Применение санглиферина для лечения вируса гепатита с

Применение санглиферина для лечения вируса гепатита с

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новому применению макролидных соединений, таких как санглиферины, которые связываются с циклофилинами.

Санглиферины представляют собой класс полициклических макролидных соединений, которые выделяют из ферментационной культуральной среды актиномицетов. Установлено, что санглиферины характеризуются активностью при связывании с циклофилинами, а санглиферины A-D проявляют иммунодепрессантную и ингибирующую активность в отношении пролиферации В- и Т-клеток. Однако в отличие от известных иммунодепрессантантов и противовоспалительных соединений, таких как циклоспорин А и FK506, санглиферины не обладают активностью в отношении связывания FKBP или ингибирования кальциневрина. Таким образом, санглиферины относятся к новой категории лекарственных средств как с точки зрения химической структуры, так и различных профилей активности.

Санглиферины и способы их получения описаны в документах WO 97/02285, WO 98/07743 и US 006124453. Ряд производных санглиферина, минисанглиферины, описаны в статьях J.Am.Chem.Soc., т.125, №13, сс.3849-3859 (2003), J.Org.Chem., т.65, сс.9255-9260 (2000), и Angew. Chem. Int. Ed., т.38, №16, сс.2443-2446 (1999).

Неожиданно было установлено, что санглиферины, связывающиеся с циклофилином, проявляют ингибирующую активность в отношении вируса гепатита С (ВГС).

Соответственно, в настоящем изобретении предлагается применение соединения, связывающегося с циклофилином, такого как санглиферин, для профилактики или лечения инфекций, вызванных вирусом гепатита С, нарушений, вызванных ВГС, или ингибиторов пептидилпролил-цис-транс-изомеразы, или состояний, связанных с заболеваниями печени. Агенты можно использовать также, например, для профилактического лечения новорожденных, родившихся у матерей, инфицированных ВГС, или для профилактики персонала, подвергающегося опасности заражения вирусом, или для лечения пациентов после пересадки органов, например пациентов с трансплантом печени, чтобы исключить возможностьповторного заражения ВГС после трансплантации.

Настоящее изобретение относится к применению макролидов (так называемые санглиферины) для профилактики или лечения инфекций, вызванных вирусом гепатита С. Санглиферины выделяют из ферментационной культуральной среды актиномицетов. Стандартные санглиферины включают санглиферины А-D, например, соединение формулы

Макроциклическое кольцо в составе саглиферинов А-D характеризуется тем, что 1) в положениях 1-6 находится остаток 3-карбоксипиперидазинилкарбоновой кислоты, 2) в положениях 7-9 находится остаток ароматической α-аминокислоты и 3) в положениях 10-12 находится остаток алифатической α-аминокислоты. Остальная часть макроциклического кольца содержит остаток гидроксикарбоновой кислоты при условии, что в случае санглиферинов А-D в исходном макроциклическом кольце содержится 11 дополнительных атомов углерода.

Стандартная нумерация макроциклического кольца, принятая в химии макролидов, показана выше для санглиферина А, причем нумерация начинается с атома углерода в карбонильной группе макроциклического лактона в мостиковой связи (положение 1).

Санглиферины А-D содержат также новую бициклическую спиросистему, присоединенную в положении 23 макроциклического кольца через гидрокарбильную связующую группу.

Для получения других макролидов класса санглиферинов санглиферины А-D модифицируют в различных условиях модификации. Такие химические реакции включают отщепление макроциклического кольца, прежде всего по оксигруппе в составе лактона, отщепление связующей группы между макролидом и спироциклической системой, а также модификацию, например введение защитных групп, или другую химическую модификацию заместителей, например, как описано в данном контексте. Другие способы модификации известны специалистам в данной области техники.

В настоящем изобретении установлено, что санглиферины обладают специфической и абсолютно новой биологической активностью в отношении инфекций, вызванных ВГС. Прежде всего, было установлено, что они одновременно проявляют комбинацию различных видов активности, как описано в данном контексте.

Санглиферины характеризуются профилем активности, который отличается от профилей активностей известных иммунодепрессантов и противовоспалительных соединений, таких как циклоспорины и макролиды, например рапамицин и NIM811, что свидетельствует о том, что механизм действия санглиферинов отличается от механизма действия указанных соединений. Таким образом, санглиферины являются новым классом лекарственных средств как с точки зрения структуры, так и с точки зрения активности, что позволяет значительно расширить спектр действия иммунотерапии, противовоспалительной или противовирусной терапии, например исключить или снизить нежелательные побочные эффекты при лечении иммунодепрессантами или противовоспалительными агентами, описанными в предшествующем уровне техники, и/или улучшить или расширить применение такой терапии для лечения новых видов заболевания или новых категорий пациентов.

Санглиферины, в которых, например, макролидное кольцо является незамкнутым, и в положениях 26 и 27 углеводородной связующеей группы между макролидом и спироциклической системой находятся гидроксигруппы, или в котором спироостаток, присоединенный к макролидному циклу, отщеплен или укорочен, в основном не проявляют некоторых или всех видов активности, характерных для санглиферина. Например, санглиферины с отщепленным спироостатком связываются с циклофилином, но не проявляют важную иммунодепрессантную активность. Однако, как известно специалистам в данной области техники, такие соединения можно использовать в качестве ценных компонентов, промежуточных соединений или главных фрагментов, необходимых для получения новых санглиферинов, они, следовательно, могут найти применение при разработке лекарственных средств класса санглиферинов.

Таким образом, наличие такой структуры обеспечивает биологическую активность материала, например санглиферинов А-D, а бициклическую спиросистему можно рассматривать как важный структурный компонент, который можно использовать для дальнейшей модификации или для получения других производных санглиферинов или для модификации других лекарственных средств, например для модификации активности других иммунодепрессантов класса макролидов.

В первом объекте настоящего изобретения предлагается макролид, в котором 1) в положениях 2-6 макролидного цикла находятся остатки пиперидазинилкарбоновой кислоты и/или 2) в положениях 7-9 макролидного кольца находится остаток ароматической α-аминокислоты и/или 3) в положениях 10-12 макролидного цикла находится остаток алифатической α-аминокислоты, в свободной или защищенной форме или в форме соли.

Пригодные макролиды по настоящему изобретению характеризуются двумя, прежде всего всеми тремя структурными признаками 1), 2) и 3).

Пригодным остатком пиперидазинилкарбоновой кислоты является остаток 1,2-пиперидазин-3-карбокси-1-ил, карбоксильная группа в котором расположена в положении 1, а первый атом азота в положении 6 макролидного цикла, т.е. остаток формулы I

где указанные номера означают положения атомов в макроциклическом кольце. Указанный остаток может содержать или не содержать заместители в цикле. Пригодным является незамещенный остаток.

Карбоксильная группа в составе остатка ароматической α-аминокислоты обычно расположена в положении 7 макроциклического кольца, а α-аминогруппа - в положении 9. Пригодной ароматической α-аминокислотой являются замещенный или незамещенный фенилаланин, прежде всего содержащий заместители гидрокси, метокси, этокси, OnPr, OiPr, в свободной, защищенной или активированной форме.

Карбоксильная группа в составе остатка алифатической α-аминокислоты обычно расположена в положении 10 макроциклического кольца, а α-аминогруппа- в положении 12. Пригодной ароматической α-аминокислотой является остаток валина в свободной, защищенной или активированной форме.

Остальная часть макроциклического кольца прежде всего включает остаток гидроксикарбоновой кислоты, оксигруппу, расположенную а концевой части макроциклической лактонной группы, и карбонильную группу, которая образует амидную связь с α-аминогруппой в положении 12 макроциклического кольца. Длина цепи указанного остатка гидроксикарбоновой кислоты прежде всего составляет от 6 до 20, более предпочтительно 11, атомов углерода. Указанный остаток является замещенным или незамещенным и/или содержит одну или более ненасыщенных связей прежде всего в виде чередующихся двойных связей вдоль цепи. Предпочтительная остальная часть макроциклического кольца включает остатки 11-оксиундеканоил-11-ил, прежде всего 11-оксиундека-6,8-диеноил-11-ил, необязательно замещенные, например, в положениях 2, 3, 4 и/или 5. Более пригодным остатком указанной гидроксикарбоновой кислоты является остаток формулы II

где R₁ означает Н, ОН или дополнительную связь, R₂ означает Н или дополнительную связь, R₃ означает Н, R₄ означает -СО-СН₃ или -СН(ОН)- СН₃ или R₃ и R₄ вместе означают остаток формулы III

в свободной или защищенной форме или в форме соли. Предпочтительными макролидами по настоящему изобретению являются макролиды, содержащие макроциклическое кольцо формулы IV

где X, Y и Z означают остатки 1), 2) и 3), значения которых описаны выше, а А означает остаток гидроксикарбоновой кислоты, описанный выше, в свободной или защищенной форме или в форме соли, прежде всего макроциклическое кольцо формулы V

в свободной или защищенной форме или в форме соли. В большинстве случаев в санглиферинах макроциклическое кольцо является замещенным по атому углерода, соседнему с оксигруппой в составе лактонной мостиковой связи. В большинстве случаев таким заместителем является остаток 1-оксо-7-азаспиро-{5.5}-ундекан-8-он-2-ил, например, формулы VI

где -а-b- означает - (Ме)С=СН- или -(Ме)СН-СН(ОН)-, a R означает Н или Me (где Me и Et означают метил и этил соответственно) в свободной или защищенной форме, или соли указанных соединений, причем указанный остаток связан с макролидным кольцом через связующую группу, включающую линейную цепь из 6-11, прежде всего 9, атомов углерода между спироостатком и макролидным кольцом.

Связующая группа является замещенной или незамещенной и/или содержит одну или более ненасыщенных связей прежде всего в виде чередующихся двойных связей вдоль цепи. Пригодная связующая группа замещена метильной группой, например двумя метильными группами. Пригодная связующая группа замещена гидроксигруппами, например тремя гидроксигруппами, и/или является этиленненасыщенной, например, содержит 2 углерод-углерод двойные связи. Более пригодная связующая группа содержит остаток 1,7-диметилнонан-9-ил, прежде всего 1,7-диметилнон-1-ен-9-ил или 1,7-диметилнона-1,3-диен-9-ил, необязательно замещенный, например, в положениях 3, 4 и/или 8. Предпочтительная связующая группа является группой формулы VII

где с означает связь с спироостатком, d означает связь с макроциклическим кольцом, a R₆ и R₇ каждый означает ОН или вместе означают дополнительную связь, в свободной или защищенной форме.

Связующая группа в большинстве случаев присоединена к макроциклическому кольцу через атом углерода, соседний с лактонной оксигруппой, то есть, если макроциклическое кольцо содержит остаток 11-оксиундеканоил-11-ил, то в положении 11 указанного цикла.

В настоящем изобретении предлагаются соединения формулы VIII

S--L-M VIII

где S означает спиробициклогруппу, как описано выше, L означает связующую группу, как описано выше, а М означает макролидное кольцо, значение которого описано выше, в свободной или защищенной форме, или соли указанных соединений.

Предпочтительными соединениями по настоящему изобретению являются соединения формул IХа и IX

где -a-b- имеет значение, описанное выше, -e-f- означает -СН(ОН)- СН(ОН)- или -СН=СН-, -g-h-имеет значение, описанное выше для -a-b-, a R₃, R₄ и R₅ имеют значения, описанные выше, в свободной или защищенной форме, или соли указанных выше соединений.

Соединения формул I - IX содержат асимметричные атомы углерода и поэтому могут существовать в виде различных эпимерных форм. Все возможные эпимеры, а также их диастереомерные смеси включены в объем настоящего изобретения. Однако соединения формул VIII и IX, в которых макролидное кольцо замкнуто и которые характеризуются соответствующей стереохимией, проявляют активность, характерную для санглиферинов, как описано в данном контексте. Предпочтительными являются эпимеры, проявляющие активность, характерную для санглиферина. В большинстве случаев предпочтительными, например, для применения в фармацевтике по настоящему изобретению, являются эпимеры, проявляющие виды активности, характерные для санглиферинов, в основном содержащие индивидуальный изомер или в форме частично индивидуальных изомеров (т.е. не содержащие или в основном не содержащие эпимеры, не обладающие характерной для санглиферинов активностью), например, содержащие по крайней мере 90%, например, по крайней мере 95% активного эпимера (т.е. содержащие менее 10%, например менее 5% неактивного эпимера).

Предпочтительный остаток 3-карбоксипиперидазинилкарбоновой кислоты 1) в положениях 1-6 макроциклического кольца характеризуется следующей конформацией

Предпочтительная ароматическая аминокислота 2) в положениях 7-9 макроциклического кольца характеризуется конфигурацией L, например следующей конфигурацией

Предпочтительная алифатическая аминокислота 3) в положениях 10-12 макроциклического кольца характеризуется конфигурацией L, например следующей конфигурацией

Если остальной фрагмент макроциклического кольца содержит остаток формулы II, то он предпочтительно характеризуется конфигурацией

или

если R₃ и R₄ вместе характеризуются конфигурацией

предпочтительный остаток 1 -оксо-7-азаспиро-{5.5}-ундекан-8-он-2-ила характеризуется конфигурацией

где если -а-b- означает -(Ме)СН-СН(ОН)-, то он предпочтительно характеризуется конфигурацией

Если связующая группа характеризуется формулой VII, то соединение предпочтительно имеет конфигурацию

Если R₆ и R₇ каждый означает ОН, то конфигурация в положениях 26 и 27 предпочтительно означает 26(S), 27(S) или 26(R), 27(R). Если R₆ и R₇ вместе образуют дополнительную связь, то конфигурация в положениях 26 и 27 предпочтительно означает следующую конфигурацию

Соединения по настоящему изобретению формулы IX предпочтительно характеризуются следующей конформацией

где если -a-b- означает -(Ме)СН-СН(ОН)-, то он предпочтительно характеризуется следующей конформацией

если -e-f- означает -СН(ОН)-СН(ОН)-, то соединение предпочтительно характеризуется конфигурацией (S), (S) или (R), (R), если -g-h- означает -(Me) СН-СН(ОН)-, то он предпочтительно характеризуется следующей конфигурацией

если -g-h- означает - (Ме)С=СН-, то он предпочтительно характеризуется конфигурацией

и если R₃ и R₄ объединены, то они характеризуются конфигурацией

Соединения по настоящему изобретению применяют в свободной или защищенной форме, например в защищенной форме, как описано в книге «Protective Groups in Organic Synthesis», Т.W.Greene и P.G.M.Wuts, 2oe изд., John Wiley & Sons Inc., New York (1991). Прежде всего группы ОН присутствуют в защищенной форме, например, в форме силильных эфиров (например, как описано на стр.68-86 книги Greene и Wuts), сложных эфиров (см., например, стр.87-103 книги Greene и Wuts) и карбонатов (см., например, стр.104-111 книги Greene и Wuts). Такие защищенные формы включают также внутренние защищенные формы, например, в случае макролидов формулы IX, где -g-h- означает -СН(СН₃)-СН(ОН)-, защищенную форму, в которой в положениях 14-17 макроциклического кольца находится остаток формулы X

Например, 1,3-диолы, присутствующие в санглиферинах, можно защитить за счет образования соответствующих циклических структур, например, как описано на стр.118-142 книги Greene и Wuts.

Соединения по настоящему изобретению существуют также в форме солей. Примеры фармацевтически приемлемых солей по настоящему изобретению включают кислотно- и основно-аддитивные соли в зависимости от соответствующих заместителей в составе соединения, например гидрохлориды.

Как указано выше, макроциклическое кольцо в составе соединений по настоящему изобретению можно отщеплять, прежде всего по лактонной оксигруппе, при этом получают соединения, в которых макроциклическое кольцо не замкнуто. В большинстве случаев отщепление лактонной оксигруппы осуществляют при гидролизе (сольволизе), например, для получения соединений с открытым макроциклическим кольцом формулы XI

например, формулы XII

например, соединение формулы IX'

где X, Y, Z, A, -a-b-, -e-f-, -g-h-, R₃, R₄ и R₅ имеют значения, описанные выше, a R₆ означает Н или С₁-С₄алкил, например метил.

Такие незамкнутые формы можно использовать в качестве промежуточных соединений для модификации основной макроциклической системы санглиферинов и такие формы являются частью настоящего изобретения.

В другом объекте настоящего изобретения предлагаются макролид, описанный выше, в форме незамкнутого цикла в свободной или защищенной форме или его соль, соединение R₆ O-X-Y-Z-A-ОН, описанное выше, в свободной или защищенной форме или его соль, соединение R₆ O-X-Y-Z-A'--CH(OH)-L-S, где -А'- СН(ОН)- означает остаток гидроксикарбоновой кислоты, например остаток формулы II, как описано выше, а значения других символов описаны выше, в свободной или защищенной форме, или его соль,

соединение формулы XII'

в свободной или защищенной форме или его соль, соединение формулы IX'

в свободной или защищенной форме или его соль.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения (указанного объекта) предлагается соединение формулы IX"

где -а-b- означает -(Ме)С=СН- или -(Me) CH-CH(OH)-, R₈ означает Н или -C(O)-OR₁₀, где R₁₀ означает Н или Me, R₉ означает Н или, при условии, что -а-b- означает -(Ме)СН-СН(ОН)- и R означает -С(O)- ОМе, R₉ означает Me, а Х означает Н, если -N-N- означает простую связь между двумя атомами азота, или Х вместе с -N-N- означает двойную связь между двумя атомами азота, в свободной или защищенной форме, или его соль.

В более предпочтительных вариантах настоящего изобретения предлагаются соединения формул W, Y (секосанглиферин A), S (секосанглиферин В) и Т

В объем настоящего изобретения включены соединения, в которых циклическая система 1-оксо-7-азаспиро-{5.5}-ундекан-8-он-2-ил находится в виде незамкнутого цикла, например соединение формулы XIII

где a, b, L и М имеют значения, описанные выше, в свободной или защищенной форме, или его соль.

Соединения в виде незамкнутого цикла по настоящему изобретению предпочтительно характеризуются конформацией, описанной выше, в качестве предпочтительной для соединений с замкнутым циклом. Спиробициклоциклическая система соединений формулы XIII в виде незамкнутого цикла предпочтительно характеризуется конформацией

где -а-b- означает -(Me)CH-CH(OH)-.

Прежде всего в настоящем изобретении предлагается соединение формулы Z (санглиферин Е)

в свободной или защищенной форме, или его соль.

Соединения формул IX", S, Т, W, Y, XIII и Z можно использовать в качестве промежуточных соединений для получения санглиферинов, в основном содержащих замкнутые циклы и расширенные замкнутые циклы.

Соединения формулы IX" получают отщеплением макролидного цикла в составе санглиферина с замкнутым циклом, например санглиферина А или В, по связи лактонной оксигруппы или по соседней связи. Таким образом, например, соединения формул Y и Т получают при обработке санглиферина А в присутствии основания, например, в случае соединения формулы III в присутствии гидроксида щелочного металла, и, например, в случае соединения формулы IV в присутствии метанола и карбоната щелочного металла.

В другом варианте соединения формулы IX" получают выделением из культуральной среды микроорганизмов, продуцирующих санглиферин. Например, соединения формул Y и S выделяют из культуральной среды Streptomyces sp.A92-308110, как описано в данном контексте.

Выделение соединений формул Y и S из культуральной среды Streptomyces sp.A92-308110 описано в патенте US 6124453.

Соединение формулы Z получают отщеплением спироциклической системы между атомом азота и центральным атомом в спиросистеме. В другом варианте соединение формулы Z получают выделением из культуральной среды микроорганизмов, продуцирующих санглиферин. Например, выделение соединения формулы Z из культуральной среды Streptomyces sp.A92-308110 описано в патенте US 6124453.

Макролиды по настоящему изобретению, содержащие спиробициклический остаток, присоединенный к макроциклическому кольцу, обрабатывают в условиях отщепления промежуточной связующей группы, например, в случае соединения формулы IX, прежде всего по связи между остатками 26 и 27, при этом получают новые спиробициклические соединения и другие макролиды. Как указано выше, такие соединения можно использовать в качестве промежуточных соединений, при этом спиробициклический остаток санглиферинов вносит основной вклад в биологическую активность класса санглиферинов.

В настоящем изобретении предлагается 1-оксо-7-азаспиро-{5.5}-ундекан-8-он-2-ил в свободной или защищенной форме, его соль прежде всего соединение формулы VI'

где R₇ означает Н, необязательно защищенную ОН-группу, реакционноспособную функциональную группу или a CH₂-СН(ОН)-СН(СН₃)-СН₂-СН₂-СНО группу или их аналог δ-лактона, в свободной или защищенной форме, или его соль.

Предпочтительно соединение формулы VI' характеризуется следующей конфигурацией

где если -а-b- означает -(Ме)СН-СН(ОН)-, то соединение предпочтительно характеризуется конфигурацией, как описано выше.

В настоящем изобретении предлагается 1-оксо-7-азаспиро-{5.5}-ундекан-8-он-2-ил в виде незамкнутого цикла в свободной или защищенной форме, его соль, прежде всего соединение формулы XIII'

где -a-b- и R₇ имеют значения, описанные выше, в свободной или защищенной форме или его соль. Спиробициклосистема соединений формулы XIII' с незамкнутым циклом предпочтительно характеризуется конфигурацией

где если -а-b- означает -(Ме)СН-СН(ОН)-, то соединение предпочтительно характеризуется конфигурацией, как описано выше.

В настоящем изобретении предлагается также макролид формулы XIV

где М означает макролидное кольцо, описанное выше, прежде всего макролид формулы XV

который предпочтительно характеризуется конформацией

где если -g-h- означает -(Me)CH-CH(OH)-, то соединение предпочтительно характеризуется конфигурацией, как описано выше, и если -g-h- означает -(Ме)С=СН-, то оно предпочтительно характеризуется конфигурацией, как описано выше, и если R₃ и R₄ объединены, то они предпочтительно характеризуется конфигурацией, как описано выше, в свободной или защищенной форме, в форме системы с незамкнутым циклом, или его соль.

В настоящем изобретении предлагается также макролид формулы XVI

где Х означает Н, метокси, этокси, OnPr, OiPr,

R14 и R15 независимо означают Н, метил, алкил, С₁-С₄алкил, C₁-C₄-CO-СН₃ или R14 и R15 вместе образуют 5-7-членный замещенный или незамещенный циклоалкил, который выбирают, например, из соединения формулы XVII

R16 означает Н, или Me, или С₁-С₄алкил;

R17 означает Н, ОН, -O-С₁-С₄алкил или R14, R15 и R17 вместе образуют циклоалкил формулы XVIII

R23 означает Н, С₁-С₁₀алкил с прямой или разветвленной цепью и/или содержит одну или более ненасыщенных связей, прежде всего чередующихся двойных или тройных связей вдоль цепи, предпочтительно -СН=СН₂, -СН₂-ОН, -СН₂-ОСН₃, -СНО, -СООН или формулы XIX'

Пригодный R23 является замещенным, как описано в данном контексте.

В другом объекте настоящего изобретения предпочтительные макролиды выбирают из соединений формулы XX

В другом объекте настоящего изобретения предлагаются макролиды и соединения по настоящему изобретению, прежде всего полученные из природных продуктов в основном в очищенной форме, например, содержащие по крайней мере 90%, предпочтительно 95%, прежде всего по крайней мере 98% очищенной формы.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения санглиферины А, В, С и D, кроме других, выделяют из новых штаммов микроорганизмов Streptomyces sp.А92- 308110. Образцы штаммов Streptomyces sp.A92-308110 хранятся в банке микроорганизмов фирмы Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH (Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig, Германия) и зарегестрированы 3 мая 1995 г. согласно Будапештскому договору под номером DSM 9954. Выделение санглиферинов А, В, С и D из культуральной среды Streptomyces sp.A92-30810 описано в патенте US 6124453.

Макролиды по настоящему изобретению, например соединения формулы IX, например санглиферины А, В, С и D и их фармацевтические соли (в данном контексте «агенты по настоящему изобретению»), характеризуются видами активности, харктерными для санглиферинов, т.е. следующей комбинацией активностей:

связывание с циклоспорином,

ингибирующая активность в отношении пептидилпролил-цис-транс-изомеразы,

иммунодепрессантная активность,

подавление пролиферации В- и Т-клеток,

но не связываются с белком FK и не ингибируют активность кальциневрина.

Биологическую активность макролидов по настоящему изобретению, например, формулы XVI можно оценивать стандартными методами анализа in vitro и in vivo, например, как описано ниже.

Изучение пролиферативной ответной реакции лимфоцитов на аллогенную стимуляцию проводили следующим образом. Клетки селезенки (2×10)⁵ мыши Balb/c (самка, возраст 8-10 недель) инкубировали в течение 4 суток в смеси с клетками селезенки (2×10) мыши СВА (самка, возраст 8-10 недель). Аллогенные клетки индуцировали пролиферативную ответную реакцию в популяции клеток-респондеров селезенки, которую оценивали по включению меченного предшественника в ДНК. Величина IC₅₀ для макролидов по настоящему изобретению, например соединений формулы IX и их фармацевтически приемлемых солей, например санглиферинов А, В, С и D, составляла приблизительно от 30 до приблизительно 200 нМ по сравнению с величиной IC₅₀ 20 нМ для циклоспорина А, определенной по данным указанного анализа (см. статью Т. Мео, The MLR in the mouse, в книге "Immunological Methods", под ред. L.Lefkovits и В.Pernis, Academic Press, N.Y. cc.227-239 (1979)).

Клетки селезенки (2×10)⁵ мыши СВА инкубировали в течение 48 ч в смеси с LPS (мЕд..г/мл) и исследуемым соединением. Пролиферативную ответную реакцию оценивали по включению меченого предшественника в ДНК. Макролиды по настоящему изобретению, например соединения формулы IX и их фармацевтически приемлемые соли, например санглиферины А, В, С и D, ингибировали пролиферацию В-клеток, а величина IC₅₀ составляла приблизительно от 40 до приблизительно 100 мкМ (см. статьи Greaves M. и J.Janossy, Elicitation of selective T and В lymphocyte response by cell surface binding ligands. Transplant Rev., т.11, с.87 (1972), Janossy G. и M.F.Greaves, Lymphocyte activation, I, Response of T and В lymphocytes to phytomitogens, Clin. Exp. Immunol, т.9, cc.483-498 (1971).

Цитотоксичность определяли с использованием клеточной культуры моноцитов человека ТНР1 (5×10⁴ клеток/лунка), которые инкубировали в присутствии IFNγ (100 Ед./мл), LPS (5 мкг/мл) и исследуемого соединения (не более 10 мкМ) в течение от 24 до 72 ч при 37°С. Количество выживших клеток определяли с использованием колориметрического метода МТТ, который позволяет определять ферментативную акивность митохондриальной дегидрогеназы в живых клетках (см. статью Mossman (1983)). Величина IC₅₀ для макролидов по настоящему изобретению, например соединений формулы IX и их фармацевтически приемлемых солей, например санглиферинов А, В, С и D, составляла приблизительно от 1000 до 5000 нМ после инкубирования в течение 24 ч (см. статью Mossman Т.J., Rapid calorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxic assays, J. Imm. Methods., т.65, cc.55-63 (1983)).

Моноядерные клетки получали из периферической крови здоровых добровольцев в градиенте Ficoll-Hypaque по методике, как описано в статье Hansell и др. (1991). Клетки (10⁵ клеток/лунка в 200 мкл среды RPMI, содержащей 10 об.% ЭТС) перед добавлением стимулирующего соединения инкубировали с серийными разбавлениями исследуемых соединений в течение 30 мин при 37°С. В качестве стимулирующего соединения для индуцирования высвобождения α-фактора некроза опухолей (TNF) моноядерными клетками периферической крови использовали γ-интерферон (100 Ед./мл) и LPS (5 мкг/мл). Через 3 ч инкубирования клетки центрифугировали (1200 об/мин в течение 10 мин) и собирали супернатанты. Количество TNF в супернатантах клеток определяли с использованием коммерческого набора для анализа методом ИФА. Величина IС₅₀ для макролидов по настоящему изобретению, например соединений формулы IX и их фармацевтически приемлемых солей, например санглиферинов А, В, С и D, составляла приблизительно от 200 до приблизительно 1000 нМ.

Пригодным методом анализа связывания с циклофилином является конкурентный метод ИФА, описанный в статье Quesniaux, Eur. J. Immunol, т.17, cc.1359-1365 (1987). Исследуемое соединение добавляли в процессе инкубирования циклофилина (рекомбинантный циклофилин А человека) с комплексом БСА-циклоспорин А в составе покрытия планшета и затем рассчитывали концентрацию, необходимую для обеспечения 50% ингибирования контрольной реакции в отсутствие конкурентного агента (IС₅₀). Другим методом анализа является конкурентное связывание, описанное в статье Schneider и др., Biochemistry, т.33, cc.8218-8224 (1994), который заключается в добавлении исследуемого соединения в процессе инкубирования биотинилированного циклофилина (рекомбинантный циклофилин А человека) с комплексом БСА-циклоспорин А в составе покрытия. Количество биотинилированного циклофилина, связывающегося в присутствии и отсутствие исследуемого соединения, определяли при инкубировании с конъюгатом стрептавидина и щелочной фосфатазы. Величина IС₅₀ для макролидов по настоящему изобретению, например соединений формулы IX и их фармацевтически приемлемых солей, например санглиферинов А, В, С и D, составляла приблизительно от 10 до приблизительно 100 нМ по сравнению с величиной IС₅₀ приблизительно 80 нМ для циклоспорина А, определенной указанным методом анализа.

Другой метод анализа in vitro, который можно использовать для определения биологической активности санглиферинов, включает анализ с использованием репортерного гена IL-2 и клеток селезенки, стимулированных СоnА (оценка действия на активацию Т-клеток).

С использованием стандартных методов анализа установлено, что макролиды по настоящему изобретению, например соединения формулы IX, например санглиферины А, В, С и D, не проявляют активности в отношении связывания белков FK и не ингибируют активность кальциневрина.

Агенты по настоящему изобретению можно использовать в качестве лекарственных средств, например в качестве иммунодепрессантов, противовоспалительных и/или противовирусных агентов.

Они являются пригодными, прежде всего, для профилактики нарушений, связанных с инфекциями вируса гепатита, прежде всего гепатита С. Кроме того, агенты по настоящему изобретению можно использовать для подавления нарушений, связанных с активностью пептидилпролил-цис-транс-изомеразы (PPI). PPI представляют собой вид циклофилина, ускоряющего укладку белковых цепей за счет катализа цис-транс-изомеризации имидных пептидных связей пролина в олигопептидах. Макролиды по настоящему изобретению связываются с циклофилинами и ингибируют активность PPI.

Агенты по настоящему изобретению можно использовать также для лечения аутоиммунных заболеваний и воспалительных состояний, прежде всего воспалительных состояний с этиологией, включающей аутоиммунную компоненту, таких как артрит (например, ревматоидный артрит, хронический прогрессирующий артрит и деформирующий артрит) и ревматоидные заболевания.

Ряд других вариантов настоящего изобретения включает также:

1.1 Способ профилактики или лечения инфекций, вызванных вирусом гепатита С, или нарушений, вызванных ВГС, таких как фиброз печени, цирроз печени или гепатоцеллюлярная карцинома, у пациентов, нуждающихся в таком лечении, который заключается во введении указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения, связывающегося с циклофилином, такого как санглиферин, например соединения формулы, в отдельности или в комбинации с одним или более ко-агентов.

1.2 Способ подавления репликации ВГС в среде, который заключаются в добавлении в среду эффективного количества соединения, связывающегося с циклофилином, такого как санглиферин, например соединения формулы.

1.3 Способ подавления репликации ВГС в организме пациента, нуждающегося в таком ингибировании, который заключаются во введении указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения, связывающегося с циклофилином, такого как санглиферин, например соединения формулы.

1.4 Способ профилактики рецидива инфекции ВГС у пациента после трансплантации, нуждающегося в такой профилактике, который заключается во введении указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения, связывающегося с циклофилином, такого как санглиферин, например соединения формулы.

2. Применение соединения, связывающегося с циклофилином, такого как санглиферин, для получения фармацевтической композиции, предназначенной для применения согласно любому методу, описанному выше.

3. Фармацевтическя композиция, предназначенная для применения согласно лю