, необходимо задать в продукте помола размер частиц не более 150 мкм. При используемой для этого фильтрации перед сжижением/осахариванием имеющегося крахмала и последующей ферментацией происходит отделение более 10% масс. используемого продукта помола, включая не содержащие крахмала компоненты. Похожий способ описан в патентной заявке Японии JP 2001/309751 для получения кормовой добавки, содержащей аминокислоты.

По сравнению с другими источниками крахмала, в частности злаками или зернами злаков, маниок, однако, относительно прост для сухого размола. В то время как типичное содержание крахмала в корнях маниока составляет в сухом состоянии, по меньшей мере, 80% масс. (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava, Biotechnology and Bioengineering, Bd. 20 (4), 1978, John Wiley and Sons, Inc., Tabelle 1, Seite 558), в злаках это содержание крахмала в сухом состоянии значительно ниже, как правило, менее 70% масс., например ок. 68% масс. у кукурузы, а у пшеницы - ок. 65% масс. (Jaques et al., The Alcohol Textbook, cm. выше). Соответственно, раствор глюкозы, получаемый после сжижения и осахаривания, содержит при использовании размолотого сухим способом маниока относительно мало посторонних компонентов, а в частности меньше твердых веществ. Эти посторонние компоненты, а особенно не содержащие крахмала твердые вещества, как оказалось, представляют собой проблему при использовании зерен злаков в качестве источников крахмала, поскольку доля этих твердых веществ в таких источниках крахмала значительно выше, чем в маниоке. Ввиду повышенного количества посторонних компонентов, в частности, существенно возрастает вязкость реакционной смеси.

Следует полагать, что крахмал из маниока относительно легко подвергается обработке. Он, правда, обладает более высокой вязкостью при температуре набухания, чем кукурузный крахмал, но зато при росте температуры вязкость в случае маниока снижается быстрее, чем, например, у кукурузного крахмала (Menezes, T.J.B. de, Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production, Process Biochemistry, 1978, Seite 24, правый столбец). Кроме того, температуры набухания и желатинизации крахмала из маниока ниже, чем таковые крахмала из злаков, например маиса, а поэтому его доступность для бактериальной α-амилазы выше, чем крахмала из злаков (Menezes, T.J.B. de, a.a.O.).

К прочим преимуществам маниока по сравнению с источниками крахмала из злаков относятся низкое содержание в ней клетчатки и фитатов. Клетчатка и полуклетчатка, особенно при осахаривании в кислой среде, могут быть преобразованы в фурфуролы (Jaques et al., The Alcohol Textbook, cm. выше; Menezes, T.J.B. de, см. выше), которые, в свою очередь, могут оказывать ингибирующее воздействие на используемые в ферментации микроорганизмы. Фитат также ингибирует используемые в ферментации микроорганизмы.

Соответственно, хотя технически и возможно перерабатывать маниок в качестве источника крахмала способом, соответствующим понятию сухого размола, такой способ на основе маниока тем не менее сложен, не оптимизирован и, следовательно, не слишком широко распространен. Об использовании в качестве источников крахмала злаков в способе, соответствующем понятию сухого размола, для получения продуктов тонких химических технологий, например нелетучих продуктов микробного метаболизма, до сих пор не сообщали.

В международной заявке WO 2005/116228 впервые описан способ ферментации на основе сахара, предназначенный для получения продуктов тонких химических технологий, при котором в качестве источника крахмала используют продукт помола зерен злаков или других сухих плодов или семян зерновых, не удаляя не содержащие крахмала компоненты перед ферментацией. Полноценное удаление летучих компонентов из ферментационного бульона с получением твердого вещества, содержащего продукт ферментации, не описано.

Задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы предложить эффективный способ для ферментативного получения на основе сахара нелетучих продуктов микробного метаболизма, допускающий использование в качестве источников крахмала злаков, включая кукурузу. Способ должен давать возможность легко обрабатывать ферментационную смесь, в частности, посредством сушки. Кроме того, он должен отличаться простотой обращения с применяемыми средами, а в особенности, позволять обойтись перед ферментацией без сложных этапов предварительной или дополнительной очистки, как, например, отделения твердых компонентов, не содержащих крахмал.

В рамках проведенных фирмой-заявителем работ неожиданно было обнаружено, что такой способ, несмотря на свойственное ему большое количество вносимых твердых веществ, можно эффективно применять, если для получения содержащей сахар жидкой среды проводить в жидкости на основе воды сжижение продукта помола, полученного из зерен злаков, в присутствии, по меньшей мере, одного фермента, сжижающего крахмал, а затем осахаривать, используя, по меньшей мере, один осахаривающий фермент, причем, по меньшей мере, одну долю продукта помола в процессе сжижения добавляют непрерывным или периодическим образом в жидкость на водной основе.

Объектом изобретения, таким образом, является способ получения, по меньшей мере, одного нелетучего продукта микробного метаболизма в твердой форме посредством микробной ферментации на основе сахара, при котором культивируют штамм микроорганизмов, производящий желаемый продукт (желаемые продукты) метаболизма, с использованием содержащей сахар жидкой среды, имеющей содержание моносахаридов более 20% масс. от общей массы жидкой среды, а затем удаляют основную часть летучих компонентов ферментационного бульона, причем содержащую сахар жидкую среду создают посредством:

а1) получения продукта помола размолом источника крахмала, выбранного из зерен злаков; и

а2) сжижения продукта помола в жидкости на основе воды в присутствии, по меньшей мере, одного сжижающего крахмал фермента и последующего осахаривания с применением, по меньшей мере, одного осахаривающего фермента,

отличающийся тем, что, по меньшей мере, одну долю продукта помола в процессе сжижения непрерывным или периодическим образом добавляют в жидкость на водной основе.

Источниками крахмала являются, в первую очередь, сухие плоды или семена зерновых, которые в сухом состоянии характеризуются долей крахмала не менее 40% масс., а предпочтительно не менее 50% масс. Таковые имеются во многих широкомасштабно культивируемых на сегодняшний день злаковых растениях, например кукурузе, пшенице, овсе, ячмене, ржи, тритикале, рисе и в различных сортах проса, например сорго и белом сорго. Предпочтительно выбирать источник крахмала из группы, включающей зерна кукурузы, ржи, тритикале и пшеницы. В принципе, способ согласно изобретению можно также применять и с использованием аналогичных источников крахмала, как, например, смеси различных содержащих крахмал плодов или семян зерновых.

Сахара, содержащиеся в жидкой среде согласно изобретению, содержащей сахар, представляют собой в основном моносахариды, например гексозы и пентозы, например глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, сорбозу, ксилозу, арабинозу и рибозу, в особенности глюкозу. Доля отличных от глюкозы моносахаридов может варьировать в зависимости от используемого источника крахмала и имеющихся в его составе не содержащих крахмала компонентов, а посредством вариантов применения способа, например посредством включения компонентов клетчатки ввиду добавления целлюлаз, на нее можно влиять. Целесообразно, чтобы моносахариды содержащей сахар жидкой среды включали в себя глюкозу в количестве не менее 60% масс., предпочтительно не менее 70% масс., а особо предпочтительно не менее 80% масс. от общего количества сахара, имеющегося в содержащей сахар жидкой среде. Обычно доля глюкозы находится в пределах от 75 до 99% масс., в частности от 80 до 97% масс., а особенно от 85 до 95% масс. от общего количества сахара, имеющегося в содержащей сахар жидкой среде.

Концентрация моносахаридов, в особенности концентрация глюкозы, в получаемой согласно изобретению жидкой среде часто составляет, по меньшей мере, 25% масс., предпочтительно не менее 30% масс., особо предпочтительно не менее 35% масс., в частности не менее 40% масс., например от 25 до 55% масс., в частности от 30 до 52% масс., особо предпочтительно от 35 до 50% масс., а в особенности от 40 до 48% масс. от общей массы жидкой среды.

Согласно изобретению жидкая среда, содержащая сахар, в которой культивируют штамм микроорганизмов, производящий желательные продукты метаболизма, содержит, по меньшей мере. часть, предпочтительно не менее 20% масс., в частности не менее 50% масс., в особых случаях не менее 90% масс., а в весьма специальных случаях не менее 99% масс. имеющихся в размолотых зернах злаков не содержащих крахмал твердых компонентов, соответственно степени помола. При расчете относительно содержащих крахмал компонентов продукта помола (и, соответственно, относительно количества моносахарида в содержащей сахар жидкой среде) доля не содержащих крахмал твердых компонентов предпочтительно составляет не менее 10% масс., в частности не менее 25% масс., например от 25 до 75% масс., а в особых случаях от 30 до 60% масс.

Для получения содержащей сахар жидкой среды на этапе а1) конкретный источник крахмала с добавлением жидкости, например воды, или без такового размалывают, предпочтительно, без добавления жидкости. Возможно также сочетание сухого размола с последующим мокрым размолом. Для сухого размола, как правило, используют молотковые дробилки, роторные мельницы или вальцовые дробилки, для мокрого размола пригодны смесители, шаровые мельницы с мешалкой, циркуляционные мельницы, дисковые мельницы, мельницы с кольцевой камерой, вибрационные или планетарные мельницы. В принципе, возможно использование и других мельниц. Необходимое для мокрого размола количество жидкости специалист может определить в процессе проведения опытов. Обычно его задают так, чтобы содержание сухого вещества находилось в пределах от 10 до 20% масс.

Размолом задают величину зерна (частиц), пригодную для последующих этапов способа. При этом оказалось целесообразно, чтобы при размоле, особенно в случае сухого размола, продукт помола, получаемый на этапе а1), содержал частицы муки, т.е. компоненты в виде частиц, с размером в пределах от 100 до 630 мкм в количестве от 30 до 100% масс., предпочтительно от 40 до 95% масс., а особо предпочтительно от 50 до 90% масс. Целесообразно, чтобы полученный продукт помола содержал 50% масс. частиц муки размером более 100 мкм. Как правило, по меньшей мере 95% масс. полученных при размоле частиц муки обладают размером менее 2 мм. Измерение размера частиц при этом проводят посредством ситового анализа с использованием вибрационной анализирующей машины.

Малый размер частиц принципиально выгоден для достижения высокого выхода продукции. Слишком малый размер частиц, однако, может вызвать проблемы, в частности, ввиду образования комьев/агломерации при подмешивании продукта помола во время сжижения или последующей обработки, например, при сушке твердых веществ после этапа ферментации.

Для обозначения видов муки обычно используют степень помола или тип муки, причем они соотносятся друг с другом так, что с ростом степени помола возрастает также и характеристическое число типа муки. Степень помола соответствует массе полученной муки относительно 100 частей размалываемого материала. В то время как на начальных этапах размола получают чистую и наиболее тонкую муку, например, из внутренней части зерна при дальнейшем размоле, то есть при возрастании степени помола, возрастает доля грубых волокон и пленчатость (доля оболочек), а доля крахмала при этом уменьшается. Степень размола, следовательно, отображается также в так называемых типах муки, которые указывают в числах и используют для классификации муки, особенно муки злаковых, и которые основаны на содержании в муке золы (так называемая шкала зольности). Типы муки или номер типа при этом означает количество зол (минеральных веществ) в мг, которое остается при сжигании 100 г сухой муки. Для муки злаковых более высокий номер типа означает более высокую степень помола, поскольку внутренняя часть зерна злаковых содержит ок. 0,4% масс., а оболочка, напротив, ок. 5% масс. золя. Следовательно, при более низкой степени помола мука злаковых состоит преимущественно из измельченного эндосперма, т.е., крахмалистой части зерен злаковых; при более высокой степени помола мука злаковых содержит также измельченный алейроновый слой зерен злаковых, богатый белком, а в случае продуктов грубого дробления еще и компоненты зародышей, содержащие белок и жир, а также оболочек семян, содержащих грубые волокна и золи. Для целей согласно изобретению предпочтительны виды муки с высокой степенью помола либо высоким типовым числом. Если в качестве источника крахмала используют злаковые, то предпочтительно размалывать и подвергать дальнейшей обработке целые неочищенные зерна, при необходимости, после предварительного механического отделения зародышей и лузги.

Для сжижения крахмала в продукте помола на этапе а2) в реактор в процессе сжижения и предпочтительно перед осахариванием вводят, по меньшей мере, часть продукта помола, предпочтительно не менее 40% масс., в частности не менее 50% масс., а крайне предпочтительно не менее 55% масс. Добавленное количество продукта помола не должно превышать 90% масс., в частности 85% масс, а особо предпочтительно 80% масс. от общего количества используемого продукта помола. Обычно часть продукта помола, добавляемую в реактор в процессе сжижения, вводят в тех условиях, которые и имеются при сжижении. Добавление можно осуществлять периодическим способом, т.е. частями в виде нескольких порций, которые в каждом случае составляют не более 20% масс., особо предпочтительно не более 10% масс., например от 1 до 20% масс., в особенности от 2 до 10% масс. общего количества подлежащего сжижению продукта помола, или же непрерывно. В рамках изобретения существенно, чтобы к началу сжижения в реакторе находилась только часть продукта помола, предпочтительно не более 60 вес.%, в особенности не более 50 вес.%, а особо предпочтительно не более 45 вес.% продукта помола, а остальное количество продукта помола добавляли во время сжижения.

Продукт помола можно вводить в виде порошка, т.е. без добавления воды, или в виде суспензии в жидкости на основе воды, например в чистой воде, рециркулированной воде из процесса, например из ферментации или из последующей обработки.

Сжижение также можно проводить непрерывно, например, в многоступенчатом каскаде реакций.

Согласно изобретению сжижение на этапе а2) происходит в присутствии, по меньшей мере, одного сжижающего крахмал фермента, который целесообразно выбирать из α-амилаз. Также возможно применение других сжижающих крахмал ферментов, активных и устойчивых в условиях этой реакции.

Нижеследующие варианты исполнения касаются применения α-амилаз; они, однако, действительны вообще для всех ферментов, сжижающих крахмал.

α-Амилаза (либо используемый фермент, сжижающий крахмал) может быть заранее помещена в реакционный сосуд или же добавлена во время проведения этапа а2). Предпочтительно часть α-амилазы, необходимой на этапе а2), добавляют в начале этапа а2) или же помещают эту часть в реактор заранее. Общее количество α-амилазы обычно лежит в пределах от 0,002 до 3,0% масс., предпочтительно от 0,01 до 1,5% масс., а особо предпочтительно от 0,02 до 0,5% масс. от общего количества используемого источника крахмала.

Сжижение можно проводить при температуре выше или ниже температуры желатинизации. Предпочтительно сжижение на этапе а2) проводят, по крайней мере, некоторое время выше температуры желатинизации используемого крахмала (так называемый Cooking Prozess). Как правило, выбирают температуру в пределах от 70 до 165°С, предпочтительно от 80 до 125°С, а особо предпочтительно от 85 до 115°С, причем предпочтительно, чтобы температура превышала температуру желатинизации, по меньшей мере, на 5°С, а особо предпочтительно, не менее чем на 10°С.

Для оптимизации эффективности α-амилазы этап а2) целесообразно проводить, по меньшей мере, на протяжении некоторого времени при величине рН, лежащей в слабокислой области, предпочтительно между 4,0 и 7,0, особо предпочтительно от 5,0 до 6,5, причем обычно в начале этапа а2) или перед ним устанавливают величину рН; эту величину целесообразно контролировать и, при необходимости, корректировать во время сжижения. Установку величины рН предпочтительно проводить с помощью разбавленных минеральных кислот, например H₂SO₄ или H₃PO₄, либо же с помощью разведенных щелочей, например водного раствора едкого натра (NaOH) или едкого кали (КОН), или с помощью гидроксидов щелочноземельных металлов, например водного раствора гидроксида кальция.

В предпочтительной форме исполнения этап а2) способа согласно изобретению проводят так, чтобы часть, составляющую не более 60% масс., предпочтительно максимум 50% масс., а особо предпочтительно максимум 45% масс., например от 10 до 60% масс., в особенности от 15 до 50% масс., а особо предпочтительно 20 - 45% масс., от общего количества продукта помола суспендировать в жидкости на основе воды, например в чистой воде, рециркулированной воде из процесса, например из ферментации или из последующей обработки или в смеси этих жидкостей, а затем проводить сжижение. Жидкость, используемая для приготовления суспензии продукта помола, может быть предварительно подогрета до слегка повышенной температуры, например в пределах от 40 до 60°С. Предпочтительно, чтобы температура жидкости, используемой для приготовления суспензии продукта помола, не превышала 30°С, а в особенности равнялась комнатной температуре, т.е. от 15 до 28°С.

Затем в эту суспензию вводят, по меньшей мере, один фермент, сжижающий крахмал, предпочтительно α-амилазу. Если используют α-амилазу, то целесообразно добавлять лишь часть α-амилазы, например от 10 до 70% масс., а в особенности от 20 до 65% масс. от общего количества применяемой на этапе а2) α-амилазы. Добавленное к этому моменту количество α-амилазы задают соответственно активности конкретной α-амилазы относительно используемого источника крахмала с учетом условий реакции, оно располагается обычно в пределах от 0,0004 до 2,0% масс., предпочтительно от 0,001 до 1,0% масс., а особо предпочтительно от 0,02 до 0,3% масс. от общего количества используемого источника крахмала. В качестве альтернативы можно смешать эту часть α-амилазы с используемой жидкостью перед созданием суспензии.

При этом целесообразно добавлять часть α-амилазы в суспензию перед началом нагрева до температуры, имеющей место при сжижении, в частности при комнатной температуре или при лишь слегка повышенной температуре, например в пределах от 20 до 30°С.

Целесообразно выбирать количества α-амилазы и продукта помола так, чтобы вязкость во время процесса осахаривания, в особенности во время процесса желатинизации, оказывалась снижена достаточно, чтобы было возможно эффективное перемешивание суспензии, например, мешалкой. Предпочтительно, чтобы вязкость реакционной смеси во время желатинизации составляла не более 20 Па·с, особо предпочтительно максимум 10 Па·с, а крайне предпочтительно максимум 5 Па·с. Измерение вязкости осуществляют, как правило, вискозиметром Haake типа Roto Visko RV20 с измерительной системой М5 и измерительным устройством MVDIN при температуре 50°С и скорости сдвига, составляющей 200 с^-1.

Приготовленную таким образом суспензию затем целесообразно нагреть до температуры выше температуры желатинизации используемого крахмала. Как правило, выбирают температуру в пределах от 70 до 165°С, предпочтительно от 80 до 125°С, а особо предпочтительно от 85 до 115°С, причем предпочтительно, чтобы температура превышала таковую желатинизации, по меньшей мере, на 5°С, а особо предпочтительно не менее чем на 10°С. Контролируя вязкость, последовательно добавляют в суспензию дальнейшие количества продукта помола, например, порциями, составляющими в каждом случае от 2 до 20% масс., а особенно, от 5 до 10% масс. от общего количества используемого продукта помола. Предпочтительно добавлять в реакционную смесь в процессе сжижения подлежащую введению долю продукта помола не менее чем 2, предпочтительно не менее чем 4 и особо предпочтительно не менее чем 6 порциями. В качестве альтернативы можно осуществлять добавление части продукта помола, не введенной при приготовлении суспензии, непрерывно в процессе сжижения. Температуру при введении целесообразно поддерживать выше температуры желатинизации крахмала. Предпочтительно осуществлять добавление продукта помола таким образом, чтобы вязкость реакционной смеси во время добавления или же во время сжижения составляла не более 20 Па·с, особо предпочтительно максимум 10 Па·с и крайне предпочтительно не более 5 Па·с.

После добавления всего продукта помола реакционную смесь обычно некоторое время, например от 30 до 60 минут или дольше, если это необходимо, выдерживают при температуре, установленной выше температуры желатинизации крахмала, при этом крахмальные компоненты продукта помола вывариваются. Затем реакционную смесь, как правило, охлаждают до несколько более низкой температуры, превышающей температуру желатинизации, например до 75-90°С, после чего добавляют еще одну часть α-амилазы, предпочтительно основную часть. В зависимости от активности используемой α- амилазы при условиях реакции, количество α-амилазы, добавляемой в этот момент, предпочтительно составляет от 0,002 до 2,0% масс., особо предпочтительно от 0,01 до 1,0% масс., а крайне предпочтительно от 0,02 до 0,4% масс. от общего количества используемого источника крахмала.

При таких температурах происходит разрушение гранулированной структуры крахмала (желатинизация), благодаря чему становится возможно его ферментативное расщепление (сжижение). Для полного расщепления крахмала до декстринов реакционную смесь выдерживают при заданной температуре или, при необходимости, дополнительно нагревают до тех пор, пока тест на крахмал с использованием йода или, при необходимости, иной тест на наличие крахмала не даст отрицательный или в основном отрицательный результат. При необходимости, в реакционную смесь при этом можно ввести еще одну или несколько порций α-амилазы, например, в пределах от 0,001 до 0,5% масс., а предпочтительно от 0,002 до 0,2% масс. от общего количества используемого источника крахмала.

По завершении сжижения крахмала проводят осахаривание содержащихся в жидкой среде декстринов, т.е. их разложение до глюкозы, непрерывным или периодическим способом, предпочтительно непрерывным. Сжиженную среду можно полностью осахарить в специальном баке осахаривания, прежде чем подать ее на этап ферментации b). С другой стороны, оказалось выгодно проводить перед ферментацией лишь частичное осахаривание. Например, возможен такой образ действий, при котором осахаривают часть содержащихся в жидкой среде декстринов, например, в пределах от 10 до 90% масс., а особенно в пределах от 20 до 80% масс. от общей массы декстринов (или исходного крахмала), а полученную жидкую среду, содержащую сахар, используют в ферментации. В ферментационной среде в таком случае может происходить дальнейшее осахаривание in situ. Также возможно проведение осахаривания без использования отдельного бака осахаривания непосредственно в ферментаторе (in situ).

Преимущества осахаривания по месту, т.е. осахаривания, происходящего частично или полностью в ферментаторе, состоят, с одной стороны, в снижении капиталовложений, а с другой - благодаря замедленному высвобождению глюкозы можно, при необходимости, заранее создать повышенную концентрацию в порции (Batch) без того, чтобы наступило ингибирование или изменение метаболизма используемых микроорганизмов. В случае E.coli, повышенная концентрация глюкозы ведет, например, к образованию органических кислот (ацетата), в то время как Saccharomyces cerevisae в этом случае, например, переключается на сбраживание, хотя в вентилируемых ферментаторах достаточно кислорода (эффект Крэбтри). Замедленное высвобождение глюкозы можно обеспечить, регулируя концентрацию глюкоамилазы. Благодаря этому можно подавить вышеупомянутые эффекты, и можно заранее разместить больше субстрата, так что разведение, создаваемое поступающим потоком, может быть снижено.

В случае раздельного осахаривания, например осахаривания в баке осахаривания, сжиженный раствор крахмала обычно охлаждают или подогревают до температурного оптимума осахаривающего фермента или чуть ниже его, например до температуры от 50 до 70°С, предпочтительно от 60 до 65°С, а затем добавляют к нему глюкоамилазу.

Если осахаривание проводят в ферментаторе, сжиженный раствор крахмала, как правило, охлаждают до температуры ферментации, т.е. до 32-37°С, прежде чем подавать его в ферментатор. Глюкоамилазу (или же иной, по меньшей мере, один осахаривающий фермент) для осахаривания в этом случае добавляют непосредственно в ферментационный бульон. Осахаривание сжиженного крахмала по этапу а2) при этом происходит параллельно метаболизации сахара микроорганизмами.

Перед добавлением глюкоамилазы целесообразно довести величину рН жидкой среды до величины, лежащей в диапазоне оптимальной эффективности используемой глюкоамилазы, предпочтительно в пределах от 3,5 до 6,0; особо предпочтительно от 4,0 до 5,5 и крайне предпочтительно от 4,0 до 5,0. Также, однако, возможно, особенно при проведении осахаривания непосредственно в ферментаторе, установить рН вне упомянутых выше диапазонов, например в пределах от 6,0 до 8,0. Например, при производстве лизина, пантотената и витамина 82, несмотря на ограниченную активность стандартных глюкоамилаз в этом диапазоне рН, это может быть в общем целесообразно или необходимо по причине заданных условий ферментации.

В предпочтительной форме исполнения осахаривание проводят в специальном баке осахаривания. Для этого доводят температуру сжиженного раствора крахмала до оптимальной для фермента температуры или таковой несколько ниже, а величину рН доводят описанным выше способом до оптимальной для фермента.

Глюкоамилазу добавляют в содержащую декстрины жидкую среду обычно в количестве от 0,001 до 5,0% масс., предпочтительно от 0,005 до 3,0% масс., а особо предпочтительно от 0,01 до 1,0% масс.от общего количества использованного источника крахмала. После добавления глюкоамилазы содержащую декстрины суспензию целесообразно выдерживать на протяжении некоторого времени, например от 2 до 72 часов или более, в той мере, в которой это необходимо, в особенности от 5 до 48 часов, при заданной температуре, причем происходит осахаривание декстринов до моносахаридов. Прогресс осахаривания можно отслеживать известными специалисту методами, например ВЭЖХ, ферментными тестами или стержнями для теста на глюкозу. Осахаривание завершено, когда концентрация моносахаридов в основном прекращает расти или начинает опять уменьшаться.

В предпочтительной форме исполнения добавление продукта помола осуществляют в присутствии, по меньшей мере, одной α-амилазы, а также, по меньшей мере, одной глюкоамилазы на этапе а2) таким образом, чтобы вязкость жидкой среды составляла не более 20 Па·с, особо предпочтительно максимум 10 Па·с и крайне предпочтительно не более 5 Па·с. Для поддержания контроля вязкости оказалось целесообразно добавлять, по меньшей мере, 25% масс., предпочтительно не менее 35% масс. и особо предпочтительно не менее 50% масс. общего количества добавляемого продукта помола при температуре выше температуры желатинизации содержащегося в продукте помола крахмала. На регулирование вязкости можно также влиять, добавляя, по меньшей мере, один фермент, сжижающий крахмал, предпочтительно α-амилазу, или/и, по меньшей мере, один осахаривающий фермент, предпочтительно глюкоамилазу, также порциями.

Проводя этапы а1) и а2), можно создать содержащую сахар жидкую среду с концентрацией моносахаридов, в частности, содержанием глюкозы предпочтительно более 25% масс., например более 30% масс. или более 35% масс., особо предпочтительно более 40% масс., например от 25 до 55% масс., в частности, от 30 до 52% масс., особо предпочтительно от 35 до 50% масс., а в особенности от 40 до 48% масс. от общей массы жидкой среды. Общее содержание твердых веществ в жидкой среде тогда составляет обычно от 30 до 70% масс., нередко от 35 до 65% масс., в особенности от 40 до 60% масс. Концентрация моносахаридов, в частности глюкозы, и содержание твердых веществ зависят, известным образом, от соотношения продукта помола, используемого при сжижении, и количества жидкости, а также от доли крахмала в продукте помола.

Для сжижения крахмальной доли в продукте помола можно, в принципе, использовать все α-амилазы (класс ферментов ЕС 3.2.1.1), в частности α-амилазы, которые получают из Bacillus lichenformis или Bacillus staerothermophilus, а в особенности таковые, применяемые д