Способ массового производства области fc иммуноглобулина с удаленными начальными метиониновыми остатками

Способ массового производства области fc иммуноглобулина с удаленными начальными метиониновыми остатками

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к способу производства мономерной или димерной области Fc иммуноглобулина, лишенной начальных метиониновых остатков, в массовом масштабе, путем использования рекомбинантного экспрессирующего вектора, включающего в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантную область Fc иммуноглобулина, включая шарнирную область иммуноглобулина.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

С прогрессом генной инженерии было разработано и использовано большое число белковых лекарственных препаратов. Чувствительные к денатурации или протеолитическому расщеплению в теле, белковые лекарственные препараты, тем не менее, сложно удерживать в постоянной концентрации in vivo и в титрах в течение долгого периода времени. Улучшение стабильности белков in vivo, что может привести к сохранению концентрации белкового лекарственного препарата in vivo на подходящем уровне, является важным не только для повышения эффективности терапии, но и для помощи пациентам, которым необходимо делать частые инъекции белковых лекарственных препаратов, в плане удобства и стоимости.

Много попыток было сделано для увеличения стабильности in vivo белковых лекарственных препаратов в течение долгого периода времени, например, изменением состава белка, слиянием белка с другим белком, или химическим или биологическим присоединением подходящего полимера к поверхности белка.

Одним таким способом является изготовление слитого белка с областью Fc иммуноглобулина.

Область Fc иммуноглобулина опосредует эффекторные функции, такие как комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) или антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), так же как и антигенсвязывающая способность, которая является уникальной функцией иммуноглобулинов. Также, область Fc содержит последовательность, участвующую в связывании с рецептором Fc новорожденного (FcRn), который играет роль в регуляции уровней сыворотки IgG путем увеличения переноса материнского IgG к новорожденным и времени полужизни IgG (Ghetie and Ward, Immunology Today 18: 592-598, 1997), и эта последовательность регулирует взаимодействие между белком А и белком G. Многочисленные исследования были проведены с целью повышения стабильности терапевтического белка путем слияния этого фрагмента Fc с терапевтическим белком.

Например, патент Кореи № 249572 раскрывает слитый белок, который получают присоединением тяжелой цепи области Fc (Fc) с ее амино-конца к карбоксильному концу белка, такого как рецептор IL4, рецептор IL7, рецептор G-CSF или EPO рецептор, и продуцирование полученного слитого белка в клетках млекопитающих. Патент США № 5605690 описывает слитый белок, включающий рецептор фактора некроза опухолей, слитый своим карбоксильным концом с производным Fc человеческого IgG1, причем слитый белок продуцируется в клетках животных. Также, Tanox Inc. сообщила в патентах США № 5723125 и 5908626 о гибридной молекуле, включающей человеческий интерферон альфа или бета, который присоединен со своего карбоксильного конца к нативному человеческому Fc IgG4 при помощи пептидного линкера, и произведенной в клетках животных. Lexigen Inc., как описано в международной публикации заявки РСТ WO 00/69913, получила нативный IgG1 Fc, присоединенный своим карбоксильным концом к аминному концу человеческого интерферона генетической рекомбинацией без использования линкера, и изготовила слитый белок в клетках животных. Патентная публикация США № 20030082679 раскрывает слитый белок с увеличенным временем полужизни в сыворотке, который включает человеческий G-CSF, присоединенный со своего карбоксильного конца к амино-концу IgG1 Fc, и который изготовлен в клетках животных. Патентная публикация США № 20010053539, патент США № 6030613, международная публикация заявки РСТ WO 99/02709 и WO 01/03737 и европейский патент № 0464533B1 раскрывают Fc-слитый белок с большим временем полужизни в сыворотке, чем нативный белок, который включает IgG1 Fc, или его производное, присоединенные своим амино-концом, при помощи пептидного линкера, или без пептидного линкера, к карбоксильному концу человеческого EPO, TPO, человеческого гормона роста или человеческого бета интерферона, причем Fc-слитый белок произведен в клетках животных.

Эти Fc-слитые белки, как описано выше, увеличивают время полужизни в сыворотке целевых белков, но влекут за собой проблемы, связанные с опосредованием эффекторных функций фрагментом Fc (патент США № 5349053). Через эффекторные функции фрагмента Fc они фиксируют комплементы или связываются с клетками, экспрессирующими FcγRs, что приводит к лизису специфических клеток и стимулирует выработку и выделение нескольких цитокинов, вызывающих воспаление, что приводит к нежелательному воспалению. Также слияние создает новую аминокислотную последовательность в области соединения между фрагментом Fc и партнером-белком, которая может потенциально вызывать иммунные ответы, если белки вводились в течение долгого времени.

В этом отношении было предпринято много попыток получить иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина, который имеет большое время полужизни в сыворотке, но лишен эффекторных функций. Cole et al. сообщили, что, когда аминокислотные остатки области CH2 в положениях 234, 235 и 237, которые, как известно, играют важную роль в связывании с Fc рецепторами, заменяются аланином, что, таким образом, дает Fc производное, имеющее уменьшенную аффинность к Fc рецепторам, активность ADCС ингибируется (Cole et al., J. Immunol. 159: 3613-3621, 1997). Однако во всех этих вариантах Fc может иметь увеличенную иммуногенность или антигенность по сравнению с нативным человеческим Fc-фрагментом, вследствие присутствия неподходящих аминокислот, и может потерять желаемые Fc функции.

Среди способов делеции или уменьшения нежелаемых эффекторных функций, с сохранением высокой концентрации иммуноглобулина в сыворотке, один основан на удалении сахаров из иммуноглобулина. Как описано в патенте США № 5585097, агликолизированное производное антитела, анти-CD3 антитело, может быть получено заменой гликозилированного остатка антител, аспарагинового остатка в положении 297 СН2 домена, другой аминокислотой. Это производное агликолизированного антитела проявляет уменьшенные эффекторные функции, но все же сохраняет аффинность к связыванию с FcRn рецептором без изменений во времени полужизни в сыворотке. Однако это производное также является проблематичным, в том смысле, что потенциально распознается как чужеродный материал и отторгается иммунной системой, вследствие продуцирования новой рекомбинантной структуры, имеющей аномальную последовательность. Патентная публикация США № 20030073164 раскрывает способ продуцирования производного Fc с использованием E. coli, которая лишена способности к гликозилированию, с тем, чтобы получить антитела для лечебных целей, лишенные эффекторных функций.

Американская компания Amgen Inc. описала в патенте США № 6660843 и в патентных публикациях США № 20040044188 и 20040053845 производное человеческого IgG1 Fc, имеющее делеции аминокислот, первых пяти аминокислотных остатков шарнирной области, которые присоединены к амино- или карбоксильному концу терапевтического белка или имитации терапевтического белка пептидом, и его производство, с использованием E. Coli-хозяина. Однако этот слитый белок, не имеющий сигнальной последовательности, экспрессируется как «тела включения», и, таким образом, должен быть подвергнут дополнительному процессу рефолдинга. Этот процесс рефолдинга белка уменьшает выходы, и, особенно если белок присутствует в качестве гомодимера или гетеродимера, разительно уменьшает производство димера. Также, когда белок, не имеющий сигнальной последовательности, экспрессируется в E. Coli, остаток метионина присоединяется к N-концу продукта экспрессии из-за особенности системы экспрессии белка E. coli. Вышеупомянутые продукты экспрессии Amgen Inc. имеют N-концевой остаток метионина, который может вызывать иммунные ответы при повторном или чрезмерном введении в организм. Также, поскольку эти слитые молекулы экспрессированы в форме слитого белка в E. Coli присоединением гена, кодирующего терапевтический белок, к Fc-гену, они с трудом экспрессируются в E. coli, либо терапевтический белок сложно изготовить в E. coli, если его экспрессия в E. coli в слитой форме приводит к значительному уменьшению или потере активности. Более того, поскольку слияние двух молекул приводит к не встречающейся в природе аномальной аминокислотной последовательности в области соединения двух белков, слитый белок может потенциально быть распознан иммунной системой как «не свой», и, таким образом, вызвать иммунные ответы.

Чтобы решить эти проблемы, авторы настоящего изобретения заранее получили Fc-фрагмент и белковый лекарственный препарат как отдельные полипептиды, не используя способ слияния, основанный на генетической рекомбинации, но используя лучшие системы экспрессии и ковалентно связывая два полипептида вместе, для использования Fc-фрагмента как носителя лекарственного препарата. В этом случае возможно получить конъюгат гликолизированного полипептидного лекарственного препарата и агликолизированного Fc, который не вызывает нежелаемые иммунные ответы, но имеет удовлетворительные свойства физиологической активности лекарственного препарата, длительности жизни и стабильности in vivo.

В вышеупомянутом случае, поскольку предпочтительной является агликолизированная форма Fc, используется прокариотическая система экспрессии, такая как E. coli. Методы производства белка, использующие систему экспрессии E. coli, имеют несколько преимуществ над традиционными способами, которые используют клетки животных, как изложено ниже. Экспрессирующий вектор E. coli может быть легко сконструирован, что, таким образом, позволяет быстро оценивать экспрессию белка. Из-за своего быстрого роста E. coli делает возможным массовое производство белков, представляющих интерес, при низкой цене. Также может быть использован относительно простой способ экспрессии. Таким образом, E. coli более полезна для коммерческого производства, чем другие клетки-хозяева.

Большинство областей Fc присутствуют как «тела включения» в результате сверхэкспрессии в E. coli. По этой причине промышленные требования заключаются в том, чтобы области Fc были экспрессированы в водорастворимой форме в E. coli. В европейском патенте № 0227110 описано получение области Fc IgG1, с использованием только продукта (клеточного лизата), который экспрессирован в водорастворимой форме в результате сверхэкспрессии области Fc IgG1. Однако выход иммуноглобулина, экспрессированного в водорастворимой форме, составляет только лишь не более 15 мг/л, что не имеет значения в смысле промышленной полезности. Патентная заявка Кореи № 0092783, преодолевающая проблему, с которой столкнулись в уровне техники, представляет новый способ экспрессии области Fc иммуноглобулина не как «тела включения», но в водорастворимой форме в E. Coli, при помощи слияния нуклеотидной последовательности соответствующей области Fc с сигнальной последовательностью E. coli. При экспрессии в E. coli, представляющий интерес белок присутствует в растворимой форме, лишенной сигнального пептида, с выходом продукта, увеличенным вплоть до 600 мг/л.

Приводящее к настоящему изобретению, интенсивное и тщательное исследование способа продуцирования активной агликозилированной области Fc иммуноглобулина, не имеющей иммунного ответа, проведенное авторами настоящего изобретения, имеющее цель увеличить производственный выход до уровня, подходящего для индустриализации, привело к открытию, что, когда нуклеотидная последовательность, кодирующая область Fc иммуноглобулина, экспрессирована в форме, слитой N-концом со специфической шарнирной областью, область Fc иммуноглобулина экспрессируется как «тела включения», которые в конечном итоге являются димерами или мономерами области Fc иммуноглобулина, лишенными начальных метиониновых остатков, при помощи процессов солюбилизации и рефолдинга.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, целью данного изобретения является обеспечить способ массового производства области Fc иммуноглобулина, лишенной начального метионинового остатка, включающий в себя конструирование вектора, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантную область Fc иммуноглобулина, содержащую шарнирную область иммуноглобулина; трансформирование прокариотической клетки вектором; культивирование получающегося трансформанта; и выделение и очистка области Fc иммуноглобулина, экспресированной в «теле включения» из трансформанта.

Другой целью данного изобретения является обеспечить димер или мономер области Fc иммуноглобулина, полученные вышеуказанным способом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Вышеперечисленные и другие цели, особенности и другие преимущества настоящего изобретения будут, безусловно, более понятны из последующего детализированного описания, данного в объединении с сопроводительными чертежами, в которых:

Фиг.1 представляет собой фотографию гель-электрофореза, показывающую образование мономерных и димерных фрагментов области Fc из экспрессированных «тел включения» с использованием экспрессирующего вектора, имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую область Fc человеческого иммуноглобулина IgG4;

Фиг.2 показывает результаты ELISA способности области Fc человеческого иммуноглобулина IgG4 связываться с C1q;

Фиг.3 показывает результаты ELISA способности области Fc человеческого иммуноглобулина IgG связываться с FcγRI;

Фиг.4 показывает результаты ELISA способности области Fc человеческого иммуноглобулина IgG связываться с FcγRIII;

Фиг.5 показывает результаты ELISA способности области Fc человеческого иммуноглобулина IgG связываться с FcRnαβ₂;

Фиг.6 показывает результаты в плане времен полужизни в сыворотке конъюгата EPO-PEG-Fc, полученные использованием области Fc человеческого иммуноглобулина IgG в качестве переносчика;

Фиг.7 представляет собой фотографию 15%-SDS-PAGE-геля, на котором, после смешения с эквивалентными объемами 2× буфера белкового образца, пропущены части ферментированных растворов, полученные выращиванием микробных трансформантов примера 2 в ферментерах в условии экспрессии;

Фиг.8 представляет собой фотографию SDS-PAGE-геля, на котором разделены и визуализированы как полосы белки, подвергнутые рефолдингу из экспрессированных «тел включения» трансформированных клеток примера 2;

Фиг.9 представляет собой фотографию 15%-SDS-PAGE-геля, на котором, после смешения с эквивалентными объемами 2х буфера белкового образца, пропущены части ферментированных растворов, полученные выращиванием микробных трансформантов примера 3 в ферментерах в условии экспрессии; и

Фиг.10 представляет собой фотографию 15%-SDS-PAGE-геля, на котором, после смешения с буфером белкового образца, лишенного восстановителя, такого как DTT или бета-меркаптоэтанол, пропущены соответствующие экспрессированные и очищенные продукты примера 3.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу массового производства области Fc иммуноглобулина, включающему в себя конструирование вектора, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантную область Fc иммуноглобулина, содержащую шарнирную область иммуноглобулина; трансформирование прокариотической клетки с вектором; культивирование получающегося трансформанта; и выделение и очистка области Fc иммуноглобулина, экспрессированной в форме «тела включения» из трансформированной клетки.

Настоящее изобретение относится к способу массового производства области Fc иммуноглобулина, полезной в качестве переносчика белковых лекарственных препаратов. Найдено, что когда область Fc иммуноглобулина присоединена N-концом к шарнирной области, образующаяся рекомбинантная область Fc иммуноглобулина экспрессирована в виде «тел включения», и затем ее растворяют и подвергают рефолдингу в димер или мономер в активной форме, лишенной начального метионинового остатка, кодируемого инициирующим кодоном. Настоящее изобретение имеет огромную значимость как открытие того, что присоединенная к области Fc иммуноглобулина шарнирная область играет важную роль в обработке и рефолдинге рекомбинантной области Fc иммуноглобулина в форму нативной последовательности, лишенной начального метионинового остатка, кодируемого инициирующим кодоном.

Шарнирная область, обеспечивающая возможность получения рекомбинантной Fc-области иммуноглобулина в больших количествах, может быть получена из IgG, IgA, IgM, IgE или IgD людей и других животных, включая коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, предпочтительно из IgG, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (SEQ ID NO: 14-17). Шарнирная область, полезная в настоящем изобретении, может быть непроцессированной шарнирной областью или ее фрагментом. Предпочтительной формой является фрагмент шарнирной области, имеющий две или более упорядоченных аминокислотных последовательности, которые, более предпочтительно, содержат в себе, по меньшей мере, один цистеиновый остаток. Практичными для использования в настоящем изобретении являются фрагменты шарнирной области, полученные из IgG4 SEQ ID NO: 17, которые представлены SEQ ID NO: 18, 19, 20 и 21. Когда используются шарнирные области SEQ ID NO: 18, 19, 20 и 21, область Fc иммуноглобулина может быть получена в димерной или мономерной форме. Шарнирная область SEQ ID NO: 21 позволяет эффективно получать мономер области Fc иммуноглобулина. В других осуществлениях настоящего изобретения фрагменты, представленные SEQ ID NO: 48-55 шарнирной области, полученной из IgG1 SEQ ID NO: 14, и представленные SEQ ID NO: 56-60 шарнирной области, полученной из IgG2 SEQ ID NO: 15, были использованы для производства димера области Fc иммуноглобулина.

Область Fc иммуноглобулина, способная производиться по настоящему изобретению, может быть нативной формой, выделенной из людей и других животных, включая коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или может быть ее рекомбинантом или производным, полученными из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. Предпочтительной может быть область Fc IgG, IgA, IgM, IgE и IgD людей или их комбинация или гибрид. Термин «комбинация», использующийся в данном описании, означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные фрагменты Fc иммуноглобулина одинакового происхождения, присоединены к одноцепочечным полипептидам различного происхождения с образованием димера или многомера. Термин «гибрид», использующийся в данном описании, означает, что последовательности, кодирующие два или более фрагмента Fc иммуноглобулина различного происхождения, присутствуют в одноцепочечном фрагменте Fc иммуноглобулина. Иммуноглобулин может предпочтительно быть областью Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или ее комбинацией или гибридом. Пригодные в настоящем изобретении нуклеотидные последовательности, кодирующие области Fc человеческого иммуноглобулина и аминокислотные последовательности, ограниченные указанным, могут кодироваться нуклеотидными последовательностями из банков данных GenBank и/или EMBL.

Область Fc иммуноглобулина настоящего изобретения включает производное аминокислотной последовательности. Термин «производное аминокислотной последовательности» означает последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков отличны от аминокислотной последовательности дикого типа, и может встречаться естественно или быть изготовленной искусственно. Область Fc иммуноглобулина включает производные, получающиеся от делеции, инсерции, неконсервативного или консервативного замещения или их комбинации. Инсерция обычно осуществляется присоединением упорядоченной аминокислотной последовательности приблизительно 1-20 аминокислот, или может быть осуществлена более длинной последовательностью. Делеция обычно осуществляется в диапазоне приблизительно 1-30 аминокислотных остатков. Аминокислотные замены в белках и пептидах, которые обычно не изменяют активность белков и пептидов, известны в данной области техники (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly в обоих направлениях. Такие производные могут быть получены при помощи способа химического синтеза пептида или способа, основанного на рекомбинации последовательности ДНК, которые известны в данной области техники (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2d Ed., 1989).

Кроме того, область Fc иммуноглобулина, при желании, может быть модифицирована с использованием фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и т.п.

Производное иммуноглобулина настоящего изобретения предпочтительно является функциональным эквивалентом в своей натуральной форме, таким образом, имея схожую биологическую активность, или, при желании, может быть сделано изменением свойства натуральной формы. Предпочтительно, производные области Fc иммуноглобулина являются белками, у которых увеличена структурная устойчивость к нагреванию, pH, и т.д. или растворимость, или у которых были улучшены характеристики в отношении образования дисульфидной связи, совместимости с экспрессионным хозяином, связывания комплемента, связывания Fc рецептора и антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), при условии, что изготовленные производные не сильно отличаются от натуральных форм, встречающихся у людей, и которые производят нежелаемые иммунные ответы в людях и животных. Предпочтительными производными являются области Fc IgG1, которые изменены в таком специфичном остатке, что имеют уменьшенную аффинность к Fc рецепторам, которые служат посредником антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Изготовленное производное может содержать делецию или замену другой аминокислотой в лейциновом остатке в положении 234 СН2 последовательности IgG1 (см. последовательность из базы данных Kobat для нумерации аминокислотных остатков). Более предпочтительно, Leu234 заменяется фенилаланином, аминокислотным остатком в соответственном положении в IgG4.

В соответствии с настоящим изобретением, получена нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантную область Fc иммуноглобулина, в которой область Fc иммуноглобулина соединена с шарнирной областью иммуноглобулина. Термин «рекомбинантная область Fc иммуноглобулина», использующийся здесь, означает область Fc иммуноглобулина, присоединенную N-концом к шарнирной области посредством пептидной связи.

В зависимости от области Fc иммуноглобулина, шарнирная область для присоединения может быть выбрана. Предпочтительной является шарнирная область, которая идентична в происхождении с областью Fc иммуноглобулина. В фактическом применении настоящего изобретения была получена нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантную область Fc иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 7, 9, 11 или 13, в которых область Fc IgG4 присоединена к шарнирной области, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 18, 19, 20 или 21. Нуклеотидные последовательности, кодирующие рекомбинантные области Fc иммуноглобулина, представлены SEQ ID NO: 6, 8, 10 и 12, соответственно.

В другом варианте осуществления была получена нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантную область Fc иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 или 37, в которой область Fc из IgG1 присоединена к шарнирной области, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной одной из SEQ ID NO: 48-55. Получающиеся нуклеотидные последовательности, кодирующие рекомбинантные области Fc иммуноглобулина, представлены SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 или 36.

В дополнительном варианте осуществления была получена нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантную область Fc иммуноглобулина, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 39, 41, 43, 45 или 47, в которой область Fc из IgG2 присоединена к шарнирной области, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной одной из SEQ ID NO: 56-60. Получающиеся нуклеотидные последовательности, кодирующие рекомбинантные области Fc иммуноглобулина, представлены SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44 или 46.

В соответствии с настоящим изобретением, предоставлены рекомбинантные экспрессирующие векторы, в которых функционально связаны нуклеотидные последовательности, кодирующие рекомбинанты областей Fc иммуноглобулина.

Термин «рекомбинантный экспрессирующий вектор», использующийся здесь, который описывает вектор, способный к экспрессии целевого белка в подходящей клетке-хозяине, относится к генетической структуре, которая включает в себя основные регуляторные элементы, в которых вставка функционально связанного гена осуществляется таким способом, что он экспрессируется в клетке-носителе.

Термин «функционально связанный», использующийся здесь, относится к функциональной связи между последовательностью нуклеиновой кислоты, контролирующей экспрессию, и второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей целевой белок таким способом, что предоставляет основные функции. Функциональное связывание с рекомбинантным вектором может быть получено, используя рекомбинантную генную инженерию, хорошо известную в области техники, и сайт-специфическое расщепление ДНК и лигирование могут быть проведены с использованием общеизвестных в области техники ферментов. Подходящий экспрессирующий вектор включает регуляторные элементы экспрессии, такие как промотор, инициирующий кодон, стоп-кодон, сигнал полиаденилирования и энхансер. Инициирующий кодон и стоп-кодон необходимы для функционирования в индивидууме, в который вводился генетический конструкт, и должны быть в рамках кодирующей последовательности. Промотор вектора может быть конститутивным или индуцибельным. Кроме того, экспрессирующие векторы включают маркер селекции, который делает возможным отбор клеток носителя, содержащих в себе вектор, и воспроизводимые экспрессирующие векторы включают участок начала репликации. В подробном осуществлении настоящего изобретения получены следующие рекомбинантные экспрессирующие векторы: pmSCPFc, pmPSCFc, pmCPSFc, pmCPFc, pMEPKFc1, pMSCKFc1, pMDKTFc1, pMCPAFc1, pMPKSFc1, pMCPPFc1, pMPPCFc, pMPCPFc, pmPPCG2Fc, pmPCPG2Fc, pmCPG2Fc, pmCCVG2Fc и pmCVE2Fc.

Рекомбинантные экспрессирующие векторы, экспрессирующие белки, трансформируются в клетки-хозяева.

Что касается цели настоящего изобретения, клетками-хозяевами являются прокариотические клетки, в которых не осуществляется гликозилирование. Примеры таких прокариотических клеток включают Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis и Staphylococcus с предпочтением E. coli. Иллюстрирующие, не лимитирующие, примеры штаммов E. coli включают BL21 (DE3), JM109, DH серии, TOP10 и HB101. Более предпочтительным является штамм BL21 (DE3). Из-за отсутствия системы гликозилирования белка E. coli может быть использована как клетка-хозяин, в которой область Fc иммуноглобулина продуцируется в форме, лишенной сахарных фрагментов, которые присутствуют в домене СН2 нативного иммуноглобулина. Сахарные фрагменты домена СН2 иммуноглобулина не оказывают влияния на структурную стабильность иммуноглобулинов, но являются причиной того, что иммуноглобулины служат связующим звеном антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) при объединении с клетками, экспрессирующими Fc рецепторы, и иммунными клетками, чтобы секретировать цитокины для вызова воспаления. Также, фрагменты сахаров связываются с C1q частью первого компонента комплемента С1, приводя к фиксации комплемента. Таким образом, когда область Fc иммуноглобулина продуцирована в агликолизированной форме и присоединена к терапевтическому белку, терапевтический белок присутствует в сыворотке в течение удлиненного периода времени без нежелательных эффекторных функций иммуноглобулинов.

Трансформация рекомбинантных экспрессирующих векторов в прокариотические клетки может быть достигнута любым способом, который дает возможность вводить нуклеиновые кислоты в клетки, и, как известно в данной области техники, может быть осуществлена выбором подходящих стандартных способов в соответствии с клетками-хозяевами. Эти способы включают, но не ограничиваются ими, электропорацию, слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция (CaPO₄), осаждение хлоридом кальция (CaCl₂), встряхивание волокном карбида кремния, и трансформацией, опосредованной PEG, декстрансульфатом и липофектамином.

В подробном осуществлении настоящего изобретения рекомбинантные экспрессирующие векторы по отдельности вводятся в E. coli, таким образом, образуя следующие трансформанты: BL21/pmSCPFc(HM11200), BL21/pmPSCFc(HM11201), BL21/pmCPSFc(HM11204), BL21/pmCPАFc(HM11205), BL21/pMEPKFc1(HM11206), BL21/pMSCDFc1(HM11207), BL21/pMDKTFc1(HM11208), BL21/pMCPAFc1(HM11209), BL21/pMPKSFc1(HM11210), BL21/pMCPPFc1(HM11211), BL21/pMPPCF1c(HM11212), BL21/pMPCPF1c(HM11213), BL21/pmPPCPG2Fc(HM11214), BL21/pmPCPG2Fc(HM11215), BL21/pmCPG2Fc(HM11216), BL21/pmCCVG2Fc(HM11217) и BL21/pmCVEG2Fc(HM11218).

Трансформанты, фиксирующие рекомбинантные экспрессирующие векторы, культивируются при помощи общего метода.

Условия культивирования могут легко регулироваться, в соответствии с бактериальным штаммом, специалистом в данной области техники. Обычно среда, используемая для культивирования, должна содержать все питательные вещества, необходимые для выживания и роста клеток. Среда должна содержать различные источники углерода, азота и микроэлементов. Примеры доступных источников углерода включают глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, крахмал, углеводы, такие как целлюлоза, жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода могут быть использованы поодиночке или в комбинации двух или более. Примеры доступных источников азота включают органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, ликер кукурузного экстракта (CSL) и соевую сыворотку, и неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота могут быть использованы поодиночке или в комбинации двух или более. В среде может содержаться источник фосфора, который включает дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, и соответствующие натрийсодержащие соли. В добавление к этому среда может содержать соль металла, такую как сульфат магния или сульфат железа. Среда может дополнительно включать аминокислоты, витамины, подходящие предшественники и т.п. pH культуры можно регулировать добавлением к культуре соединения, такого как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиака, фосфорной кислоты и серной кислоты подходящим способом. Также в течение культивирования для предотвращения образования пузырей могут быть использованы пеногасители, такие как сложные эфиры полигликоля и жирной кислоты. Для поддержания культуры в желаемом состоянии, в нее вводятся кислород или кислородсодержащие газы (например, воздух). Температура культивирования обычно составляет 20°С-45°С, и предпочтительно 25°С-45°С. Также для производства белка в крупном масштабе может быть использован ферментер. Производство белка с использованием ферментера следует проводить, принимая во внимание несколько факторов, включая скорость роста клеток-хозяев и уровни экспрессии белка. Экспрессию белка можно индуцировать посредством добавления, например, IPTG в среду при подходящих условиях культивирования.

Область Fc иммуноглобулина, сверхэкспрессированная как «тела включения», может быть очищена при помощи общей методики. Области Fc иммуноглобулина, изготовленные в трансформантах, могут быть получены разрушением клеток, с использованием «французского пресса», ультразвукового аппарата, и т.д., сбором только водонерастворимых «тел включений», содержащих область Fc иммуноглобулина, при помощи центрифугирования, солюбилизации и денатурации собранной фракции с агентами рефолдинга, такими, как мочевина, гуанидин, аргинин, цистеин, бета-меркаптоэтанол и т.д. для ее рефолдинга, и очисткой подвергнутого рефолдингу слитого белка при помощи диализа, различных хроматографий, таких как гель-хроматография, ионообменная и обращенно-фазовая колоночная хроматография, или ультрафильтрацией, поодиночке или в комбинации. Известно, что в большинстве случаев этот процесс рефолдинга - очень сложный и приводит к очень низкому выходу рефолдинга и дает рефолдированный белок более низкой активности, чем растворимый в воде белок.

Однако способом настоящего изобретения можно преодолеть вышеупомянутые проблемы и изготовить активную область Fc иммуноглобулина, лишенную начального метионинового остатка, в массовом масштабе. В целом, экспрессированный и продуцируемый в E. coli экзогенный белок имеет начальный метиониновый остаток, кодируемый инициирующим кодоном. Повторное или избыточное введение белкового продукта, имеющего начальный метиониновый остаток, может вызвать иммунный ответ в человеческом организме, достаточный, чтобы уменьшить его терапевтический эффект, или чтобы он был токсичным. Однако, когда рекомбинантная область Fc иммуноглобулина настоящего изобретения экспрессирована в E. coli, найдено, что начальный метиониновый остаток отщеплен аминопептидазой, природным ферментом цитоплазмы, как измерено анализом по установлению N-концевой последовательности (Adams et al., J. Mol. Biol. 33:571-589, 1968, Takeda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1487-1494, 1968). Известно, что активность таких аминопептидаз зависит от последовательности и структуры интересующего белка (Moerschell et al., J. Mol. Biol. Chem. 265:19638-19643, 1990, James et al., Protein Expression and Purification 41:45-52, 2005). Шарнирная область, прикрепленная к области Fc иммуноглобулина, находится под влиянием аминопептидазы, так что начальный метионин обрабатывается в степени, зависящей от ее аминокислотной последовательности.

Так как свойства шарнирной области определяют посттрансляционную модификацию протеаз, отношение димеров к мономерам можно эффективно регулировать выбором подходящих шарнирных областей. В добавление к этому, когда «тела включения» подвергнуты рефолдингу, образование правильных димеров затруднено за счет ошибочного сочетания цистеинов в дисульфидных связях. Однако способ в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает образование правильных дисульфидных связей, что, таким образом, приводит к образованию активных димеров.

В добавление к этому, настоящее изобретение может производить области Fc иммуноглобулина в более крупном масштабе, чем это могут традиционные способы. Например, область Fc иммуноглобулина производится с выходом 15 мг/л в соответствии со способом европейского патента № ЕР0227110, где область Fc G1 сверхэкспрессирована и очищена только от клеточного лизата, содержащего ее водорастворимую форму, и с выходом 15-600 мг/л в соответствии с патентной заявкой Кореи № 0092783, где область Fc иммуноглобулина, присоединенная к сигнальной последовательности E. Coli, экспрессирована в водорастворимой форме, но не как «тело включения». Однако настоящее изобретение может производить область Fc иммуноглобулина с выходом до 3-6 г/л очисткой «тел включения» рекомбинантной области Fc иммуноглобулина, содержащей шарнирную область. Таким образом, способ настоящего изобретения обеспечивает высокоэффективную систему для производства областей Fc иммуноглобулина в промышленном масштабе с более высоким выходом, чем в традиционных способах.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к области Fc иммуноглобулина, полученной в соответствии с вышеупомянутым способом.

Область Fc иммуноглобулина, продуцированная в прокариотических клетках, таких как E. coli, в соответствии с настоящим способом, не имеет специфических ограничений для промышленного применения. Одним характерным применением является использование в качестве переносчика для образования конъюгата с определенным лекарственным препаратом. Конструкция конъюгата, состоящая из области Fc иммуног