Гуманизированное антитело против остеопонтина человека

Гуманизированное антитело против остеопонтина человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против остеопонтина человека с очень высокой активностью и стабильностью и способу терапевтического и диагностического применения антитела при различных заболеваниях.

Уровень техники

Остеопонтин (обозначаемый далее в настоящем документе как "OPN") представляет собой кислый кальций-связывающий гликопротеин, находящийся в большом количестве в кости, и, у людей, как известно, вследствие различий в сплайсинге мРНК, представленный по меньшей мере, в трех изоформах: остеопонтин-a (далее в настоящем документе, обозначаемый как "OPN-a"), остеопонтин-b (далее в настоящем документе, обозначаемый как "OPN-b") и остеопонтин-c (далее в настоящем документе, обозначаемый как "OPN-c") (непатентный документ 1). В частности, предшественник OPN-a имеет аминокислотную последовательность, указанную в приведенном ниже списке последовательностей как SEQ ID NO:23, и как полагают, после секреции от последовательности отщепляется сигнальный пептид с образованием зрелой формы OPN-a, состоящей из I17-N314. Зрелая форма OPN in vivo расщепляется тромбином по 168 (в случае OPN-a) остатку аргинина в области C-конца с образованием N-концевого фрагмента и C-концевого фрагмента.

Описанный выше OPN отвечает за большое разнообразие физиологически и патологически важных функций и обладает функциями, например клеточной адгезии, клеточной миграции, онкогенеза, иммунного ответа, ингибирования опосредованного комплементом цитолиза и т.п. Эти разнообразные функции опосредованы широким спектром рецепторов, расположенных на клеточной поверхности. OPN содержит RGD-последовательность (например, для OPN-a, от 159 до 161 остатков); интегрины, которые распознают эту RGD-последовательность, такие как αVβ3, αVβ1 и αVβ5, представляют собой основные рецепторы OPN, из которых интегрины αVβ3, αVβ1 и αVβ5 опосредуют клеточную адгезию в гладкомышечных клетках сосудов; кроме того, αVβ3 связан с миграцией макрофагов, лимфоцитов, эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и т.п.

Кроме того, проведенное до настоящего времени исследование также показало, что OPN связывается с интегринами α9β1, α4β1 и α4β7 через последовательность SVVYGLR (SEQ ID NO:10), а отличие в способе связывания состоит в том, что α4β1 связывается с обоими OPN: нерасщепленным тромбином (нерасщепленный тип OPN) и отщепляемым тромбином N-концевым фрагментом (расщепленный тип OPN), тогда как α9β1 связывается только с расщепленным типом OPN (непатентные документы от 2 до 4). Эти субъединицы интегринов α9 и α4, и β1, и β7 очень схожи друг с другом по аминокислотной последовательности. Интегрины α4β1 и α4β7 в основном находятся в лимфоцитах и моноцитах, но очень низкий уровень экспрессии отмечается и в нейтрофилах. С другой стороны, α9β1 селективно экспрессируется на высоком уровне в нейтрофилах и ответственен за жизненно важные функции миграции нейтрофила посредством VCAM-1, Тенасцина-C и т.п. Вариант α9β1 широко экспрессируется в миоцитах, эпителиальных клетках, гепатоцитах и т.п. Таким образом, полагают, что цитоплазматические домены субъединиц α4 и α9 интегринов через соответствующие незначительно отличающиеся внутриклеточные пути передачи сигнала вовлечены в различные воспалительные реакции путем совместной стимуляции миграции и агрегации лейкоцитов к очагам воспаления для усиления их инфильтрационной активности.

Как описано выше, вследствие того, что большое разнообразие интегринов стимулируют миграцию лейкоцитов и вовлечены в воспалительные реакции, полагают, что лекарства, ингибирующие эти виды активности интегринов могут крайне эффективно использоваться в качестве противовоспалительных средств. Например, интегрин αVβ3 экспрессируется в остеокластах, эндотелиальных клетках сосудов, гладкомышечных клетках и т.п.; так как полагают, что ингибирование связывания интегрина с различными связывающимися лигандами оказывает супрессирующее действие на разрушение суставов, например, в суставах, постоянно продолжается разработка антител против αVβ3.

Тем не менее, так как экспрессия рецепторов, принадлежащих семейству интегринов, является универсальной представлена в большом числе тканей и ответственна за жизненно важные функции для поддержания различных видов биологической активности, то применение антител против интегрина при лечении ревматоидного артрита или остеоартрита может вызывать аналогичное ингибирование в других участках, а также представлять интерес с точки зрения побочных реакций.

С этой точки зрения, до настоящего времени были предприняты попытки прояснить этиологию ревматоидного артрита, остеоартрита и т.п. и обеспечить нам лучший терапевтический подход.

Например, в WO 02/081522 (патентный документ 1) обнаружено, что у пациентов с ревматизмом и у пациентов с остеоартритом отмечается высокая концентрация OPN в жидкости суставной полости, а у пациентов с ревматизмом наблюдали увеличенное отношение отщепляемого тромбином типа N-концевого фрагмента по сравнению с общим OPN, и подтверждено, что OPN непосредственно связан с возникновением этих заболеваний. В патентном документе 1 получены антитела, которые по отдельности распознают N-концевой фрагмент и C-концевой фрагмент, образовавшиеся в результате расщепления OPN тромбином, соответственно, и в исследовании с их использованием показано, что у пациентов с ревматоидным артритом отмечаются высокие концентрации отщепляемого тромбином N-концевого фрагмента в суставной полости, в частности. В таком N-концевом фрагменте одновременно присутствуют последовательность RGD и последовательность SVVYGLR (SEQ ID NO:10), обе распознаваемые типами интегринов человека; подтверждено, что антитело, которое одновременно блокирует эти две последовательности, значительно ингибирует связывание OPN и интегрина и эффективно для лечения ревматоидного артрита, остеоартрита и т.п.

В частности, в патентном документе 1 получено антитело, которое ингибирует связывание последовательности RGD OPN человека и интегрина и связывание последовательности SVVYGLR OPN человека (SEQ ID NO:10) и интегрина, и его действие подтверждено в экспериментах на клеточной адгезии, клеточной миграции и т.п. Кроме того, получено антитело против синтетического пептида, соответствующего внутренней последовательности OPN мыши, и его эффект, в качестве терапевтического лекарственного средства подтвержден с применением патологической модели артрита на мышах.

Таким образом, поскольку OPN мыши содержит последовательность RGD и последовательность SLAYGLR (SEQ ID NO:12), каждая из которых распознается интегрином мыши, в положениях на аминокислотной последовательности, гомологичным положениям OPN человека, то антитело M5 получено как антитело, одновременно блокирующее эти последовательности. Подтверждено, что связывание этого антитела M5 с OPN мыши и его отщепляемым тромбином продуктом ингибируется пептидом GRGDSP, который содержит RGD последовательность, и что это антитело M5 ингибирует миграцию активированных TNF-α моноцитов, выделенных из селезенки мыши. Когда, используя систему органной культуры свода черепа мыши, исследовали это антитело M5, наблюдали супрессирующее действие на разрушение кости. Кроме того, когда описанное выше антитело использовали на модели коллагенового артрита у мышей, был подтвержден выраженный терапевтический эффект (патентный документ 1 и непатентный документ 5).

Эти результаты убедительно указывают на то, что антитело, которое одновременно блокирует связывание последовательности RGD и типом интегрина человека, и последовательности SVVYGLR (SEQ ID NO:10) и типом интегрина человека, ингибирует связывание OPN и интегрином и является эффективным для лечения ревматоидного артрита и т.п., и, кроме того, показывают, что можно ожидать, что антитело будет эффективным не только при лечении таких форм ревматизма, как ювенильный ревматоидный артрит и хронический ревматизм, но также при лечении псориатического артрита и псориаза. Хроническое отторжение трансплантата после трансплантации органа характеризуется обструктивными очагами поражения кровеносных сосудов и бронхиол; на основании их гистологического исследования было сделано предположение, что так как активация T-клеток и макрофагов вызывает продукцию цитокинов и факторов роста и повреждение эндотелиальных клеток сосудов, а также основываясь на том, что рост гладких мышц сосудов служит причиной фиброза и т.п., состояние прогрессирует до обструкции сосудов (непатентные документы от 6 до 8).

Опубликовано, что OPN действует как важнейший белок для активации макрофагов и гладкомышечном сосудистом фиброзе (непатентный документ 9); ингибирующее OPN антитело может супрессировать процесс, приводящий к фиброзу, подавляя миграцию моноцитов и нейтрофилов. Таким образом, предполагают, что антитело супрессирует хроническое отторжение трансплантата после трансплантации органа, способствуя приживлению органов, и является эффективным при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как системное аутоиммунное заболевание, эритематоз, увеит, болезнь Бехчета, дерматомиозит, гломерулопролиферативный нефрит и саркоидоз. Также подтверждено, что уровень экспрессии OPN возрастает при различных злокачественных опухолях и, что OPN способствует развитию злокачественных опухолей и метастазированию (непатентные документы от 10 до 12) и, что рост и метастазирование злокачественных клеток супрессируется антителом против OPN (патентный документ 3, непатентный документ 13). Таким образом, полагают, что антитело против OPN также может быть эффективно при лечении различных злокачественных опухолей.

В WO 03/027151 (патентный документ 2) описано химерное антитело против остеопонтина человека, содержащее вариабельную область антитела 2K1 мыши против остеопонтина человека, описанного в патентном документе 1, и константную область антитела человека; и гуманизированное антитело против остеопонтина человека, содержащее определяющую комплементарность область антитела 2K1 и каркасную область и константную область антитела человека.

Тем временем, на рынке доступно большое число моноклональных антител для лечения, включая антитела для лечения злокачественных опухолей (например, ритуксимаб, трастузумаб, бевацизумаб), антител для лечения ревматизма (например, инфликсимаб, адалимумаб), антител для супрессии отторжения трансплантата (например, муромонаб, базиликсимаб) и т.п.

Благодаря их основным свойствам высокой специфичности и безопасности полагают, что изучение и разработка препаратов моноклональных антител, в частности, предназначенных для широкого спектра заболеваний, для которых затруднено создание низкомолекулярных терапевтических лекарственных средств, будет ускорено.

С другой стороны, наибольшей проблемой, стоящей при разработке таких фармацевтических средств на основе антител, является производство антител. Как правило, клинические дозы моноклональных антител, выпущенных на рынок, представляют собой величины порядка нескольких мг/кг, так что необходимы значительные производственные затраты.

По этой причине, выбор антитела, демонстрирующего очень высокую активность, из антител со сходной активностью, антитела с высоким уровнем экспрессии и высокой стабильностью, является крайне важным требованием для фактического применения в качестве фармацевтического средства на основе антитела.

Патентный документ 1: Техническая инструкция для международной патентной публикации No. WO 02/081522.

Патентный документ 2: Техническая инструкция для международной патентной публикации No. WO 03/027151.

Патентный документ 3: Техническая инструкция для международной патентной публикации No. WO 06/043954.

Непатентный документ 1: Y. Saitoh et al., (1995): Laboratory Investigation, 72, 55-63.

Непатентный документ 2: Y. Yokosaki et al., (1999): The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334.

Непатентный документ 3: P.M. Green et al., (2001): FEBS Letters 503, 75-79.

Непатентный документ 4: S.T. Barry et al., (2000): Experimental Cell Research 258, 342-351.

Непатентный документ 5: Yamamoto et al., (2003): The Journal of Clinical Investigation, 112, 181-188.

Непатентный документ 6: P. Freese et al., (2001): Nephrology, dialysis, transplantation, 16, 2401-2406.

Непатентный документ 7: J.R. Waller et al., (2001): British Journal of Surgery, 88, 1429-1441.

Непатентный документ 8: S.R. Lehtonen et al., (2001): Transplantation, 72, 1138-1144.

Непатентный документ 9: A. O'Regan et al., (2000): International Journal of Experimental Pathology, 81, 373-390.

Непатентный документ 10: G. F. Weber, (2001): Biochimica et Biophysica Acta, 1552, 61-85.

Непатентный документ 11: H. Rangaswami et al., (2006): TRENDS in Cell Biology 16, 79-87.

Непатентный документ 12: S.S. Forootan et al., (2006): Int. J. Cancer: 118, 2255-2261.

Непатентный документ 13: Z. Hu et al., (2005): Clin. Cancer Res. 11 4646-4652.

Описание изобретения

Задачи, решаемые изобретением

Настоящее изобретение было создано с учетом описанных выше обстоятельств, и относится к гуманизированному антителу против остеопонтина человека с улучшенной активностью (антигенсвязывающая активность, ингибирующая миграцию лейкоцитов активность и т.п.) и/или стабильностью (устойчивость к действию тепла, условиям с низким pH, денатурирующим средствам и т.п.), по сравнению с активностью и стабильностью стандартных антител против остеопонтина человека. Авторы настоящего изобретения провели глубокие исследования с целью усовершенствования объекта и им удалось создать гуманизированное антитело против остеопонтина человека с такими характеристиками.

Способы решения проблем

Таким образом, объектами настоящего изобретения являются:

(1) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3.

(2) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, описанное в (1) выше, где константная область тяжелой цепи антитела представляет собой Igγ1 человека.

(3) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, описанное в (1) выше, где константная область легкой цепи антитела представляет собой Igκ человека.

(4) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, описанное в (1) выше, где константная область тяжелой цепи антитела представляет собой Igγ1 человека, а константная область легкой цепи антитела представляет собой Igκ человека.

(5) Гуманизированное антитело против остеопонтина человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:25, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27.

(6) Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанного выше в (1).

(7) Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанного выше в (1).

(8) Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, описанный выше в (6) и/или (7).

(9) Клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор, описанный выше в (8).

(10) Способ получения гуманизированного антитела против остеопонтина человека, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, описанную выше в (9), позволяющей клетке экспрессировать гуманизированное антитело против остеопонтина человека.

(11) Терапевтическое лекарственное средство для аутоиммунного заболеваниия, ревматизма, ревматоидного артрита или остеоартрита, содержащее гуманизированное антитело против остеопонтина человека, описанное выше в любом из пунктов с (1) по (5).

(12) Способ профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, ревматизма, ревматоидного артрита или остеоартрита, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанного выше в любом из пунктов с (1) по (5).

(13) Применение гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанного выше в любом из пунктов с (1) по (5), для получения фармацевтического средства для профилактики или лечения аутоиммунного заболевания, ревматизма, ревматоидного артрита или остеоартрита.

Результат изобретения

Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против остеопонтина человека, обладающего улучшенными видами активности (антигенсвязывающая активность, ингибирующая миграцию лейкоцитов активность и т.п.) и/или стабильностью (устойчивость к действию тепла, условиям с низким pH, денатурирующим средствам и т.п.) по сравнению с активностью и стабильностью стандартных антител против остеопонтина человека. Обладая этими свойствами, антитело по настоящему изобретению является подходящим для профилактики или лечения различных воспалительных заболеваний, включающих аутоиммунное заболевание, ревматизм, ревматоидный артрит и остеоартрит.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность (верхний ряд: SEQ ID NO:15) и аминокислотная последовательность (нижний ряд: SEQ ID NO:16) соответствующая ДНК, содержащей кодирующую область R2K1-VH1.7, встроенную в вектор (подчеркнутый участок представляет собой лидерную последовательность для секреторной экспрессии).

На фиг.2 представлена нуклеотидная последовательность (верхний ряд: SEQ ID NO:17) и аминокислотная последовательность (нижний ряд: SEQ ID NO:18) соответствующая ДНК, содержащей кодирующую область R2K1-VH1.8, встроенную в вектор (подчеркнутый участок представляет собой лидерную последовательность для секреторной экспрессии).

На фиг.3 представлена нуклеотидная последовательность (верхний ряд: SEQ ID NO:19) и аминокислотная последовательность (нижний ряд: SEQ ID NO:20) соответствующая ДНК, содержащей кодирующую область R2K1-VL1.7, встроенную в вектор (подчеркнутый участок представляет собой лидерную последовательность для секреторной экспрессии).

На фиг.4 представлена нуклеотидная последовательность (верхний ряд: SEQ ID NO:21) и аминокислотная последовательность (нижний ряд: SEQ ID NO:22) соответствующая ДНК, содержащей кодирующую область R2K1-VL1.8, встроенную в вектор (подчеркнутый участок представляет собой лидерную последовательность для секреторной экспрессии).

На фиг.5 представлены результаты анализа связывания химерного антитела 2K1 и гуманизированного антитела 2K1 с пептидом hOPN5 способом ELISA.

На фиг.6 представлены результаты анализа связывания химерного 2K1 антитела и гуманизированного 2K1 антитела, подвергнутых термообработке при 70°C, с пептидом hOPN5 способом ELISA. Соотношение к способности связывания без термической обработки взято за 100%.

На фиг.7 представлены результаты анализа связывания химерного 2K1 антитела и гуманизированного 2K1 антитела, обработанных буфером при pH 5, с пептидом hOPN5 способом ELISA. Соотношение к способности связывания без обработки буфером при pH 5 взято за 100%.

На фиг.8 представлены данные диаграммы спектральных пиковых длин волн флуоресценции химерного 2K1 антитела и гуманизированного 2K1 антитела, обработанных буфером, содержащим разные концентрации гуанидин гидрохлорида.

На фиг.9 представлены результаты измерения содержания случайных структур в химерном 2K1 антителе и гуманизированном 2K1 антителе, обработанных буфером с разными уровнями pH, посредством CD.

Фиг.10 представляет собой иллюстрацию, представляющую результаты анализа термостойкости химерного антитела 2K1 и гуманизированного антитела 2K1 с использованием сверхчувствительного дифференциального сканирующего калориметра. Пунктирная стрелка и сплошная стрелка обозначают Tm химерного антитела 2K1 и антитела R2K1v1.7, соответственно.

На фиг.11 представлено ингибирующее клеточную адгезию действие R2K1v1.7 и R2K1v0 на OPN человека.

На фиг.12 представлено воздействие R2K1v1.7 на опухание суставов при индуцированном коллагеном артрите у обезьяны. Данные представлены в виде среднего ± SE для 8 животных, 7 животных и 5 животных в контрольной группе, группы с дозированием 25 мг/кг и группы с дозированием 50 мг/кг, соответственно. *p<0,05, **p<0,01: достоверно отличаются от контрольной группы, что определено с помощью критерия множественного сравнения Даннета.

На фиг.13 представлены результаты анализа очищенного ВЭЖХ R2K1v1.7-scFv.

На фиг.14 представлены результаты анализа связывания очищенного R2K1v1.7-scFv с пептидом hOPN5 способом ELISA.

На фиг.15 представлены результаты электрофореза полноразмерной молекулы антитела типа R2K1v1.7 и F(ab')₂ и очищенного F(ab')₂-ПЭГ антитела R2K1v1.7 в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

На фиг.16 представлены результаты анализа способности связывания F(ab')₂-PEG R2K1v1.7 с пептидом hOPN5 посредством BIAcore.

Наилучший способ осуществления изобретения

Ниже подробно описано настоящее изобретение.

Авторы настоящего изобретения провели глубокие исследования для решения описанных выше проблем, относительно стандартных антител против остеопонтина человека, и им удалось создать гуманизированное антитело против остеопонтина человека, обладающего улучшенными видами активности и/или стабильностью, чем активность и стабильность химерного антитела 2K1 и гуманизированного антитела 2K1, описанных в WO 03/027151 (патентный документ 2).

Основная структура молекулы антитела общая у всех классов и состоит из тяжелой цепи, имеющей молекулярную массу от 50000 до 70000, и легкой цепи, имеющей молекулярную массу от 20000 до 30000. Тяжелая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 440 аминокислот; тяжелые цепи обладают структурными характеристиками разных классов и называются γ, µ, α, δ и ε цепи, соответствующие IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Кроме того, IgG встречается как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и соответствующие цепи называются γ1, γ2, γ3 и γ4, соответственно. Легкая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 220 аминокислот; известны два типа, тип L и тип K и называются цепи λ и κ, соответственно. Что касается пептидной конфигурации основной структуры молекулы антитела, две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи связаны дисульфидной связью (S-S связь) и нековалентными связями, а молекулярная масса составляет от 150000 до 190000. Два вида легких цепей способны образовывать пары с любой тяжелой цепью. Каждая молекула антитела всегда состоит из двух одинаковых легких цепей и двух одинаковых тяжелых цепей.

В тяжелой цепи находятся четыре (пять для µ и ε цепей), а в легкой две, внутримолекулярные S-S связи; одна петля образована аминокислотными остатками в количестве от 100 до 110, и эта стерическая структура одинакова для всех петель и называется структурной единицей или доменом. Аминокислотная последовательность домена для обеих тяжелых цепей и легких цепей, расположенная на их N-концах, является непостоянной, даже в стандартном образце одного и того же класса (подкласса) у животных одного вида, и этот домен называется вариабельной областью (V-область, вариабельная область) (домены обозначают как V_H и V_L, соответственно). Аминокислотная последовательность на ее C-конце в каждом классе или подклассе практически постоянна и называется константной областью (C-область, константная область) (домены обозначают как C_H1, C_H2, C_H3 и C_L, соответственно).

Антигенраспознающий участок антитела состоит из V_H и V_L, а специфичность связывания зависит от аминокислотной последовательности этого участка. С другой стороны, такие виды биологической активности, как связывание с компонентами комплемента или различными клетками отражает различия в структуре С-области среди различных классов Ig. Выявлено, что вариабельность вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи практически ограничена тремя небольшими гипервариабельными областями, имеющимися у обеих цепей, и эти области называются CDR (определяющая комплементарность область). Оставшаяся часть вариабельной области называется каркасной областью и является относительно постоянной. Как правило, антигенсвязывающий участок образуют только 5-10 аминокислот или в определяющей комплементарность области каждой из вариабельных областей.

В настоящем описании антитело с вариабельной областью, полученной из антитела мыши (также обозначаемое как гетерологичное донорное антитело) в качестве реагирующей с антигеном вариабельной области, и константной областью, полученной из антитела человека в качестве константной области, обозначают как химерное антитело; химерное антитело, которое распознает остеопонтин и его фрагменты, обозначают как химерное антитело против остеопонтина. Рекомбинантное антитело, полученное заменой всех областей, за исключением определяющей комплементарность области (антигенсвязывающий участок) антигенспецифичной молекулы антитела млекопитающего, не являющегося человеком (например, мыши) обозначают как гуманизированное антитело. Включенными в гуманизированные антитела являются антитела с аминокислотными модификациями (замена, инсерция, делеция, добавление), сделанными в его каркасной области, подобно антителу настоящего изобретения.

В основном, известно, что при получении гуманизированного антитела, когда аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области только прививают на матрицу каркаса антитела человека, во многих случаях антигенсвязывающая активность снижается по сравнению с антигенсвязывающей активностью исходного антитела мыши. Подтверждено, что описанное выше гуманизированное антитело 2K1 обладает крайне низкой ингибирующей клеточную адгезию OPN активностью и, в результате чего, таким образом, не подходит для использования в качестве фармацевтического средства на основе антитела, несмотря на то, что оно связывается с пептидами OPN (пример 9 ниже).

Авторы настоящего изобретения провели глубокие исследования в отношении уменьшения снижения активности в гуманизированных антителах и получения гуманизированного антитела с улучшенной стабильностью, которое можно использовать в качестве фармацевтического средства на основе антитела, и установили, что гуманизированное антитело человека против остеопонтина, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, обладало значительно улучшенной активностью и/или улучшенной стабильностью с точки зрения различных индексов стабильности, по сравнению со стандартными химерными и гуманизированными антителами против остеопонтина человека. По существу, гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению получали посредством внесения модификаций по некоторым аминокислотам в каркасных областях тяжелой цепи и легкой цепи матрицы антитела человека, и содержит последовательность каркасной области отличную от последовательности стандартного гуманизированного антитела против остеопонтина человека, полученного только посредством включения определяющей комплементарность области (патентный документ 2).

Специалисты в данной области могут легко получить гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению на основании приведенной в настоящем документе информации о последовательности его вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи с использованием общеизвестного в данной области способа. В частности, получают генный фрагмент вариабельной области тяжелой цепи с последовательностью оснований, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению (SEQ ID NO:1), и генный фрагмент вариабельной области легкой цепи с последовательностью оснований, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела по настоящему изобретению (SEQ ID NO:3). Затем для получения гена гуманизированного антитела, гены вариабельной области соединяют с геном константной области соответствующего класса антитела человека. После этого, этот ген гуманизированного антитела встраивают в подходящий экспрессирующий вектор и вводят в культивируемую клетку. В заключение, культивируемую клетку культивируют, в результате чего гуманизированное антитело можно выделить из супернатанта культуры.

Каждый из описанных выше генных фрагментов вариабельной области, который кодирует аминокислоты вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи по настоящему изобретению антитела (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3), может быть получен, например, получая генный фрагмент, который кодирует вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, соответственно, гуманизированного антитела 2K1, описанного в WO 03/027151, описанным в документе способом, и индуцируя мутации в указанном участке генного фрагмента, который кодирует каркасную область гуманизированного антитела 2K1. Для индукции мутации в указанном участке в каркасной области, специалисты в данной области могут использовать разные очевидные способы, такие как сайт-специфический мутагенез (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 8.1-8.5). Альтернативно, генные фрагменты вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи антитела по настоящему изобретению также можно синтезировать на основе последовательностей оснований, сконструированных на основе аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3), или на основе последовательностей оснований вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела по настоящему изобретению, представленных в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:7, общеизвестным в данной области способом генного синтеза. В качестве способа генного синтеза антитела можно использовать различные способы, известные специалистам в данной области, такие как способы генного синтеза антител, описанные в WO 90/07861.

Затем для получения гена гуманизированного антитела соединяют описанные выше генные фрагменты вариабельной области и ген константной области антитела человека. Хотя, в качестве константной области используемого антитела человека можно выбрать любой подкласс константной области, предпочтительно, в качестве константной области тяжелой цепи можно использовать Igγ1 человека, а в качестве константной области легкой цепи можно использовать Igκ человека.

После получения данного гена гуманизированного антитела можно проводить встраивание гена гуманизированного антитела в экспрессирующий вектор, введение экспрессирующего вектора в культивируемые клетки, культивирование культивируемых клеток, очистку антитела и т.п. различными общеизвестными в данной области способами или со ссылкой на способы получения химерного антитела против остеопонтина человека или гуманизированного антитела против остеопонтина человека, описанные в WO 02/081522 или WO 03/027151. В качестве экспрессирующего вектора для встраивания полученного таким образом гена гуманизированного антитела можно использовать экспрессирующие векторы, описанные в International Patent Publication Official Gazette WO94/20632, такие как AG-γ1 и AG-κ, но экспрессирующий вектор не является ограничением, при условии, что он способен экспрессировать ген гуманизированного антитела. Предпочтительно использовать экспрессирующий вектор, который уже обладает геном константной области Ig человека, такой как AG-γ1 или AG-κ, так как он может стать экспрессирующим ген гуманизированного антитела вектором только при встраивании в него гена вариабельной области гуманизированного антитела.

Описанный выше экспрессирующий вектор вводят в культивируемые клетки, например, способом с использованием фосфата кальция и т.п.

В качестве примеров культивируемых клеток, в которые вводят экспрессирующий вектор, можно использовать такие культивируемые клетки, как клетки CHO-DG44, и их можно культивировать стандартным способом.

После описанного выше культивирования, антитело, накопленное в супернатанте культуры, можно очистить, например, различными способами хроматографии с использованием колонок с белком A.

Антигенную активность полученного таким образом гуманизированного антитела против остеопонтина человека, можно измерить, например, посредством ELISA, используя пептид OPN и т.п., как описано в примере ниже, BIACore (BIAcore Company) и т.п. Ингибирующую миграцию лейкоцитов активность гуманизированного антитела против остеопонтина человека можно измерить, например, культивируя моноциты периферической крови человека в присутствии тестируемого антитела и OPN или отщепляемого тромбином типа OPN, как описано в примере ниже. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению обладает биологической активностью ингибирования активированной цитокином (например, TNF-α) миграции моноцитов периферической крови человека в направлении отщепляемого тромбином типа OPN.

Затем полученное таким образом гуманизированное антитело против остеопонтина человека тестируют в отношении различных индексов стабильности. Гуманизированное антитело против остеопонтина человека по настоящему изобретению демонстрирует следующие индексы стабильности (от A) до D)):

A) Демонстрирует термостабильность, где активность связывания с пептидом, содержащим последовательность SVVYGLR (SEQ ID NO:10), после термической обработки в PBS при 70°C в течение 2 часов, составляет не менее чем 90% от активности связывания без термической обработки.

B) Средняя температура перехода (Tm) по меньшей мере на 5°C выше, чем средняя температура перехода химерного антитела с вариабельной областью, полученной из донорного гетерологичного антитела, и константной областью, полученной из антитела человека.

C) Обладает устойчивостью к гуанидин гидрохлориду при концентрациях, выше, по меньшей мере на 0,5 M, чем концентрации для химерного антитела с вариабельной областью, полученной из донорного гогетерологичного антитела, и константной областью, полученной из антитела человека.

D) Обладает устойчивостью к уровням pH, по меньшей мере на 0,3 меньше чем уровни pH для химерного антитела с вариабельной областью, полученной от донорного гетерологичного антитела, и константной областью, полученной от антитела человека.

В данном случае описанные выше индексы A) и B) являются индексами устойчивости к нагреванию; если у антитела улучшены показатели этих индексов, это более важно с точки зрения стабильности при долговременном хранении и лекарственной формы. То есть с препаратом антитела часто возникают трудности в отношении стабильности при хранении, так как он является белком, поэтому иногда его получают путем получения лиофилизата (это является трудным с точки зрения применимости в условиях медицинской практики, так как во время использования он должен быть растворен; в частности, препарату белка для растворения часто требуется более 30 секунд, что, в свою очередь, в условиях медицинской практики часто является затруднительным); однако любое антитело с хорошей устойчивостью к нагреванию можно хранить даже в растворе, обеспечивая долговременную стабильность при замораживании в течение 2 или более лет. Фактически, R2K1v1.7, гуманизированному антителу против остеопонтина человека по настоящему изобретению, описанному в примере ниже, обеспечена стабильность даже при комнатной температуре (25°C) в течение приблизительно 1 года. Если возможно получение раствора, то это делает возможным получение более подходящих препаратов в виде предварительно наполненных шприцев и т.п. Антитело с высокой устойчивостью к нагреванию, которое удовлетворяет описанным выше индексам, предполагает более широкую вариативность в получении препарата и делает возможным создание препаратов, удовлетворяющих более значимым терапевтическим потребностям, и увеличивает возможность выбора.

Описанный выше индекс C) представляет собой индекс устойчивости к действию солей; антитело с такой устойчивостью к действию солей позволяет провести исследование более предпочтительной формулы для создания фармацевтического препарата. В частности, этот индекс пригоден для предварительно наполненных шприцев, так как высокие концентрации солей часто используют при получении препарата белкового вещества с высокой концентрацией, такой как от 100 до 200 мкг/мл.

Описанный выше индекс D) представляет собой индекс, имеющий отношение к устойчивости антитела к pH; антитело с такой устойчивостью к pH позволяет проводить лечение при более низких уровнях pH на стадии вирусной