Молекулы антител с улучшенными свойствами

Молекулы антител с улучшенными свойствами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело против рецептора IL-6, используемое в качестве активного ингредиента, а также к способам получения указанных композиций и т.п.

Предшествующий уровень техники

Антитела представляют особый интерес как фармацевтические средства, поскольку они обладают высокой стабильностью в плазме и не вызывают значительных побочных эффектов. К таким антителам относится ряд коммерчески доступных фармацевтически приемлемых антител типа IgG и многие фармацевтически приемлемые антитела, которые в настоящее время находятся на стадии испытаний (непатентные документы 1 и 2). IL-6 представляет собой цитокин, вызывающий различные аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, злокачественные опухоли и т.п. (непатентный документ 3). Тоцилизумаб (TOCILIZUMAB), то есть гуманизированное антитело IgG1 против рецептора IL-6, специфически связывается с рецептором IL-6. Считается, что тоцилизумаб может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения IL-6-ассоциированных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, поскольку это антитело нейтрализует биологическую активность IL-6 (патентные документы 1-3 и непатентный документ 4). В Японии тоцилизумаб был разрешен к применению в качестве терапевтического средства для лечения болезни Каслмана и ревматоидного артрита (непатентный документ 5).

Гуманизированные антитела, такие как тоцилизумаб, представляют собой фармацевтически приемлемые антитела первого поколения. Фармацевтически приемлемые антитела второго поколения в настоящее время находятся на стадии исследований, проводимых в целях улучшения эффективности и удобства применения, а также снижения стоимости фармацевтически приемлемых антител первого поколения. В настоящее время разрабатываются различные технологии, которые могут быть применены для получения фармацевтически приемлемых антител второго поколения. Имеются описания методов усиления эффекторной функции, повышения способности связываться с антигеном, улучшения фармакокинетических свойств и повышения стабильности этих антител, а также методов снижения риска развития иммуногенности. Как сообщалось, такими методами повышения эффективности лекарственного средства или снижения дозы являются методы повышения антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксической активности (ADCC-активности) или комплемент-зависимой цитотоксической активности (CDC-активности), проводимые посредством аминокислотной замены в Fc-области антитела IgG (непатентный документ 6). Сообщалось также, что методом повышения антигенсвязывающей способности или антиген-нейтрализующей способности является аффинное созревание (непатентный документ 7). Такая технология позволяет усиливать антигенсвязывающую активность путем введения аминокислотных мутаций в гипервариабельную область (комплементарность-определяющую область (CDR)) вариабельной области или т.п. Повышение антигенсвязывающей способности приводит к усилению биологической активности in vitro или позволяет снижать вводимую дозу, а также приводит к повышению эффективности in vivo (непатентный документ 8). В настоящее время проводятся клинические испытания для характеризации антитела мотавизумаба (Motavizumab) (полученного посредством созревания аффинности), которое, как предполагается, обладает гораздо большей эффективностью, чем паливизумаб (Palivizumab), то есть фармацевтически приемлемое анти-RSV антитело первого поколения (непатентный документ 9). В литературе также описано антитело против рецептора IL-6 с аффинностью приблизительно 0,05 нМ (то есть с аффинностью, превышающей аффинность тоцилизумаба) (патентный документ 4). Однако в литературе отсутствуют какие-либо данные о человеческих, гуманизированных или химерных антителах, аффинность которых превышает 0,05 нМ.

Проблемой, с которой в настоящее время сталкиваются специалисты при получении фармацевтически приемлемых антител, являются высокая стоимость их производства, связанная с введением очень больших количеств белка. Так, например, доза тоцилизумаба, а именно гуманизированного антитела IgG1 против рецептора IL-6, для внутривенной инъекции составляет приблизительно 8 мг/кг/месяц (непатентный документ 4). Для лечения хронических аутоиммунных заболеваний предпочтительной формой введения препарата является подкожное введение. В общих чертах, необходимо, чтобы препараты для подкожного введения имели высокую концентрацию. С точки зрения стабильности или т.п. предельная доза для антитела типа IgG обычно составляет примерно 100 мкг/мл (непатентный документ 10). Недорогостоящие и удобные для применения фармацевтические препараты на основе антител второго поколения, которые могут быть введены подкожно в течение более длительных промежутков времени, могут быть получены путем увеличения времени полужизни антитела в плазме в целях пролонгирования его терапевтического эффекта и тем самым снижения количества вводимого белка, а также путем сообщения данному антителу высокой стабильности.

FcRn тесно связан с фармакокинетикой антител. Что касается различий во времени полужизни антител изотипов IgG1 и IgG2 в плазме, то известно, что IgG1 и IgG2 имеют значительно более продолжительное время полужизни в плазме, чем IgG3 и IgG4 (непатентный документ 11). Как сообщалось, методом еще большего увеличения времени полужизни антител IgG3 и IgG4 в плазме, которые уже имеют достаточно продолжительное время полужизни в плазме, является замена аминокислот в константной области, приводящая к повышению уровня связывания с FcRn (непатентные документы 12 и 13). С точки зрения иммуногенности дальнейшее увеличение времени полужизни в плазме было достигнуто путем замены аминокислот предпочтительно в вариабельной, но не в константной области (патентный документ 5). Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо данные об увеличении времени полужизни антител против рецептора IL-6 в плазме, достигаемом посредством модификации вариабельной области.

Другой важной проблемой, с которой сталкиваются специалисты в области разработки биофармацевтических препаратов, является иммуногенность. В общих чертах, иммуногенность мышиных антител может быть снижена путем «гуманизации» антител. При этом предполагается, что при гуманизации антитела риск развития иммуногенности может быть дополнительно снижен путем использования каркасной последовательности зародышевой линии в качестве матрицы (непатентный документ 14). Однако даже адалимумаб (Adalimumab), то есть полностью человеческое анти-TNF антитело, обнаруживало высокий уровень (13%-17%) развития иммуногенности, и было установлено, что у пациентов, у которых наблюдалась иммуногенность, терапевтический эффект был низким (непатентные документы 15 и 16). Т-клеточные эпитопы могут присутствовать даже в CDR человеческих антител, и такие Т-клеточные эпитопы в CDR могут вызывать иммуногенность. Методы in silico и in vitro для предсказания Т-клеточных эпитопов описаны в литературе (непатентные документы 17 и 18). Предполагается, что риск развития иммуногенности может быть снижен путем удаления Т-клеточных эпитопов, предсказанных такими методами (непатентный документ 19).

Тоцилизумаб, то есть гуманизированное антитело против рецептора IL-6, представляет собой антитело IgG1, полученное путем гуманизации мышиного антитела PM1. Присоединение CDR осуществляют с использованием человеческих последовательностей NEW и REI в качестве каркасной матрицы для цепей H и L, соответственно; однако пять аминокислот мышиной последовательности в каркасной области были сохранены в качестве незаменимых аминокислот для поддержания активности (непатентный документ 20). В настоящее время отсутствуют какие-либо данные о полной гуманизации остальной мышиной последовательности в каркасной области гуманизированного антитела тоцилизумаба без снижения его активности. Кроме того, последовательностью CDR тоцилизумаба является мышиная последовательность, и такая последовательность, подобно адалимумабу, может иметь Т-клеточные эпитопы в CDR, которые могут вызывать риск развития иммуногенности. В клинических испытаниях тоцилизумаба антитела против тоцилизумаба не детектировались при эффективной дозе 8 мг/кг, но они наблюдались при дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг (патентный документ 6). Это позволяет предположить, что иммуногенность тоцилизумаба может быть еще больше снижена. Однако в литературе отсутствуют какие-либо данные о снижении риска развития иммуногенности тоцилизумаба при аминокислотной замене.

Изотипом тоцилизумаба являются IgG1. Различия в изотипах определяются различиями в последовательностях константной области. Поскольку предполагается, что последовательность константной области оказывает значительное влияние на эффекторную функцию, фармакокинетику, физические свойства антител и т.п., то выбор последовательности константной области имеет очень важное значение для разработки фармацевтических препаратов на основе антител (непатентный документ 11). В последние годы безопасность фармацевтических препаратов на основе антител приобретает первостепенное значение. Взаимодействие Fc-части антитела и Fcγ-рецептора (эффекторная функция) может вызывать серьезные побочные эффекты в клинических испытаниях TGN1412 фазы I (непатентный документ 21). Для получения фармацевтических препаратов на основе антител в целях нейтрализации биологической активности антигена, связывание с Fcγ-рецептором, которое играет важную роль в эффекторных функциях, таких ADCC, не является необходимым. Связывание с Fcγ-рецептором может даже оказаться нежелательным с точки зрения побочных эффектов. Способ снижения уровня связывания с Fcγ-рецептором применяется для изменения изотипа антитела IgG с IgG1 на IgG2 или IgG4 (непатентный документ 22). IgG2 является более предпочтительным, чем IgG4, с точки зрения фармакокинетики и связывания с Fcγ-рецептором I (непатентный документ 11). Тоцилизумаб представляет собой антитело, нейтрализующее рецептор IL-6, а его изотипом является IgG1. Таким образом, с точки зрения минимизации возможных побочных эффектов, IgG2 может оказаться предпочтительным изотипом, поскольку для его действия не требуется эффекторных функций, таких как ADCC.

Тем не менее, при разработке фармацевтических препаратов на основе антител, очень важное значение имеют физико-химические свойства белков, а в частности, их гомогенность и стабильность. Сообщалось, что изотип IgG2 обладает значительной гетерогенностью, что обусловлено наличием дисульфидных связей в его шарнирной области (непатентный документ 23). Трудоемкость и высокая стоимость крупномасштабного промышленного производства фармацевтических препаратов на основе таких антител с сохранением нужных веществ/родственных веществ связано с их гетерогенностью, обусловленной различием дисульфидных связей в различных продуктах. Таким образом, если это возможно, желательно использовать одно вещество. Кроме того, сообщалось, что гетерогенность С-концевых последовательностей H-цепи антитела обусловлена делецией С-концевого лизинового аминокислотного остатка и амидированием С-концевой карбоксильной группы в результате делеции двух С-концевых аминокислот, глицина и лизина (непатентный документ 24). При разработке антител изотипа IgG2 в качестве фармацевтических препаратов, предпочтительно снижать такую гетерогенность и сохранять высокую стабильность. Для получения удобных в употреблении стабильных препаратов, имеющих высокую концентрацию и предназначенных для подкожного введения, предпочтительно, чтобы такие препараты обладали не только высокой стабильностью, но также и имели время полужизни в плазме, превышающее время полужизни IgG1, который является изотипом тоцилизумаба. Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо данные о последовательностях константной области антител, имеющих константную область изотипа IgG2, имеющую пониженную гетерогенность, высокую стабильность и время полужизни в плазме, превышающее время полужизни антител с константной областью изотипа IgG1.

Предшествующие документы, относящиеся в настоящему изобретению, указаны ниже:

[Предшествующие документы]

[Патентные документы]

[Патентный документ 1] WO 92/19759

[Патентный документ 2] WO 96/11020

[Патентный документ 3] WO 96/12503

[Патентный документ 4] WO 2007/143168

[Патентный документ 5] WO 2007/114319

[Патентный документ 6] WO 2004/096273

[Непатентные документы]

[Непатентный документ 1] Janice M. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura B. Faden & Matthew C. Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology 23, 1073-1078 (2005).

[Непатентный документ 2] Pavlou A.K., Belsey M.J., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr; 59(3):389-96.

[Непатентный документ 3] Nishimoto N., Kishimoto T., Interleukin 6: from bench to bedside., Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov; 2(11):619-26.

[Непатентный документ 4] Maini R.N., Taylor P.C., Szechinski J., Pavelka K., Broll J., Balint G., Emery P., Raemen F., Petersen J., Smolen J., Thomson D., Kishimoto T.; CHARISMA Study Group., Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist, Tocilizumab, in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate., Arthritis Rheum. 2006 Sep; 54(9):2817-29.

[Непатентный документ 5] Nishimoto N., Kanakura Y., Aozasa K., Johkoh T., Nakamura M., Nakano S., Nakano N., Ikeda Y., Sasaki T., Nishioka K., Hara M., Taguchi H., Kimura Y., Kato Y., Asaoku H., Kumagai S., Kodama F., Nakahara H., Hagihara K., Yoshizaki K., Kishimoto T. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood. 2005 Oct 15; 106(8):2627-32.

[Непатентный документ 6] Kim S.J., Park Y., Hong H.J., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31; 20(1):17-29. Review.

[Непатентный документ 7] Rothe A., Hosse R.J., Power B.E. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. 2006 Feb; 6(2):177-87.

[Непатентный документ 8] Rajpal A., Beyaz N., Haber L., Cappuccilli G., Yee H., Bhatt R.R., Takeuchi T., Lerner R.A., Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14; 102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6.

[Непатентный документ 9] Wu H., Pfarr D.S., Johnson S., Brewah Y.A., Woods R.M., Patel N.K., White W.I., Young J.F., Kiener P.A. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665.

[Непатентный документ 10] Shire S.J., Shahrokh Z., Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004 Jun; 93(6):1390-402.

[Непатентный документ 11] Salfeld J.G. Isotype selection in antibody engineering.Nat Biotechnol. 2007 Dec; 25(12):1369-72.

[Непатентный документ 12] Hinton P.R., Xiong J.M., Johlfs М.G., Tang M.T., Keller S., Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1; 176(1):346-56.

[Непатентный документ 13] Ghetie V., Popov S., Borvak J., Radu C., Matesoi D., Medesan C., Ober R.J., Ward E.S., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul; 15(7):637-40.

[Непатентный документ 14] Hwang W.Y., Almagro J.C., Buss T.N., Tan P., Foote J. Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization. Methods. 2005 May; 36(1):35-42.

[Непатентный документ 15] Bartelds G.M., Wijbrandts C.A., Nurmohamed M.T., Stapel S., Lems W.F., Aarden L., Dijkmans B.A., Tak P., Wolbink G.J. Clinical response to adalimumab: The relationship with anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2007 Mar 9; [Epub ahead of print].

[Непатентный документ 16] Bender N.K., Heilig C.E., Droll B., Wohlgemuth J., Armbruster F.P., Heilig B. Immunogenicity, efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol Int. 2007 Jan; 27(3):269-74.

[Непатентный документ 17] Van Walle I., Gansemans Y., Parren P.W., Stas P., Lasters I. Immunogenicity screening in protein drug development. Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar; 7(3):405-18.

[Непатентный документ 18] Jones T.D., Phillips W.J., Smith B.J., Bamford C.A., Nayee P.D., Baglin T.P., Gaston J.S., Baker M.P. Identification and removal of a promiscuous CD4+ T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J Thromb Haemost. 2005 May; 3(5):991-1000.

[Непатентный документ 19] Chirino A.J., Ary M.L., Marshall S.A. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov Today. 2004 Jan 15; 9(2):82-90.

[Непатентный документ 20] Sato K., Tsuchiya M., Saldanha J., Koishihara Y., Ohsugi Y., Kishimoto T., Bendig M.M. Reshaping a human antibody to inhibit the interleukin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 1993 Feb 15; 53(4):851-6.

[Непатентный документ 21] Strand V., Kimberly R., Isaacs J.D. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan; 6(1):75-92.

[Непатентный документ 22] Gessner J.E., Heiken H., Tamm A., Schmidt R.E. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun; 76(6):231-48.

[Непатентный документ 23] Dillon T.M., Ricci M.S., Vezina C., Flynn G.C., Liu Y.D., Rehder D.S., Plant M., Henkle B., Li Y., Deechongkit S., Varnum B., Wypych J., Balland A., Bondarenko P.V. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J Biol Chem. 2008 Jun 6; 283(23):16206-15.

[Непатентный документ 24] Johnson K.A., Paisley-Flango K., Tangarone B.S., Porter T.J., Rouse J.C. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1; 360(1):75-83.

Описание изобретения

[Проблемы, которые могут быть решены с помощью настоящего изобретения]

Настоящее изобретение может быть осуществлено исходя из вышеуказанных фактов. Целью настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций, содержащих молекулы второго поколения, обладающие улучшенными свойствами по сравнению с гуманизированным антителом IgG1 против рецептора IL-6, а именно тоцилизумабом, путем модификации аминокислотных последовательностей вариабельных и константных областей тоцилизумаба в целях повышения его антиген-нейтрализующей способности и улучшения фармакокинетических свойств, с последующим достижением пролонгированного терапевтического эффекта с меньшей частотой введения указанных композиций, и снижением иммуногенности, повышением безопасности и улучшением физико-химических свойств (повышением стабильности и гомогенности) (такие фармацевтические композиции далее могут также называться «средствами» или «препаратами»). Другой целью настоящего изобретения является разработка способов продуцирования указанных фармацевтических композиций.

[Способы решения указанных проблем]

Авторами настоящего изобретения были проведены специальные исследования в целях получения молекул второго поколения, обладающих лучшими свойствами по сравнению с гуманизированным антителом IgG1 против рецептора IL-6, а именно, р тоцилизумабом первого поколения, путем модификации аминокислотных последовательностей вариабельной и константной областей тоцилизумаба для повышения его эффективности и улучшения фармакокинетических свойств в целях достижения пролонгированного терапевтического действия при меньшей частоте его введения, а также снижения иммуногенности, повышения его безопасности и улучшения его физико-химических свойств (повышения стабильности и гомогенности). В результате авторами настоящего изобретения было введено множество мутаций CDR в вариабельные области тоцилизумаба, улучшающих его способность связываться (аффинность) с антигеном. Таким образом, авторам настоящего изобретения удалось значительно повысить аффинность этого антитела с использованием комбинации таких мутаций. Авторам настоящего изобретения также удалось улучшить фармакокинетические свойства путем введения модификаций, снижающих величину изоэлектрической точки последовательности вариабельной области. Авторам настоящего изобретения также удалось улучшить фармакокинетические свойства путем обеспечения рН-зависимого связывания с антигеном рецептора IL-6, в результате чего одна молекула антитела может многократно нейтрализовать антиген. Кроме того, авторам настоящего изобретения удалось снизить риск развития иммуногенности путем полной гуманизации мышиных последовательностей, присутствующих в каркасной области тоцилизумаба, и снижения числа пептидов Т-клеточного эпитопа в вариабельных областях, предсказанных in silico. Кроме того, авторам настоящего изобретения также удалось выявить новые последовательности константной области для константной области тоцилизумаба, которые снижают уровень связывания с Fcγ-рецептором, повышают безопасность, улучшают фармакокинетические свойства по сравнению с последовательностями IgG1 и снижают гетерогенность, ассоциированную с дисульфидными связями в шарнирной области IgG2, а также снижают гетерогенность, ассоциированную с С-концом Н-цепи без снижения стабильности. Авторам настоящего изобретения удалось получить молекулы второго поколения, обладающие улучшенными свойствами по сравнению с тоцилизумабом, путем соответствующего объединения указанных модификаций аминокислотной последовательности в CDR, вариабельных областях и в константных областях.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат гуманизированное антитело IgG против рецептора IL-6, обладающее повышенной способностью связываться с антигеном (рецептором IL-6), улучшенными фармакокинетическими свойствами, повышенной безопасностью и улучшенными физическими свойствами (повышенной стабильностью и гомогенностью), а также имеют пониженный риск развития иммуногенности, где указанные фармацевтические композиции получают путем модификации аминокислотных последовательностей вариабельных и константных областей гуманизированного антитела IgG1 против рецептора IL-6, а именно тоцилизумаба; а также к способам получения указанных фармацевтических композиций. Более конкретно, настоящее изобретение относится:

[1] к любому полипептиду, выбранному из:

(a) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73);

(b) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73);

(c) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83);

(d) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(e) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3); и

(f) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5);

[2] к любому антителу, выбранному из:

(a) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(b) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3); и

(c) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5);

[3] к любой вариабельной области, выбранной из:

(a) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 19 (вариабельной области VH4-M73);

(b) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 20 (вариабельной области VH3-M73);

(c) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 21 (вариабельной области VH5-M83);

(d) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 22 (вариабельной области VL1);

(e) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 23 (вариабельной области VL3); и

(f) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 24 (вариабельной области VL5);

[4] к любому антителу, выбранному из:

(a) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 19 (вариабельную область VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 22 (вариабельную область VL1);

(b) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 20 (вариабельную область VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 23 (вариабельную область VL3); и

(c) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 21 (вариабельную область VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 24 (вариабельную область VL5);

[5] к любой тяжелой цепи или легкой цепи, выбранной из:

(a) тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 25 (VH4-M73);

(b) тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 26 (VH3-M73);

(c) тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 27 (VH5-M83);

(d) легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 28 (VL1);

(e) легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 29 (VL3); и

(f) легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 30 (VL5);

[6] к любому антителу, выбранному из:

(a) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 25 (VH4-M73), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 28 (VL1);

(b) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 26 (VH3-M73), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 29 (VL3); и

(c) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 27 (VH5-M83), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 30 (VL5);

[7] к гену, кодирующему полипептид по любому из пунктов [1]-[6];

[8] к вектору, несущему ген по пункту [7];

[9] к клетке-хозяину, несущей вектор по пункту [8];

[10] к способу продуцирования полипептида по любому из пунктов [1] - [6] путем культивирования клетки-хозяина по пункту [9]; и

[11] к фармацевтической композиции, содержащей полипептид по любому из пунктов [1]-[6] или полипептид, полученный способом по пункту [10].

[Осуществление настоящего изобретения]

Гуманизированные антитела IgG против рецептора IL-6, полученные способами согласно изобретению, обладают повышенной эффективностью и улучшенными фармакокинетическими свойствами, а поэтому они обладают пролонгированным терапевтическим действием при меньшей частоте введения.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 представлен список сайтов мутаций, повышающих аффинность тоцилизумаба к рецептору IL-6. Последовательность HCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 81; последовательность HCDR2, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 82; последовательность HCDR2, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 83; последовательность HCDR3 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 84; последовательность HCDR3, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 85; последовательность HCDR3, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 86; последовательность LCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 87; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 88; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 89; последовательность LCDR3 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 90; последовательность LCDR3, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 91; и последовательность LCDR3, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 92.

На фиг.2 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба и RDC-23 в BaF/gp130.

На фиг.3 представлен список сайтов мутаций, которые могут снижать величину изоэлектрической точки вариабельной области без значительного снижения уровня связывания тоцилизумаба с рецепторм IL-6. Звездочки у сайтов мутаций означают сайт, который не оказывает влияния на величину изоэлектрической точки, но который был мутирован для превращения этой последовательности в человеческую последовательность. Последовательность HFR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 93; последовательность HFR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 94; последовательность HCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 95; последовательность HCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 96; последовательность HFR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 97; последовательность HFR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 98; последовательность HCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 81; последовательность HCDR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 99; последовательность HFR4 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 100; последовательность HFR4, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 101; последовательность LFR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 102; последовательность LFR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 103; последовательность LCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 87; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 104; последовательность LFR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 105; последовательность LFR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 106; последовательность LCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 107; последовательности LCDR2, полученные после введения мутации, представлены в SEQ ID NO: 108 и 109; последовательность LFR3 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 110; последовательность LFR3, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 111; последовательность LFR4 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 112, а последовательность LFR4, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 113.

На фиг. 4 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба и H53/L28 в BaF/gp130.

На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий концентрацию тоцилизумаба и H53/L28 в плазме мышей в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 6 представлен график, иллюстрирующий концентрацию тоцилизумаба и H53/L28 в плазме мышей в зависимости от времени после подкожного введения.

На фиг. 7 схематически показано, что молекула IgG может снова связываться с другим антигеном в результате диссоциации из антигена мембранного типа в эндосоме.

На фиг. 8 представлен список сайтов мутаций, которые могут сообщать тоцилизумабу способность к рН-зависимому связыванию с рецептором IL-6 (связывание при pH 7,4 и диссоциация при pH 5,8). Последовательность HFR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 93; последовательность HFR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 114; последовательность HCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 95; последовательность HCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 115; последовательность LCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 87; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 116; последовательность LCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 107, а последовательность LCDR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 117.

На фиг. 9 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба и H3pI/L73 в BaF/gp130.

На фиг. 10 представлен график, иллюстрирующий концентрацию тоцилизумаба и H3pI/L73 в плазме собакоподобных обезьян в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 11 представлен график, иллюстрирующий концентрацию тоцилизумаба и H3pI/L73 в плазме мышей, трансгенных по человеческому рецептору IL-6, в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 12 представлена диаграмма, иллюстрирующая результаты анализа C-концевой гетерогенности тоцилизумаба (TOCILIZUMAB), TOCILIZUMABΔK и TOCILIZUMABΔGK, проводимого с помощью катионообменной хроматографии.

На фиг. 13 представлена диаграмма, иллюстрирующая результаты анализа ассоциированной с дисульфидной связью гетерогенности тоцилизумаба-IgG1, тоцилизумаба-IgG2 и тоцилизумаба-SKSC, проводимого с помощью катионообменной хроматографии.

На фиг. 14 представлена диаграмма, иллюстрирующая кривые денатурации для тоцилизумаба-IgG1, тоцилизумаба-IgG2 и тоцилизумаба-SKSC, полученные с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), и величину Tm для каждого Fab-домена.

На фиг. 15 представлен график, иллюстрирующий концентрации тоцилизумаба-IgG1, тоцилизумаба-M44, тоцилизумаба-M58 и тоцилизумаба-M73 в плазме у мышей, трансгенных по человеческому FcRn, в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 16 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба, контроля и Fv5-M83 в BaF/gp130.

На фиг. 17 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба, Fv3-M73 и Fv4-M73 в BaF/gp130.

На фиг. 18 представлен график, иллюстрирующий концентрации тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 у собакоподобных обезьян в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 19 представлен график, иллюстрирующий концентрацию CRP для тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73 или Fv5-M83 у собакоподобных обезьян в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 20 представлен график, иллюстрирующий процент свободного растворимого рецептора IL-6 у собакоподобных обезьян в зависимости от времени после внутривенного введения тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73 или Fv5-M83.

На фиг. 21 представлен график, иллюстрирующий ингибирующее действие тоцилизумаба и Fv4-M73 на продуцирование МСР-1 из синовиальных клеток человека, страдающего ревматоидным артритом (РА).

На фиг. 22 представлен график, иллюстрирующий ингибирующее действие тоцилизумаба и Fv4-M73 на продуцирование VEGF из синовиальных клеток человека, страдающего ревматоидным артритом (РА).

Способ осуществления настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к нижеуказанным полипептидам (a)-(f):

(a) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73);

(b) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73);

(c) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83);

(d) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(e) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3); и

(f) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5).

Полипептиды согласно изобретению не имеют конкретных ограничений, однако, предпочтительно, они представляют собой антигенсвязывающие молекулы, обладающие активностью, направленной на связывание с рецептором IL-6. Такими антигенсвязывающими молекулами являются, например, вариабельные области тяжелой цепи антитела (VH), вариабельные области легкой цепи антитела (VL), тяжелые цепи антитела, легкие цепи антитела и антитела.

Из указанных выше полипептидов (a)-(f) предпочтительными примерами вариабельных областей тяжелой цепи антитела являются полипептиды (a)-(c), а предпочтительными примерами вариабельных областей легкой цепи антитела являются полипептиды (d)-(f).

Такие вариабельные области могут быть использованы как часть антитела против человеческого рецептора IL-6. Антитела против человеческого рецептора IL-6, в которых используется такая вариабельная область, обладают повышенной связывающей активностью, превосходными фармакокинетическими свойствами, высокой степенью безопасности, пониженной иммуногенностью и/или улучшенными физико-химическими свойствами. В настоящем изобретении «превосходные фармакокинетические свойства» или «улучшенные фармакокинетические свойства» означают любое из таких свойств, как: снижение уровня «клиренса (CL)», увеличение «площади под кривой (AUC)», увеличение «среднего времени пребывания» и увеличение «времени полужизни в плазме (t_1/2)», где указанные свойства представляют собой фармакокинетические параметры, определяемые исходя из зависимости концентрации в плазме от времени при введении антитела в организм. В настоящем изобретении «превосходные физико-химические свойства» или «улучшенные физико-химические свойства» означ