Способ получения 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона из андрост-4-ен-3,17-диона, способ получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона (эксеместана) с использованием полученного 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона

Способ получения 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона из андрост-4-ен-3,17-диона, способ получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона (эксеместана) с использованием полученного 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области органического синтеза и биотехнологии, конкретно касается получения стероидного соединения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона и может быть использовано в химической, микробиологической и фармацевтической отраслях промышленности.

6-Метиленандроста-1,4-диен-3,17-дион (6-метилен-АДД, МНН эксеместан) - высокоэффективный современный инактиватор ароматазы, известный под торговым названием «Аромазин» (Производитель «Pharmacia Italia», Италия), который широко применяется в терапии злокачественных новообразований молочной железы [US 4808616, 1989; D.Giudici, G.Ornati, G.Briatico, F.Buzzetti, P.Lombardi and E. di Salle Journal of Steroid Biochemistry, Volume 30, Issues 1-6, 1988, Pages 391-394]. Клинические испытания показали высокую эффективность и безопасность эксеместана при лечении женщин в постменопаузе (естественной или индуцированной), страдающих метастатическим раком молочной железы, прогрессирующим на фоне терапии антиэстрогенами, нестероидными ингибиторами ароматазы или прогестинами [М.Б.Стенина «Ингибиторы ароматазы в лечении диссеминированного рака молочной железы у больных в менопаузе». Материалы IV ежегодной российской онкологической конференции. Москва, 21-23 ноября 2000 г.].

Известны способы получения эксеместана 1,2-дегидрированием 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона (6-метилен-АД).

Известны способы 1,2-дегидрирования 6-метилен-АД с использованием химических дегидрирующих агентов. Так, известны способы получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона дегидрированием 6-метилен-АД с использованием 2,3-дихлор-5,6-дициан-1,4-бензохинона (DDQ) при кипячении реакционной массы в диоксане в течение 15 ч (выход 50,3%) [GB 2177700, 1987, пример 1] или в инертном растворителе в течение 8 ч в присутствии ароматической карбоновой кислоты (выход 50,7%) [CN 1453288, 2003].

Известны способы получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона дегидрированием 6-метилен-АД с использованием двуокиси селена (кипячение в среде трет-бутилового спирта в течение 30 ч, выход 40,2%) [GB 2177700, 1987, пример 2] или с использованием 2-йодоксибензойной кислоты [CN 1491957, 2004].

Также известен процесс получения эксеместана реакцией дегидрирования 6-метилен-АД в 1,2-положение в присутствии хинона, силилирующего агента и кислоты, имеющей рКа в водном растворе ≤1 [WO 2009/077454, 2009, пример 1]. При этом в качестве хинона используют 2,3,5,6-тетрахлор-1,4-бензохинон (хлоранил), в качестве силилирующего агента используют бис(триметилсилил)трифторацетамид, в качестве сильной кислоты - трифторметансульфоновую кислоту; технический продукт, Полученный с выходом 81,8% продукт перекристаллизовывают, однако выход очищенного продукта не указан. Так, известен способ получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона реакцией 6-метилен-АД с хлоранилом в удобном растворителе, в качестве которого применяют диметилсульфоксид (ДМСО) или N-метилпирролидин (NМП) [WO 2009093262, 2009]. При этом из 100 г 6-метилен-АД (пример 3) получают лишь 55 г эксеместана 97,3% содержания.

Известен способ получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона, в котором дегидрирование 6-метилен-АД осуществляется бромированием 6-метилен-АД бромом в органическом растворителе при температуре от 0 до 10°С с образованием трибром-соединения, дебромированием трибром-соединения реакцией с йодидом щелочного металла в органическом кетонном растворителе с образованием 2-бромпроизводного 6-метилен-АД и дегидробромированием 2-бромпроизводного 6-метилен-АД реакцией с основным агентом в полярном растворителе (при температуре 120°С в течение 2,5 ч, общий выход 40,13%) [US 4990635, 1991, примеры 2-4] (Рисунок 1).

Рисунок 1. Синтез эксеместана из 6-метилен-АД химическими методами

Общим недостатком химических методов 1,2-дегидрирования является использование дорогостоящих и токсичных реагентов, жесткие условия проведения реакций, а также в большинстве случаев необходимость применения колоночной хроматографии для очистки, и как следствие низкий выход эксеместана.

Известно введение 1,2-двойной связи в стероидную молекулу с использованием методов микробиологической трансформации.

Осуществление сложных полиферментных процессов в одну технологическую стадию в мягких условиях, относительно высокие выходы получаемых целевых продуктов, возможность ингибирования побочных реакций определяют перспективность использования микроорганизмов в качестве биокатализаторов реакции 1,2-дегидрирования, в частности, для получения эксеместана.

В качестве биокатализаторов процесса 1,2-дегидрирования используют культуры с 3-кетостероид-Δ¹-дегидрогеназой (ЕС 1.3.99.4) родов: Arthrobacter, Alternaria, Alcaligenes, Calonectria, Ophiobolus, Corynebacterium, Bacillus, Nocardia, Streptomyces, Bacterium, Mycobacterium, Fusarium, Cylindrocarpon, Pseudomonas, Protaminobacter, Septomyxa, Didymella и др. [Charney W., Herzog H. Microbial transformation of Steroids. Academic Press. Inc. New York. 1967, pp.236-261]. Наиболее часто для проведения процесса 1,2-дегидрирования стероидных соединений ряда прегнана и андростана используются штаммы вида Arthrobacter simplex.

Биоконверсию проводят, используя культуральную жидкость, нативные клетки (60-85% влажности) [US 4749649, 1988], высушенные клетки, полученные при обработке ацетоном, высушенные в вакууме или на воздухе при нагревании [US 4704358, 1987], в условиях лиофилизации, а также используют бесклеточные экстракты, полученные при ультразвуковом разрушении или разрушенные при пропускании замороженных клеток через фильеры под давлением [EP 0350488, 1993]. Для того чтобы исключить дополнительные технологические этапы, предпочтительно использование нативных клеток.

Основной проблемой получения 1,2-дегидрированных производных ряда андростана, в частности эксеместана, микробиологическим способом, является малая эффективность процесса, обусловленная низкой растворимостью субстрата в водной среде, необходимостью в этих условиях использования малых концентраций для создания условий его доступности клеткам микроорганизмов и для достижения максимально полного превращения в продукт.

Для достижения в среде более высокой концентрации стероидных субстратов и повышения эффективности процесса 1,2-дегидрирования применяют органические растворители, несмешивающиеся с водой, в количестве, необходимом для растворения исходного субстрата.

Так, известен способ превращения 1,2-насыщенного стероида в 1,2-дегидростероид, который включает взаимодействие 1,2-насыщенного стероида с Arthrobacter simplex или Bacterium cyclooxydans в присутствии экзогенного носителя электронов, несмешивающегося с водой ароматического углеводородного растворителя, где концентрация кислорода поддерживается на уровне минимальной концентрации кислорода, необходимой для окисления, или где реакция осуществляется ниже температуры вспышки смеси при условии, что 1,2-насыщенный стероид имеет растворимость в несмешивающемся с водой ароматическом углеводородном растворителе, более чем 5 г/л [US 4684610, 1987]. Процесс проводят в двухфазной системе, используя несмешивающиеся с водой органические растворители: бензол, толуол, ксилол.

Также известен способ получения 1,2-дегидро-3-кетостероида, который заключается в том, что 1,2-насыщенный 3-кетостероид подвергают взаимодействию с Arthrobacter simplex или Bacterium cyclooxydans в присутствии экзогенного носителя электронов и несмешивающегося с водой растворителя, включая ароматические углеводороды [GB 2131811, 1984]. Согласно этому способу (примеры 1 и 2) процесс трансформации проводят клетками A. simplex в присутствии менадиона в среде K₂HPO₄ буферного раствора (pH 7.5), содержащей до 10% толуола, в течение 4 дней.

Недостатком данных способов является необходимость создания и строгого поддержания минимально допустимой концентрации растворенного кислорода в среде, чтобы избежать вспышки паров газовоздушной смеси и в то же время обеспечить оптимальные условия для процесса окисления субстрата. Осуществление данных способов требует специального технологического оборудования, что фактически исключает их практическую реализацию в условиях промышленного производства. Однако известными способами получают андроста-1,4-диен-3,17-дион (АДД) из андрост-4-ен-3,17-диона (АД), андроста-1,4,9(11)-триен-3,17-дион (Δ⁹⁽¹¹⁾-АДД) из андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона (Δ⁹⁽¹¹⁾-АД), а также другие 1,2-дегидропроизводные ряда андростана, и в них не описано получение эксеместана (6-метилен-АДД) из 6-метилен-АД.

Известно, что экзогенные акцепторы электронов - феназинметосульфат (ФМС), менадион (2-метил-1,4-нафтохинон), 1,4-нафтохинон, менадион бисульфит - используют не только для стимулирования процесса 1,2-дегидрирования стероидных соединений, но также и для ингибирования побочных реакций восстановительного характера и деструктивной активности клеток микроорганизмов. Образование побочных продуктов, деструкция целевого продукта снижают выход основного продукта.

В процессах микробиологической трансформации стероидных соединений наряду с использованием органических растворителей несмешивающихся с водой, используют смешивающиеся с водой органические растворители, такие как диметилсульфоксид, диметилформамид, метанол, этанол, ацетон и т.п.

Описано применение диметилформамида (ДМФ) и диметилсульфоксида (ДМСО) в качестве смешивающихся с водой органических растворителей, используемых в процессах микробиологического 1,2-дегидрирования.

Например, известен способ получения 1,2-дегидро-Δ⁴-3-кетостероида, который заключается в том, что соответствующий 1,2-насыщенный Δ⁴-3-кетостероид подвергают взаимодействию с высушенными на воздухе или в тепле клетками Arthrobacter simplex, содержащими от 1 до 10% влаги, где клетки высушены в отсутствии органического растворителя [US 4524134, 1985]. Согласно способу (пример 2) суспензию микронизированного субстрата в ДМФ вносят в фосфатный буферный раствор (pH 7.5), содержащий суспензию высушенных клеток A. simplex АТСС 6946 (10 г/л) и менадион (86 мг/л). При этом концентрация ДМФ в среде составляет 2% v/v, а 1,2-дегидрирование проводят с нагрузкой субстрата 2.5 г/л в течение 24 ч при температуре 31^оС. Однако указанным способом получают АДД из АД, Δ⁹⁽¹¹⁾-АДД из Δ⁹⁽¹¹⁾-АД, а также другие 1,2-дегидропроизводные ряда андростана и прегнана, и в нем не описано получение эксеместана (6-метилен-АДД) из 6-метилен-АД.

Относительно низкая концентрация субстрата характеризует данный способ получения 1,2-дегидропроизводных, как малоэффективный.

Также известен способ превращения 1,2-насыщенных 3-кетостероидов в 1,2-дегидро-3-кетостероиды, который заключается в том, что 1,2-насыщенные 3-кетостероиды подвергают взаимодействию с препаратом, имеющим стероид-1,2-дегидрогеназную активность Arthrobacter simplex или Bacterium cyclooxydans, в присутствии экзогенного носителя электронов и одного или более дополнительного поглотителя токсичного кислорода, выбранного из группы, содержащей каталазу, супероксиддисмутазу или платину [US 4749649, 1988]. Согласно этому способу стероидный субстрат может быть внесен в виде порошка, водной пасты, или в виде раствора (или суспензии) в смешивающемся с водой органическом растворителе, таком как ДМФ, ДМСО, этанол, метанол, ацетон, в количестве, не более чем 5% от конечного объема среды. Способ проиллюстрирован примером 1, в описании которого, однако, не уточняется, какой из указанных выше видов внесения субстрата использован (нагрузка субстрата 3,5 г/л). При этом в биоконверсионной среде даже в присутствии менадиона накопление продукта Δ¹-дегидрирования проходит лишь на 50%.

Таким образом, применение смешивающихся с водой органических растворителей в низкой концентрации - до 5% v/v - не позволяет значительно увеличить растворимость субстрата в водной среде и его доступность к клеткам микроорганизма и не позволяет повысить эффективность процесса.

Рассматриваемый способ [US 4749649, 1988] предлагает также использование экзогенного фермента-каталазы. Добавление каталазы в количестве 10 мг/л (эквивалентное 16000 ед/л) способствует активному превращению субстрата и позволяет увеличить его нагрузку до 10 г/л (пример 1). За 22 часа степень превращения субстрата составляет - 83%, за 46 часов - 95%. Кроме этого, в присутствии каталазы и менадиона происходит полное подавление деструктивной активности.

Однако удорожание технологии, обусловленное необходимостью добавления в среду поглотителя (фермента каталазы, или супероксиддисмутазы, или платины), устраняющего ингибирующее влияние синглетного кислорода на активность дегидрогеназы, определяет основной недостаток данного способа. Кроме того, известным способом получают АДД из АД, Δ⁹⁽¹¹⁾-АДД из Δ⁹⁽¹¹⁾-АД, а также другие 1,2-дегидропроизводные ряда андростана, и в нем не описано получение эксеместана (6-метилен-АДД) из 6-метилен-АД.

Известно, что для повышения растворимости стероидных субстратов в водной среде также используют α, β или γ-циклодекстрины, а также производные β-циклодекстрина (βЦД) метил-βЦД и гидроксипропил-βЦД в концентрации 1-50 г/л [Szejtli J. The use of cyclodextrins in biotechnological operations. Ed.D.Duchene, Published in France by Editions de Sante. 1991, 625 p]. В частности, известен способ получения 1,2-дегидропроизводных дельта4-3-кетостероидов путем трансформации дельта4-3-кетостероидов с помощью микроорганизма Arthrobacter globiformis 193 в присутствии циклодекстрина, отличающийся тем, что в качестве циклодекстрина используют водорастворимые химически модифицированные производные β-циклодекстрина [RU 2156302, 2000]. Согласно этому способу применение метил-βЦД позволяет осуществлять 1,2-дегидрирование субстрата при нагрузке 20 г/л. При весовом соотношении метил-βЦД/субстрат 7/1 полное превращение субстрата завершается за 6 часов. Содержание 1,2-дегидрированного продукта в культуральной жидкости составляет 95%. Однако практическая значимость данного способа 1,2-дегидрирования в значительной степени ограничена использованием больших количеств дорогостоящего метил-βЦД. Кроме того, известным способом получают АДД из АД (пример 12) и в нем не описано получение эксеместана (6-метилен-АДД) из 6-метилен-АД.

Наряду с применением циклодекстринов, для повышения концентрации и доступности для микроорганизмов стероидных субстратов используют синтетические полимеры класса N-виниламидов - поливинилпирролидон (ПВП), поливинилкапролактам (ПВК) и поливиниловый спирт (ПВС) [Дружинина А.В., Андрюшина В.А., Аринбасарова А.Ю., Пашкин И.И., Савинова Т.С., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Биотехнология, 2008, №1, с.46-50].

Известен способ получения дегидроаналогов стероидов, включающий микробиологическую трансформацию соответствующих Δ⁴-3-кетостероидов в присутствии полимерного материала с последующим выделением из реакционной среды целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют гомо- или сополимер N-винилкапролактама с мол.м. 10⁴-10⁶ или сополимеры N-винилкапролактама с виниловым спиртом, винилацетатом или винилметилацетамидом с содержанием оных до 46%, 45% и 15% соответственно [RU 2042687, 27.08.1995]. Однако известный способ заявлен в общем виде и изобретение не проиллюстрировано примерами, в нем не описано получение эксеместана из 6-метилен-АД.

Промежуточным соединением в синтезе эксеместана из андрост-4-ен-3,17-диона (АД) является 6-метилен-АД.

Известны способы получения 6-метилен-АД из АД.

В частности, известен способ получения 6-метилен-3-оксо-Δ⁴-стероидов, который включает обработку 3-енолэфира 6-гидроксиметилстероида кислым реагентом, способным регенерировать Δ⁴-3-кетостероиды из их 3-енолэфиров и одновременно восстанавливать 6-гидроксиметильную группу в 6-метиленовую [US 3112305, 1963]. Согласно этому способу 6-метилен-АД получают из 3-метилового енолэфира 6-гидроксиметил-АД дегидратацией 90% муравьиной кислотой, который может быть получен из АД следующей последовательностью реакций: получение 3-метилового енолэфира АД, его взаимодействие с реагентом Вильсмейера [US 3114750, 1963], гидрирование полученного 6-формильного производного [US 3095411, 1963] (выходы не указаны) (Рисунок 2).

Рисунок 2. Синтез 6-метилен-АД из АД с применением реакции Вильсмейера

Известен также способ получения 6-метилен-Δ⁴-3-кетостероида ряда андростана или прегнана, включающий реакцию соответствующего Δ⁴-3-кетостероида с производным формальдегида в инертном растворителе в присутствии сильного кислого конденсирующего агента [US 4322349, 1982; Annen, Klaus; Hofmeister, Helmut; Laurent, Henry; Wiechert, Rudolf: Synthesis, 1982, №1 34-40] (метод прямого γ-метиленирования). При этом в качестве производного формальдегида могут быть использованы триоксан или диалкилацеталь формальдегида (метиловый, этиловый или диизопропиловый), а в качестве конденсирующего агента - пентоксид фосфора или оксихлорид фосфора. Так, например, согласно этому способу взаимодействие АД с диэтилацеталем формальдегида проводят в присутствии фосфорилхлорида и ацетата натрия в инертном растворителе при кипячении в течение 5,5 ч, продукт очищают хроматографированием на силикагеле (Рисунок 3).

Рисунок 3. Синтез 6-метилен-АД из АД методом прямого γ-метиленирования [US 4322349, 1982]

Однако, несмотря на значительно более короткий путь к целевому продукту, этот метод не позволяет получать выход 6-метилен-АД из АД выше, чем 68%.

Известен способ получения 6-N,N-дизамещенных аминометилпроизводных стероидов [GB 1280569, 1972] и способ получения 6-метиленстероидов из 6-N,N-дизамещенных аминометилпроизводных стероидов [GB 1280570, 1972]. Способ получения 6-N,N-дизамещенных аминометилпроизводных стероидов [GB 1280569, 1972] заключается в том, что смешивают вторичный амин, формальдегид и стероидное соединение, содержащее в ядре 3-алкокси-3,5-диеновую группу, при этом реакцию проводят в среде тетрагидрофурана, а в качестве вторичного амина используют среди прочих и N-метиланилин. Способ получения 6-метиленстероидов [GB 1280570, 1972] заключается в том, что 6-(N-метил-N-фениламинометил)-производные стероиды, полученные способом, аналогичным [GB 1280569, 1972], смешивают с сильной кислотой. Согласно этому способу 6-(N-метил-N-фениламинометил)-стероидное производное растворяют в 6 N соляной кислоте, раствор выдерживают в течение 3 ч при комнатной температуре, осадок отфильтровывают. Однако известными способами получают 6-(N-метил-N-фениламинометил)-производные Δ⁴-3-кетосоединений рядов прегнана и 6-(N-метил-N-фениламинометил)-производное 17β-гидрокси-17α-метиландрост-4,9(11)-диен-3-она, а также их 6-метилен-аналоги, и в них не описано получение 6-(N-метил-N-фениламинометил)-производного из АД и 6-метилен-АД.

Наиболее близким по сущности к предложенному способу получения 6-метилен-АД из АД является способ получения эксеместана и его производных реакцией 3-енолэфира АД или его производных с 30-40% водным раствором формальдегида и 1-2 эквивалентом галоидводородной соли амина в органическом растворителе при температуре от 30 до 50°С с получением 6-метилен-АД или его производных, описанный А.Лонго и П.Ломбарди [US 4990635, 1991]. Способ проиллюстрирован примером (пример 1), заключающимся в том, что в синтезе 6-метилен-АД из АД последний обрабатывают триэтилортоформиатом в среде тетрагидрофурана, содержащей этанол (13,3%), в присутствии п-толуолсульфокислоты при температуре 40°С в течение 2 ч, затем добавляют N-метиланилин и 40% водный раствор формальдегида и после выдержки в течение 2 ч при 40°С реакционную массу обрабатывают концентрированной соляной кислотой при комнатной температуре. Продукт кристаллизуют разбавлением реакционной массы водой. Из 20 г исходного соединения получают 14,8 г 6-метилен-АД с молярным выходом 71%. (Рисунок 4).

Рисунок 4. Синтез 6-метилен-АД из АД с применением реакции Манниха [US 4990635, 1991].

Аналогичный способ получения 6-метилен-АД из АД использован в патентах [CN 1415624, 2003; CN 1491957, 2004], при этом продукт получен с выходом 68,6%.

Недостатками описанного в US 4990635 способа являются:

- большая продолжительность этапа енолизации (2 ч при 40°С);

- дробная подача катализатора п-толуолсульфокислоты в процессе енолизации;

- использование большого количества соляной кислоты на этапе дезаминирования;

- низкий выход 6-метилен-АД, несмотря на то, что процесс проводится без выделения интермедиатов.

Известно, что механизм реакции Манниха (при катализе кислотой) состоит в первоначальном образовании высокореакционной промежуточной частицы - иминиевого катиона, образующегося из аминного и карбонильного компонентов, который стабилизован кислотой. Высокая реакционная способность иминиевых солей накладывает некоторые ограничения на выбор растворителя для проведения реакции аминометилирования. Обычно в синтезе нестероидных оснований Манниха предпочитают использовать высокополярные растворители (для того чтобы соль находилась в растворе), неспособные к химическому взаимодействию с иминиевой солью: ацетонитрил, диметилсульфоксид, диметилформамид и т.д.

Кроме того, в выборе растворителя для проведения реакции Манниха следует учитывать также и особенности стероидного субстрата. Для обеспечения региоселективности аминометилирования по атому С₆ и с целью исключения побочной реакции по атому С₂, находящемуся в α-положении к 3-кетогруппе, проводят предварительную енолизацию Δ⁴-3-кетосистемы. От растворимости и стабильности последней в процессе аминометилирования зависит эффективность реакции. Поэтому выбор растворяющей среды имеет существенное значение.

В известных способах получения 6-метилензамещенных стероидов ряда прегнана и андростана через образование 6-(N-метил-N-фениламинометил)-интермедиата с применением реакции Манниха в качестве растворителя используют тетрагидрофуран [GB 1280569, 1972; US 4990635, 1991; CN 1415624, 2003; CN 1491957, 2004]. Так, в патенте [GB 1280569, 1972] отмечается, что спирты (метанол, этанол, пропанол, изопропанол, t-бутанол) хотя и могут быть использованы как растворители в процессе аминометилирования, однако полярные апротонные растворители, такие как тетрагидрофуран, диоксан, 1,2-диметоксиэтан более эффективны. Кроме того, применение алифатических спиртов как растворителей в реакции Манниха с соединениями нестероидной структуры считается нежелательным, так как спирты способны реагировать с формальдегидом и вторичным амином с образованием продукта О-аминометилирования.

R-OH+CH₂O+HNR₂"=ROCH₂NR₂"

Однако в патенте [GB 1280569, 1972] не описано получение 6-(N-метил-N-фениламинометил)-производного АД. Кроме того, информация об изучении влияния растворяющей среды на параметры процесса 6-аминометилирования стероидов в доступных литературных источниках отсутствует.

Известно также, что расщепление оснований Манниха (в том числе и стероидных) может протекать неоднозначно. Наряду с целевым продуктом дезаминирования экзометилен-соединением (А) может образовываться продукт реверсивного процесса дезаминометилирования (В), представляющий собой исходное соединение в синтезе (Рисунок 5).

Рисунок 5. Направления расщепления стероидных оснований Манниха.

Причем селективность процесса дезаминирования существенно зависит от условий его проведения. Несмотря на то, что оптимальным вариантом расщепления связи C-N фенилзамещенных аминометилстероидов (R₁=Ph) с образованием 6-метиленпроизводных считается обработка концентрированной минеральной кислотой [Mannich bases, Maurilio Tramontini, Luigi Angiolini //CRC Press. Inc. 1994. P 78-80], природа растворяющей среды и температурный режим также имеют большое значение. Обеспечение региоселективности расщепления N,N-дизамещенных 6-аминометилен-производных АД имеет большое значение в решении вопроса об эффективности и промышленной применимости этого способа. Однако информация о влиянии последних двух факторов на селективность реакции дезаминирования 6-аминометилпроизводных стероидов в доступных литературных источниках практически отсутствует. В патенте [GB 1280570, 1972] нет информации о качестве полученных продуктов дезаминирования 6-(N-метил-N-фениламинометил)-стероидов. Кроме того, не описано расщепление 6-(N-метил-N-фениламинометил)-производного АД с образованием 6-метилен-АД.

Также в литературных источниках отсутствует информация об изучении целесообразности совмещения последовательных процессов енолизации, аминометилирования и дезаминирования и проведения их без выделения интермедиатов.

Наиболее близким по сущности к предложенному способу получения эксеместана из 6-метилен-АД является способ получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона, который заключается в контактировании 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона с Δ¹-дегидрирующими энзимами A. Simplex в присутствии несмешивающегося с водой органического растворителя и экзогенного акцептора электронов [WO 0104342, 2001]. Согласно этому способу для проведения процесса 1,2-дегидрирования 6-метилен-АД используют целые клетки или бесклеточный экстракт Arthrobacter simplex ATCC 6946, при этом использование целых клеток предпочтительно. Процесс проводят в двухфазной системе с использованием несмешивающегося с водой органического растворителя, выбранного из группы толуол, ксилол, бензол, гептан, метилен хлорид, н-октанол, или смесей этих растворителей, в присутствии химического экзогенного акцептора электронов (4% менадиона по отношению к весу субстрата) и фермента каталазы. Несмотря на то, что авторами заявлено, что субстрат 6-метиленандрост-4-ен-3,17-дион присутствует в среде в концентрации от 10 до 125 г/л (пп.18 и 19 формулы), в примере А, иллюстрирующем способ, концентрация исходного субстрата составляет 55,6 г/л. Так, для проведения процесса 6-метиленандрост-4-ен-3,17-дион (50 г) и менадион (2,0 г) смешивают с толуолом (800 мл). Водную фазу (pH 8.7-8.9), приготовленную как смесь каталазы, дикалийфосфата, клеточного концентрата A. Simplex (50 мл) и воды (50 мл), добавляют к интенсивно перемешиваемой смеси в толуоле. Процесс проводят при 30^оС, реакционную смесь продувают регулируемой смесью воздуха и азота - воздух (0.1% SCHF) и азот (0.3% SCHF). При необходимости в течение реакции добавляют клетки A. Simplex для завершения процесса. Причем количество добавляемого дополнительно клеточного концентрата не указано. После завершения процесса органическую фазу отделяют, водную фазу экстрагируют толуолом. После фильтрации и осветления толуольный раствор концентрируют, к остатку добавляют 2,5-кратное объемное количество октана, кристаллический продукт отфильтровывают.

Недостатками описанного в WO 0104342 процесса являются:

- использование фермента каталазы в количестве 0,03% от веса субстрата, что удорожает технологический процесс и ограничивает его индустриальное применение;

- использование больших объемов легко воспламеняющихся органических растворителей на этапе трансформации, что требует специального ферментационного оборудования и соблюдения особых правил противопожарной безопасности;

- использование токсичных органических соединений создает угрозу здоровью специалистов, занятых в производстве. Применяемые ароматические углеводороды (бензол, толуол, ксилол) являются сильнодействующими ядами, влияющими на функцию кроветворения организма. Так, например, толуол вызывает цианоз, гипоксию, поражение центральной нервной системы, а также толуольную токсикоманию, которая имеет и канцерогенное действие.

- необходимость решения экологических проблем;

- сложность проведения технологического процесса в условиях необходимого регулирования состава газовой смеси, подаваемой в реакционную среду;

- отсутствие информации о селективности процесса трансформации и эффективности процесса выделения кристаллического продукта, т.е. о степени превращения субстрата в продукт и выходе кристаллического продукта (указано лишь, что количество нетрансформированного исходного субстрата составляет 0,1%);

- отсутствие информации о качестве полученного эксеместана;

- отсутствие примера, подтверждающего применимость способа при нагрузке субстрата до 125 г/л.

Технической задачей одного из изобретений заявленной группы является, таким образом, повышение эффективности, технологичности и безопасности проведения микробиологического 1,2-дегидрирования и получение 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона из 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона способом, лишенным указанных недостатков.

Технической задачей в заявленной группе изобретений является увеличение выхода целевых продуктов путем снижения вероятности протекания побочных реакций на стадии образования 3-енолэфира АД, на стадии введения N,N-дизамещенного аминометильного заместителя в положение С₆ молекулы андростендиона, практически полное исключение образования побочных продуктов на стадии дезаминирования и образования 6-метиленовой группы и стадии 1,2-дегидрирования и получение 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона и 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона способами, лишенными вышеуказанных недостатков.

Техническая задача решается способом получения 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона формулы (I)

из андростендиона формулы (II),

включающим предварительную енолизацию Δ⁴-3-кетосистемы с образованием 3-енолэфира андростендиона формулы (III),

трехкомпонентную конденсацию с формальдегидом и вторичным амином в условиях кислого катализа с образованием N,N-дизамещенного 6-аминометилпроизводного андростендиона формулы (IV),

дезаминирование в среде, содержащей сильную минеральную кислоту, отличающимся тем, что в качестве среды для проведения реакции аминометилирования используют полярные протонные растворители, а в качестве среды для проведения реакции дезаминирования используют апротонные растворители или смеси апротонных растворителей. Протонные растворители в качестве среды для проведения реакции 6-аминометилирования стероидного субстрата ряда андростана ранее в подобных процессах не применялись. Апротонные растворители заявленной группы растворителей или их смеси в качестве среды для проведения реакции дезаминирования N,N-дизамещенных 6-аминометилпроизводных стероидов ряда андростана ранее в подобных процессах не применялись.

Еще одним изобретением заявленной группы является способ получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона 1,2-дегидрированием с использованием в качестве исходного вещества 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона, полученного вышеописанным способом по изобретению, методом микробиологической трансформации с помощью клеток бактерий Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д и последующего выделения целевого продукта из культуральной жидкости, отличающийся тем, что трансформацию проводят в водной среде, содержащей до 40% об смешивающегося с водой органического растворителя. Применение больших концентраций смешивающегося с водой органического растворителя в среде для проведения процесса 1,2-дегидрирования стероидного субстрата не является очевидным, и ранее большие концентрации смешивающегося с водой органического растворителя в подобных процессах не применялись.

Техническая задача в части получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона с использованием в качестве исходного (промежуточного соединения) полученного 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона достигается получением 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона формулы (V)

из 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона формулы (I),

методом микробиологического 1,2-дегидрирования в среде, содержащей экзогенный акцептор электронов и смешивающийся с водой апротонный полярный растворитель, с использованием концентраций исходного субстрата от 5 до 100 г/л и выделением целевого продукта из культуральной жидкости.

Таким образом, сущность заявленной группы изобретений, в которую входят получение 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона и далее 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона с его использованием заключается в том, что андростендион сначала подвергают енолизации Δ⁴-3-кетосистемы, затем трехкомпонентной конденсации с формальдегидом и вторичным амином в условиях кислого катализа с образованием N,N-дизамещенного 6-аминометиленпроизводного андростендиона в среде полярного протонного растворителя, затем дезаминированию с образованием 6-метиленового производного АД в среде апротонного растворителя (или смеси апротонных растворителей) с последующим проведением микробиологической реакции 1,2-дегидрирования в водной среде, содержащей до 40% об полярного апротонного растворителя, смешивающегося с водой.

С целью повышения выхода и упрощения процесса енолэфир АД подвергают аминометилированию положения С₆ реакцией Манниха в среде полярного протонного растворителя и далее региоселективному расщеплению основания Манниха до образования 6-метиленовой группы в среде апротонного растворителя (или смеси апротонных растворителей).

При этом трехкомпонентную конденсацию по типу реакции Манниха проводят с выделением продукта из реакционной среды, а реакцию дезаминирования осуществляют в оптимальных условиях.

Кроме того, в качестве полярного протонного растворителя используют алифатические спирты из группы метанол, этанол, пропанол, изопропанол и т.п.

Кроме того, в качестве апротонного органического растворителя используют диалкилкетоны (например, ацетон, метилэтилкетон), ароматические углеводороды (например, бензол, толуол), хлорированные углеводороды (например, дихлорметан, хлороформ, дихлорэтан), а также их смеси в эффективном соотношении.

Кроме того, в качестве вторичного амина используют N-метиланилин, а формальдегид используют в виде 37-40% водного раствора.

Кроме того, проведение последующего 1,2-дегидрирования с целью получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона осуществляют с использованием клеток бактерий Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д.

Кроме того, в качестве полярного апротонного органического растворителя при проведении 1,2-дегидрирования используют диметилформамид или диметилсульфоксид, предпочтительно диметилсульфоксид. При этом концентрация ДМФ в водной среде составляет не менее 8% об., а концентрация ДМСО в водной среде составляет 8-40%.

Кроме того, концентрация исходного субстрата при проведении 1,2-дегидрирования составляет от 5 до 100 г/л, предпочтительно 100 г/л.

Кроме того, в качестве экзогенного акцептора электронов используют метадион в эффективном количестве.

Преимущества заявляемого способа состоят в следующем:

- Отсутствие необходимости использования многократной кристаллизации основного продукта или хроматографирования с целью его очистки.

- Высокая эффективность процесса енолизации. Выход на стадии получения енолэфира АД составляет 94,4%.

- Высокая селективность и упрощение проведения реакции аминометилирования. Выход на стадии получения N,N-дизамещенного 6-аминометиленпроизводного АД количественный;

- Высокая селективность процесса дезаминирования. Выход на стадии составляет 85-88%;

- Общий выход 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона из андростендиона составляет 83%.

Способ по настоящему изобретению позволяет проводить процесс 1,2-дегидрирования:

- при высокой нагрузке субстрата до 100 г/л в мягких условиях;

- без использования легко воспламеняющихся органических растворителей;

- без дополнительных соединений стероидной природы, обеспечивающих стабилизацию 1,2-дегидрогеназной активности;

- способ экологически безопасен, так как в качестве смешивающегося с водой растворителя предлагается ДМСО - высококипящая жидкость с низким уровнем токсичности и температурой вспышки 89°С (в закрытом сосуде), применяемая в медицине в виде водных растворов в качестве местного лекарственного препарата противовоспалительного и обезболивающего действия (торговое название Димексид);

- способ исключает применение фермента каталазы и каких-либо других поглотителей синглетного кислорода;

- способ может быть реализован на стандартном технологическом оборудовании.

Получение 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона формулы (I) и 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона формулы (V) осуществляются по схеме, изображенной на рисунке 6.

Рисунок 6. Синтез эксеместана из АД через 6-метилен-АД заявляемым способом

Ниже приводится в качестве примера подробное описание сущности изобретения