Бициклические гетероциклические соединения в качестве противовоспалительных агентов

Бициклические гетероциклические соединения в качестве противовоспалительных агентов

Реферат

Изобретение относится к органическим соединениям, способу их получения и их применению в качестве фармацевтических средств.

В первом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I):

в свободной форме или форме соли, где

А независимо выбран из CH и по крайней мере одного атома азота;

D независимо выбран из CR³ и атома азота;

R¹ и R², независимо, представляют собой H, галоген или C₁-C₈-алкил, или

R¹ и R², вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C₃-C₁₅-карбоциклическую группу;

R³ выбран из C₁-C₈-алкила, галогена, циано, гидроксила, амино, аминоалкила, амино(ди)алкила, C₃-C₁₅-карбоциклической группы, C₁-C₈-галогеналкила, C₁-C₈алкокси-C₁-C₈-алкила и C₁-C₈-гидроксиалкила;

R⁴ выбран из галогена, C₁-C₈-алкила, C₁-C₈-галогеналкила, C₃-C₁₅-карбоциклической группы, C₆-C₁₅-ароматической карбоциклической группы, нитро, циано, C₁-C₈-алкилсульфонила, C₁-C₈-алкилсульфинила, C₁-C₈-алкилкарбонила, C₁-C₈-алкоксикарбонила, C₁-C₈-алкокси, C₁-C₈-галогеналкокси, карбокси, карбокси-С₁-С₈-алкила, амино, C₁-C₈-алкиламино, ди(C₁-C₈-алкил)амино, SO₂NH₂, (C₁-C₈-алкиламино)сульфонила, ди(C₁-C₈-алкил)аминосульфонила, аминокарбонила, C₁-C₈-алкиламинокарбонила, ди(C₁-C₈-алкил)аминокарбонила и 4-10-членной гетероциклической группы;

R⁵ выбран из:

, , , ,

, , , и

R^5a и R^5b независимо выбраны из H, 4-14-членной гетероциклической группы, C₆-C₁₅-ароматической карбоциклической группы, C₃-C₁₅-карбоциклической группы и C₁-C₈-алкила, необязательно замещенного 4-14-членной гетероциклической группой или C₃-C₁₅-карбоциклической группой, где по крайней мере одна из групп R^5a или R^5b представляет собой C₁-C₈-алкил, замещенный 4-14-членной гетероциклической группой или C₃-C₁₅-карбоциклической группой, или R^5a и R^5b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 4-14-членную гетероциклическую группу,

R^5c, R^5d и R^5e независимо выбраны из H и C₁-C₈-алкила, необязательно замещенного 4-14-членной гетероциклической группой, C₆-C₁₅-ароматической карбоциклической группой, C₃-C₁₅карбоциклической группой или R^5c вместе с R^5d или R^5e вместе с атомами азота, к которым они присоединены, и карбонилом образуют 5-14-членную гетероциклическую группу;

R^5f представляет собой H, C₁-C₈-алкил, необязательно замещенный 4-14-членной гетероциклической группой или C₃-C₁₅-карбоциклической группой;

R^5g выбран из H и C₁-C₈-алкила, необязательно замещенного 4-14-членной гетероциклической группой или C₃-C₁₅-карбоциклической группой;

R^5f и R^5g вместе с группой NSO₂, к которой они присоединены, образуют 5-14-членную гетероциклическую группу;

R^5h и R⁵ⁱ независимо выбраны из H и C₁-C₈-алкила, необязательно замещенного 4-14-членной гетероциклической группой или C₃-C₁₅-карбоциклической группой, или R^5h и R⁵ⁱ вместе с группой NCO, к которой они присоединены, образуют 5-14-членный гетероцикл;

R^5j и R^5k независимо выбраны из H и C₁-C₈-алкила, необязательно замещенного 4-14-членной гетероциклической группой или C₃-C₁₅-карбоциклической группой, или R^5j и R^5k вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 4-14-членную гетероциклическую группу;

R^5l, R^5m и R^5q независимо выбраны из H и C₁-C₈-алкила, необязательно замещенного 4-14-членной гетероциклической группой или C₃-C₁₅-карбоциклической группой, или R^5l вместе с R^5m или R^5q вместе с атомами азота аминосульфонамида, к которому они присоединены, образуют 5-14-членную гетероциклическую группу;

выбран из 4-14-членной гетероциклической группы, C₆-C₁₅-ароматической карбоциклической группы и C₃-C₁₅-карбоциклической группы;

R⁶ представляет собой H или C₁-C₈-алкил;

W представляет собой C₆-C₁₅-ароматическую карбоциклическую группу или 4-14-членную гетероциклическую группу;

Х представляет собой -SO₂-, -CH₂-, -CON(Y)-, -(V₁)-T-(V)-, 5-14-членную гетероциклическую группу или связь;

Y представляет собой C₁-C₈-алкил, необязательно замещенный C₁-C₈-алкилом, галогеном, оксо, гидроксилом, амино, амино-C₁-C₈-алкилом или амино(ди-C₁-C₈-алкил);

V₁ представляет собой C₁-C₇-алкил, необязательно замещенный C₁-C₈-алкилом, галогеном, оксо, гидроксилом, амино, амино-C₁-C₈-алкилом, амино(ди-C₁-C₈-алкил);

V представляет собой C₀-C₇-алкил, необязательно замещенный C₁-C₈-алкилом, галогеном, оксо, гидроксилом, амино, амино-C₁-C₈-алкилом, амино(ди-C₁-C₈-алкил);

Т представляет собой атом кислорода или NR⁷;

R⁷ представляет собой H или C₁-C₈-алкил;

где каждая C₃-C₁₅-карбоциклическая группа, C₆-C₁₅-членная ароматическая карбоциклическая группа и каждая 4-14-членная гетероциклическая группа, если не указано иное, независимо необязательно замещена одной или несколькими группами, выбранными из галогена, оксо, гидрокси, циано, амино, нитро, карбокси, C₁-C₈-алкила, галоген-C₁-C₈-алкила, C₁-C₈-алкокси, C₁-C₈-алкилкарбонила, C₁-C₈-алкилсульфонила, -SO₂NH₂, (C₁-C₈-алкиламино)-сульфонила, ди(C₁-C₈-алкил)аминосульфонила, аминокарбонила, С₁-С₈-алкиламинокар6онила и ди(C₁-C₈-алкил)аминокар6онила, C₃-C₁₅-карбоциклической группы, C₆-C₁₅-членной ароматической карбоциклической группы, 4-14-членной гетероциклической группы, циано-C₁-C₈-алкила, гидрокси-C₁-C₈-алкила, C₁-C₈-галогеналкила, амино-C₁-C₈-алкила, амино(гидрокси)C₁-C₈-алкила и C₁-C₈-алкокси, необязательно замещенного аминокарбонилом;

m и n каждый, независимо, имеет значение 0-3; и

p имеет значение 0-4.

В соответствии с формулой (I) группа:

предпочтительно представляет собой:

в свободной форме или форме соли.

В соответствии с формулой (I) R¹ и R² предпочтительно вместе представляют собой H.

В соответствии с формулой (I) R³ предпочтительно представляет собой C₁-C₈-алкил, предпочтительно метил.

В соответствии с формулой (I) R⁴ предпочтительно отсутствует.

В соответствии с формулой (I) Х предпочтительно представляет собой -СН₂-.

В соответствии с формулой (I) W представляет собой C₆-C₁₅ароматическую карбоциклическую группу, например фенил. Когда W представляет собой фенил, он предпочтительно замещен в 4 положении R⁵.

В соответствии с формулой (Ia) R⁵ предпочтительно представляет собой , где R^5j и R^5k вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 4-6-членную гетероциклическую группу, то есть пиперазин, азетидин, морфолин, пиперидин и пирролидин. 4-6-членная гетероциклическая группа может быть необязательно замещена C₁-C₈-алкилом, предпочтительно метилом, или R^5j и R^5k независимо выбраны из C₁-C₈-алкила, предпочтительно метила или C₃-C₁₅-карбоциклическую группу, такую как циклогексан.

В соответствии с формулой (I) n обозначает 1.

Более предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включает соединения формулы (Ia):

где R выбран из:

, , , ,

и .

Используемые в описании термины имеют следующие значения:

"Необязательно замещенный", как здесь используется, обозначает, что описанная группа может быть замещена в одном или нескольких положениях любым одним или любой комбинацией радикалов, представленных далее.

"Галоген" или "гало" может представлять собой фтор, хлор, бром или йод.

"C₁-C₈-алкил" обозначает линейный или разветвленный C₁-C₈-алкил, который может представлять собой, например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, линейный или разветвленный пентил, линейный или разветвленный гексил, линейный или разветвленный гептил либо линейный или разветвленный октил.

"C₃-C₁₅-карбоциклическая группа", как здесь используется, обозначает карбоциклическую группу, содержащую от 3 до 15 атомов углерода в кольце, которое является насыщенным или частично насыщенным, таким как C₃-C₈-циклоалкил. Примеры C₃-C₁₅-карбоциклических групп включают, но не ограничиваются ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил или циклооктил, или бициклическую группу, такую как бициклооктил, бициклононил, включая инданил и инденил, и бициклодецил.

"C₆-C₁₅-ароматическая карбоциклическая группа", как здесь используется, обозначает ароматическую группу, содержащую от 6 до 15 атомов углерода в кольце. Примеры C₆-C₁₅-ароматических карбоциклических групп включают, но не ограничиваются ими, фенил, фенилен, бензолтриил, нафтил, нафтилен, нафталентриил или антрилен.

"C₁-C₈-алкокси" обозначает линейный или разветвленный C₁-C₈-алкокси, который может представлять собой, например, метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, линейный или разветвленный пентокси, линейный или разветвленный гексилокси, линейный или разветвленный гептилокси или линейный или разветвленный октилокси. Предпочтительно, C₁-C₈-алкокси представляет собой C₁-C₄-алкокси.

"C₁-C₈-галогеналкил" и "C₁-C₈-галогеналкокси" обозначает C₁-C₈-алкил и C₁-C₈-алкокси как определено выше, замещенный одним или несколькими атомами галогена, предпочтительно одним, двумя или тремя атомами галогена, предпочтительно атомами фтора, брома или хлора. Предпочтительно C₁-C₈-галогеналкил представляет собой C₁-C₄-алкил, замещенный одним, двумя или тремя атомами фтора, брома или хлора.

"C₁-C₈-алкилсульфонил", как здесь используется, обозначает C₁-C₈-алкил, как определено выше, присоединенный к группе -SO₂-.

"C₁-C₈-алкилсульфинил", как здесь используется, обозначает C₁-C₈-алкил, как определено выше, присоединенный к группе -SO-.

"Амино-C₁-C₈-алкил" и "амино-C₁-C₈-алкокси" обозначает амино, присоединенный через атом азота к C₁-C₈-алкилу, например, NH₂-(C₁-C₈)-, или к C₁-C₈-алкокси, например, NH₂-(C₁-C₈)-O-, соответственно, как определено выше.

"Амино-(гидрокси)-C₁-C₈-алкил" обозначает аминогруппу, присоединенную через атом азота к C₁-C₈-алкилу, и гидроксигруппу, присоединенную через атом кислорода к тому же C₁-C₈-алкилу.

"Карбокси-C₁-C₈-алкил" и "карбокси-C₁-C₈-алкокси" обозначает карбоксигруппу, присоединенную через атом углерода к C₁-C₈-алкилу или C₁-C₈-алкокси, соответственно, как определено выше.

"C₁-C₈-алкилкарбонил", "C₁-C₈-алкоксикарбонил" и "C₁-C₈-галогеналкилкарбонил" обозначает C₁-C₈-алкил, C₁-C₈-алкокси или C₁-C₈-галогеналкил, соответственно, как определено выше, присоединенные через атом углерода к карбонильной группе. "C₁-C₈-алкоксикарбонил" обозначает C₁-C₈-алкокси, как определено выше, где атом кислорода алкоксигруппы присоединен к карбонильному атому углерода.

"C₁-C₈-алкиламино" и "ди(C₁-C₈алкил)амино" обозначает C₁-C₈-алкил, как определено выше, присоединенный через атом углерода к аминогруппе. C₁-C₈-алкильные группы в ди(C₁-C₈-алкил)аминогруппе могут быть одинаковыми или различными.

"C₁-C₈-алкиламинокарбонил" и "ди(C₁-C₈-алкил)аминокарбонил" обозначают C₁-C₈-алкиламино и ди(C₁-C₈-алкил)амино, соответственно, как определено выше, присоединенные через атом азота к атому углерода карбонильной группы.

"Ди(C₁-C₈-алкил)амино-C₁-C₈-алкил" и "ди(C₁-C₈-алкил)амино-C₁-C₈-алкокси" обозначают ди(C₁-C₈-алкил)амино как определено выше, присоединенный через атом азота к атому углерода C₁-C₈-алкильной группы или C₁-C₈-алкоксигруппы, соответственно.

"4-14-членная гетероциклическая группа", обозначенная как 4-14-членное гетероциклическое кольцо, содержащее по крайней мере один гетероатом в кольце, выбранный из группы, состоящей из азота, кислорода и серы, которая может быть насыщенной, частично насыщенной или ненасыщенной (ароматической). Примеры 4-14-членных гетероциклических групп включают, но не ограничиваются ими, фуран, азетидин, пиррол, пирролидин, пиразол, имидазол, триазол, изотриазол, тетразол, тиадиазол, изотиазол, оксадиазол, пиридин, пиперидин, пиразин, оксазол, изоксазол, пиразин, пиридазин, пиримидин, пиперазин, пирролидин, пирролидинон, морфолин, триазин, оксазин, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, тетрагидротиопиран, тетрагидропиран, 1,4-диоксан, 1,4-оксатиан, индазол, хинолин, индазол, индол или тиазол. 4-14-членная гетероциклическая группа может быть незамещенной или замещенной. Предпочтительные заместители включают галоген, циано, оксо, гидрокси, карбокси, нитро, C₁-C₈-алкил, C₁-C₈-алкилкарбонил, циано-C₁-C₈-алкил, гидрокси-C₁-C₈-алкил, C₁-C₈-галогеналкил, амино-C₁-C₈-алкил, амино(гидрокси)C₁-C₈-алкил и C₁-C₈-алкокси, необязательно замещенный аминокарбонилом. Особенно предпочтительные заместители включают галоген, оксо, C₁-C₄-алкил, C₁-C₄-алкилкарбонил, гидрокси-C₁-C₄-алкил, C₁-C₄-галогеналкил, амино-C₁-C₄-алкил и амино(гидрокси)C₁-C₄-алкил.

В данном описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не указано иное, слово "включать", или его варианты, такие как "включает" или "включающий", должно пониматься как включающее указанное значение, или стадию, или группу значений, или стадий, но не исключая любое другое значение или стадию, или группу значений, или стадий.

Когда в формуле (I) m или n обозначают 2, два заместителя могут быть одинаковыми или различными. Когда m или n обозначают 3, два или все заместители могут быть одинаковыми, или все три могут быть различными.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) в любом из указанных выше вариантов осуществления, в свободной форме или форме соли, для изготовления лекарственного средства для лечения воспалительного или аллергического состояния, особенно воспалительного или обструктивного заболевания легочных путей.

Соли и изомеры

Многие соединения, представленные формулой (I), способны образовывать кислотные аддитивные соли, особенно фармацевтически приемлемые кислотные аддитивные соли. Фармацевтически приемлемые кислотные аддитивные соли соединения формулы (I) включают соли с неорганическими кислотами, например, галогенводородными кислотами, такими как хлористоводородная кислота или бромистоводородная кислота; азотная кислота; серная кислота; фосфорная кислота; и органическими кислотами, например, алифатическими монокарбоновыми кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, дифенилуксусная кислота, трифенилуксусная кислота, капроновая кислота, дихлоруксусная кислота, трифторуксусная кислота, гиппуровая кислота, пропионовая кислота и бутановая кислота; алифатическими гидроксикислотами, такими как молочная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, миндальная кислота, винная кислота или яблочная кислота; дикарбоновыми кислотами, такими как адипиновая кислота, аспарагиновая кислота, фумаровая кислота, глутаминовая кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, себациновая кислота или янтарная кислота; ароматическими карбоновыми кислотами, такими как бензойная кислота, n-хлорбензойная кислота или никотиновая кислота; ароматическими гидроксикислотами, такими как o-гидроксибензойная кислота, n-гидроксибензойная кислота, 1-гидроксинафтален-2-карбоновая кислота или 3-гидроксинафтален-2-карбоновая кислота; и сульфоновыми кислотами, такими как этансульфоновая кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, (+)-камфор-10-сульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, нафтален-2-сульфоновая кислота, нафтален-1,5-дисульфоновая кислота или n-толуолсульфоновая кислота. Эти соли могут быть получены из соединений формулы (I) известными способами получения солей.

Соединения формулы (I), которые содержат кислотные, например карбоксильные, группы, также способны образовывать соли с основаниями, в частности фармацевтически приемлемыми основаниями, такими как основания, хорошо известные из предшествующего уровня техники; такие подходящие соли включают соли с металлом, особенно, соли с щелочным металлом или щелочноземельным металлом, такие как соли натрия, калия, магния, кальция или цинка; или соли с аммиаком или фармацевтически приемлемыми органическими аминами или гетероциклическими основаниями, такими как бенетамин, аргинин, бензатин, диэтаноламин, этаноламин, 4-(2-гидроксиэтил)морфолин, 1-(2-гидроксиэтил)пирролидин, N-метилглюкамин, пиперазин, триэтаноламин или трометамин. Эти соли могут быть получены из соединений формулы (I) известными способами получения солей.

В тех соединениях, где присутствует асимметричный атом углерода или ось хиральности, соединения существуют в виде индивидуальных оптически активных изомерных форм или в виде их смесей, например, в виде рацемических или диастереомерных смесей. Настоящее изобретение включает как индивидуальные оптически активные R- и S-изомеры, так и их смеси, например рацемические или диастереомерные смеси.

Конкретные предпочтительные соединения формулы (I) описаны далее в примерах.

Изобретение также включает способ получения соединений формулы (I) в свободной форме или форме соли, который включает стадии:

(i) (А) для получения соединений формулы (I), где R⁶ представляет собой H, расщепление эфирной группы -COOR⁶ с получением соединения формулы (I):

где R⁶ представляет собой C₁-C₈-алкил, и R¹, R², R⁴, R⁵, A, D, W, X, m и n являются такими, как определено выше; или

(Б) для получения соединений формулы (I), где R⁶ представляет собой C₁-C₈-алкил, необязательно замещенный C₃-C₁₅карбоциклической группой или C₃-C₁₅карбоциклической группой, реакция соединения формулы (II):

,

где R⁶ представляет собой C₁-C₈-алкил, необязательно замещенный C₃-C₁₅карбоциклической группой, или C₃-C₁₅карбоциклическую группу; и

R¹, R², R⁴, A, D и m являются такими, как определено выше, с соединением формулы (III):

,

где G представляет собой уходящую группу, например атом галогена; и

R⁵, W, Х и n являются такими, как определено выше; и

(ii) превращение полученного соединения формулы (I) в свободную форму или форму соли.

Способ варианта (А) может осуществляться, используя известные способы (или аналогично, как описано в примерах) для расщепления эфирных групп карболовой кислоты, и может осуществляться in situ после получения соединения формулы (I), где R⁶ представляет собой C₁-C₈-алкил, необязательно замещенный C₃-C₁₅карбоциклической группой, или C₃-C₁₅карбоциклическую группу. Например, соединение формулы (I), где R⁶ представляет собой C₁-C₈-алкил, необязательно замещенный C₃-C₁₅карбоциклической группой, или C₃-C₁₅карбоциклическую группу, обычно в растворе полярного органического растворителя или его смеси с водой, может подвергаться реакции с водным неорганическим основанием, таким как NaOH, для гидролиза эфирной группы; когда основание представляет собой NaOH, реакция может осуществляться при температуре 10-40°С, обычно при температуре окружающей среды.

Способ варианта (Б) может осуществляться, используя известные методики или аналогично, как описано далее в примерах. Например, соединение формулы (II) может подвергаться реакции с алкилгалогенидом формулы (III),

где G представляет собой галоген;

R⁵, W, Х и n являются такими, как определено выше,

в присутствии органического основания, такого как NaH; реакция может осуществляться в органической растворителе, например полярном апротонном растворителе, таком как N,N-диметилформамид (ДМФА), и может осуществляться при температуре 10-40°С, обычно при температуре окружающей среды.

Соединения формулы (II) являются известными или могут быть получены известными способами, например, как описано в документе US 3,320,268, или аналогично, как описано далее в примерах. Соединения формулы (III) являются известными или могут быть получены известными способами, или аналогично, как описано далее в примерах.

Соединения формулы (I) в свободной форме могут быть превращены в форму соли, и наоборот, обычным способом. Соединения в свободной форме или форме соли могут быть получены в форме гидратов или сольватов, содержащих растворитель, используемый для кристаллизации. Соединения формул (I) и (II) могут быть выделены из реакционных смесей и очищены известными способами. Изомеры, такие как энантиомеры, могут быть получены обычным способом, например фракционной кристаллизацией, ВЭЖХ в хиральном растворе или асимметричным синтезом из соответствующих асимметричных замещенных, например оптически активных, исходных материалов.

Фармацевтическое применение и анализ

Соединения формулы (I) и (II) и их фармацевтически приемлемые соли, далее альтернативно называемые "агенты по изобретению", являются полезными в качестве фармацевтических средств. В частности соединения обладают хорошей модулирующей активностью в отношении рецептора CRTh2 и могут быть протестированы в следующих анализах.

Методика анализа фильтрационного связывания

Связывание модуляторов CRTh2 определяли, используя мембраны, полученные из клеток CRTh2 человека, экспрессированных клетками яичников китайских хомячков (CHO.K1-CRTh2). Для получения клеточных мембран клетки CHO.K1-CRTh2, культурируемые в цилиндрических бутылочках, высаживали, используя буфер для клеточной диссоциации (Invitrogen). Клетки разрушали центрифугированием (167 g, 5 мин). Остаток клеток инкубировали в гипотоническом буфере (15 мМ Tris-OH, 2 мМ MgCl₂, 0,3 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1x таблетка Complete™) при 4°C в течение 30 мин. При 4°C клетки гомогенизировали, используя Polytron® (IKA Ultra Turrax T25) в течение 5 вспышек в 1 секунду. Гомогенат центрифугировали (Beckman Optima TM TL Ultracentrifuge, 48000 g, 30 мин при 4°С). Супернатант выгружали, и остаток мембран повторно суспендировали в буфере для гомогенизации (75 мМ Tris-OH, 12,5 мМ MgCl₂, 0,3 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 250 мМ сахарозы, 1х таблетка Complete™. Мембранные составы делили на аликвоты и хранили при 80°С. Содержание белка оценивали, используя краситель для анализа белка Bradford (Bio Rad).

Связывание [³H]-PGD₂ (157 Ci/ммоль) с CHO.K1-CRTh2 мембранами определяли в отсутствии (общее связывание) и в присутствии (неспецифическое связывание) немеченого PGD₂ (1 мкМ). Вычитание cpm (раз в минуту) связывания [³H]-PGD₂ в присутствии избытка немеченого PGD₂ из cpm, наблюдаемого в отсутствии избытка немеченого PGD₂, определяли как специфическое связывание. Активные модуляторы CRTh2 способны конкурировать с [³H]-PGD₂ для связывания с рецептором CRTh2, и идентифицируются по уменьшению количества связей cpm.

Анализ осуществляли в 96-луночных планшетах Greiner с U-образным дном, в конечном объеме 100 мкл на лунку. CHO.K1-CRTh2 мембраны разбавляли в буфере для анализа (10 мМ HEPES-KOH (рН 7,4), 1 мМ EDTA и 10 мМ MnCl₂) и 10 мкг добавляли в каждую лунку. [³H]-PGD₂ разбавляли в буфере для анализа и добавляли в каждую лунку в конечной концентрации 2,5 нМ. Для определения неспецифического связывания связывание [³H]-PGD₂ с рецептором CRTh2 осуществляли с помощью немеченого PGD₂ в конечной концентрации в лунке 1 мкМ. Эксперимент осуществляли трижды, добавляемые в лунки реагенты были следующими:

- 25 мкл буфер для анализа для общего связывания, или

- 25 мкл PGD₂ для определения неспецифического связывания,

- 25 мкл [³H]PGD₂,

- 50 мкл мембран,

- 25 мкл тестируемого соединения в смеси ДМСО/буфер для анализа.

Планшеты инкубировали при комнатной температуре на шейкере в течение 1 часа и затем собирали (Tomtec Harvester 9600) на фильтровальные планшеты GF/C, используя буфер для промывки (10 мМ HEPES-KOH, рН 7,4). Планшеты высушивали в течение 2 часов до добавления Micro-Scint 20™ (50 мкл) и закрывали TopSeal-S™. Планшеты затем обрабатывали количественно с помощью оборудования Packard Top Count. Планшеты затем считывали на Packard Topcount с помощью сцинтилляционной программы 3Н (1 мин на лунку).

Значения Ki (константа диссоциации для ингибирования) для модуляторов CRTh2 записывали. Значения Ki определяли с помощью программного обеспечения Sigma Plot™, используя уравнение Ченга-Пруссова.

Ki=IC₅₀/1+[S]/Kd,

где S представляет собой концентрацию радиолиганда, и Kd представляет собой константу диссоциации.

Методика функционального анализа CRTH2 с цАМФ

Этот анализ проводили на клетках CHO.K1-CRTh2. цАМФ получали в клетках стимулированием клеток 5 мкМ форсколина, активатором аденилатциклазы. PGD₂ добавляли для активации рецептора CRTh2, что приводило к смягчению форсколин-индуцированного накопления цАМФ. Потенциальные антагонисты CRTh2 тестировали на их способность ингибировать PGD₂-опосредованное смягчение форсколин-индуцированного накопления цАМФ в клетках СНО.K1-CRTh2.

Для каждого значения концентрации на кривой зависимости доза-отклик тестируемые соединения получали в стимулирующем буфере для анализа (HBSS, 5 мМ HEPES, 10 мкМ IВMX ±0,1% сывороточный альбумин человека), содержащим ДМСО (3% об/об) и 5 мкл/лунку добавляли в планшеты для анализа (384-луночные белые планшеты optiplate).

СНО.K1-CRTh2, культурированные в колбах для тканевых культур, промывали PBS и собирали в буфер диссоциации. Клетки промывали PBS, повторно суспендировали в стимулирующий буфер до концентрации 0,4×10⁶/мл и добавляли в планшеты для анализа (10 мкл/лунку).

Планшеты для анализа инкубировали при комнатной температуре на шейкере в течение 15 минут.

Смесь агониста (10 нМ простагландина D₂) и 5 мкМ форсколина получали в стимулирующем буфере для анализа и добавляли в планшеты для анализа (5 мкл/лунку).

Кроме того, стандарт цАМФ серийно разбавляли в стимулирующем буфере для анализа и добавляли в отдельные пустые лунки в планшеты для анализа (20 мкл/лунку). Стандарт цАМФ оставляли для определения количества цАМФ, вырабатываемого в клетках CHO.K1-CRTH2.

Планшеты для анализа инкубировали при комнатной температуре на шейкере в течение 60 минут.

Буфер для клеточного лизиса (лизисный буфер: Milli-Q H₂O, 5 мМ HEPES, 0,3% Tween-20, 0,1% сывороточный альбумин человека) добавляли к смеси гранул (содержащих Alphascreen™ анти-цАМФ акцепторные гранулы 0,06 единиц/мкл, Alphascreen™ покрытые стрептавидином донорные гранулы 0,06 единиц/мкл, биотинилированную цАМФ 0,06 единиц/мкл, 10 мкМ IВМХ), получали в темных условиях за 60 минут до добавления в планшеты для анализа. Полученную лизисную смесь добавляли во все лунки планшет для анализа (40 мкл/лунку).

Планшеты для анализа закрывали Topseal-S™ и инкубировали в темноте при комнатной температуре на шейкере в течение 45 минут. Планшеты затем обрабатывали количественно, используя инструмент Packard Fusion™.

Полученные значения в минуту преобразовывали в нМ цАМФ, используя полученную стандартную кривую цАМФ. Значения IC₅₀ (концентрация антагониста CRTh2, необходимая для ингибирования 50% PGD₂-опосредованного смягчения форсколин-индуцированного накопления цАМФ в клетках CHO.K1-CRTh2) затем определяли, используя программное обеспечение Prism™.

Соединения из примеров, приведенных ниже, обычно обладали значениями Ki в SPA связывающем анализе менее 1 мкМ. Например, соединения примеров 1, 2, 4 и 6 имеют значения Ki 0,030, 0,034, 0,240 и 0,002 мкМ соответственно.

Соединения из примеров, приведенных ниже, обычно обладали значениями IC₅₀ в функциональном анализе менее 1 мкМ. Например, соединения примеров 1, 2, 4 и 6 имеют значения IC₅₀ 0,060, 0,083, 0,042 и 0,018 мкМ соответственно.

Соединения формулы (I) и (II), в свободной форме или форме соли, являются модуляторами, связывающими G-белок хемоаттрактантами рецептора CRTh2, экспрессирующегося в клетках Th2, эозинофилов и базофилов. PGD₂ является природным лигандом для CRTh2. Таким образом, модуляторы, которые ингибируют связывание CRTh2 и PGD₂, являются полезными для лечения аллергических и воспалительных состояний. Лечение в соответствии с изобретением может быть симптоматическим или профилактическим. "Модуляторы", как здесь используется, включают антагонисты, агонисты, частичные антагонисты и/или частичные агонисты. Предпочтительно, модуляторами являются антагонисты. Соответственно агенты по изобретению являются полезными для лечения воспалительных или обструктивных заболеваний легочных путей, приводящие, например, к снижению повреждения тканей, воспаления легочных путей, бронхиальной гиперреактивности, ремодулирования или прогрессии заболевания. Воспалительные или обструктивные заболевания легочных путей, к которым настоящее изобретение применимо, включают астму любого типа или генеза, включая врожденную (неаллергическую) астму и приобретенную (аллергическую) астму, легкую астму, астму средней степени, тяжелую астму, бронхиальную астму, вызванную физическими упражнениями астму, профессиональную астму и астму, вызванную бактериальной инфекцией. Лечение астмы также следует понимать как включающее лечение субъектов, например возраста менее 4 или 5 лет, проявляющих свистящие симптомы и диагностированные как "свистящие младенцы", категория пациентов основного медицинского назначения и сейчас идентифицируемая как начальная или астматики ранней фазы. (Для удобства это особое астматическое состояние названо "синдром свистящих младенцев".)

Профилактическая эффективность для лечения астмы может быть доказана снижением частоты или степени тяжести симптоматических приступов, например острого астматического или бронхорасширяющего приступа, улучшением легочной функции или улучшением гиперреактивности легочных путей. Она также может быть доказана снижением необходимости другой, симптоматической терапии, то есть терапии для ограничения или прекращения симптоматического приступа при появлении, например, противовоспалительной (например, кортикостероидом) или бронхорасширяющей. Профилактическая польза в отношении астмы, в частности, будет ясна для субъектов с "утренним погружением". "Утреннее погружение" является признанным астматическим синдромом, обычным для значительного количества астматиков, и характеризуется астматическим приступом, например между 4 и 6 часами утра, то есть во время, обычно значительно отдаленное от любого предшествующего введения симптоматической терапии астмы.

Другие воспалительные или обструктивные заболевания легочных путей и условия, к которым настоящее изобретение применимо, включают острую легочную травму (ALI), взрослый или острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), хроническое обструктивное пульмонарное заболевание, заболевание легочных путей или легочное заболевание (COPD, COAD или COLD), включая хронический бронхит и эмфизему, бронхоэктаз и обострение гиперреактивности легочных путей вследствие другой лекарственной терапии, в частности другой ингалируемой лекарственной терапии. Другие воспалительные или обструктивные заболевания легочных путей, к которым применимо настоящее изобретение, включают пневмокониоз (воспалительное, обычно профессиональное, заболевание легких, часто сопровождаемое обструкцией легочных путей, хроническое или острое, и вызванное повторяющимся вдыханием пыли) любого типа или генеза, включая, например, алюминоз, антракоз, асбестоз, халикоз, птилоз, сидероз, силикоз, тобакоз и биссиноз.

В отношении их противовоспалительной активности, в частности в отношении ингибирования активации эозинофилов, агенты по изобретению также полезны для лечения заболеваний, связанных с эозинофилами, например эозинофилии, в частности заболеваний легочных путей, связанных с эозинофилами, например, включая неправильную эозинофильную инфильтрацию легочных тканей, включая гиперэозинофилию при ее воздействии на легочные пути и/или легкие, а также, например, заболеваний легочных путей, связанных с эозинофилами, вследствие или сопутствуя синдрому Лёффлера; эозинофильной пневмонии; паразитического, в частности метазоаном, заражения, включая тропическую эозинофиллию; бронхолегочного аспергиллеза; полиартритной нодозы, включая синдром Чурга-Штраусса; эозинофильной гранулемы и заболеваний легочных путей, связанных с эозинофилами, вызванных реакцией на лекарственные препараты.

Агенты по изобретению также полезны для лечения воспалительных или аллергических состояний кожи, например псориаза, контактного дерматита, атонического дерматита, круговой алопеции, множественной эритемы, герпетиформного дерматита, склеродермии, витилиго, гиперчувствительного ангиита, крапивницы, буллезного пемфигоида, красной волчанки, пузырчатки, приобретенного буллезного эпидермолиза и других воспалительных или аллергических состояний кожи.

Агенты по изобретению также могут использоваться для лечения других заболеваний или состояний, в частности, заболеваний или состояний, имеющих воспалительный компонент, например для лечения заболеваний и состояний глаз, таких как конъюнктивит, кератоконъюнктивит и весенний конъюнктивит; заболеваний носа, включая аллергические риниты; и воспалительных заболеваний, в которых участвуют аутоиммунные реакции, или имеющих аутоиммунный компонент или этиологию, включая аутоиммунные гематологические заболевания, например гемолитическую анемию, апластическую анемию, анемию красных кровяных телец и идиопатическую тромбоцитопению; системную красную волчанку; полихондрит; склеродому; грануламатоз Вегенера; дерматомиозит; хронический активный гепатит; астенический бульбарный паралич; синдром Стивена-Джонсона; идиопатическое нарушение; аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника, например язвенный колит и болезнь Крона; эндокринную офтальмопатию; болезнь Гравза; саркоидоз; альвеолит; хронический гиперчувствительный пневмонит; рассеянный склероз; первичный цирроз печени; ювеит (предшествующий и последующий); кератоконъюнктивит и весенний кератоконъюнктивит; интерстициальный легочный фиброз; псориатический артрит и гломерулонефрит с нефротическим синдромом и без н