Анализы и способы с применением биомаркеров

Анализы и способы с применением биомаркеров

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

По настоящей заявке по п.119(e) испрашивается приоритет предварительной заявки США номер 60/599425, поданной 6 августа 2004 г., полное содержание которой приведено здесь в качестве ссылки.

Область изобретения

Описанное здесь изобретение относится к способам и анализам для детекции биомаркеров, прогнозирующих чувствительность клеток млекопитающих к Apo2L/TRAIL и/или антителам - агонистам рецептора смерти.

Предпосылки изобретения

В данной области идентифицированы различные лиганды и рецепторы, принадлежащие к суперсемейству факторов некроза опухоли (TNF). Такие лиганды включают фактор некроза опухоли-альфа («TNF-альфа»), фактор некроза опухоли-бета («TNF-бета» или «лимфотоксин-альфа»), лимфотоксин-бета («LT-бета»), лиганд CD30, лиганд CD27, лиганд CD40, лиганд OX-40, лиганд 4-1BB, LIGHT, лиганд Apo-1 (обозначенный также как лиганд Fas или лиганд CD95), лиганд Apo-2 (обозначенный также как Apo2L или TRAIL), лиганд Apo-3 (обозначенный также как TWEAK), APRIL, лиганд OPG (обозначенный также как лиганд RANK, ODF или TRANCE) и TALL-1 (обозначенный также как BlyS, BAFF или THANK) (см., например, Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992); WO 97/01633, опубликованная 16 января 1997 г.; WO 97/25428, опубликованная 17 июля 1997 г.; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO 98/28426, опубликованная 2 июля 1998 г.; WO 98/46751, опубликованная 22 октября 1998; WO 98/18921, опубликованная 7 мая 1998 г.; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).

Индукция различных клеточных ответов, опосредованная такими лигандами семейства TNF, обычно инициирована их связыванием со специфическими клеточными рецепторами. Некоторые, но не все, лиганды семейства TNF связываются с «рецепторами смерти» на поверхности клетки и индуцируют через них различную биологическую активность для активации каспаз или ферментов, которые осуществляют гибель клеток или апоптотический путь (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)). Идентифицированные к настоящему времени члены суперсемейства рецептора TNF включают TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (обозначенный также как Apo-1 или CD95), DR4 (обозначенный также как TRAIL-R1), DR5 (обозначенный также как Apo-2 или TRAIL-R2), DcR1, DcR2, остеопротегерин (OPG), RANK и Apo-3 (обозначенный также как DR3 или TRAMP) (см., например, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, стр. 377-411; Locksley et al. Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417563, опубликованную 20 марта 1991 г.; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)).

Большинство из этих членов семейства рецепторов TNF разделяют обычную структуру рецепторов клеточной поверхности, включая внеклеточную, трансмембранную и внутриклеточную области, в то время как другие обнаружены в природе как растворимые белки с отсутствующим трансмембранным и внутриклеточным доменом. Внеклеточная часть типичных TNFR содержит повторяющийся образец аминокислотной последовательности множественных богатых цистеином доменов (CRD), начиная от N-конца.

Лиганд, обозначенный как Apo-2L или TRAIL, идентифицировали несколько лет назад как члена семейства цитокинов TNF (см., например, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; патент США 5763223, опубликованный 9 июня 1998 г.; патент США 6284236, опубликованный 4 сентября 2001 г.). Полноразмерная природная последовательность полипептида человека Apo2L/TRAIL представляет собой трансмембранный белок типа II длиной 281 аминокислот. Некоторые клетки могут продуцировать природную растворимую форму полипептида благодаря ферментативному отщеплению внеклеточной области полипептида (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Кристаллографическими исследованиями растворимых форм Apo2L/TRAIL выявили гомотримерную структуру, сходную со структурами TNF и других родственных белков (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Однако обнаружили, что, в отличие от других членов семейства TNF, Apo2L/TRAIL обладает тем уникальным структурным свойством, что три остатка цистеина (в положении 230 каждой субъединицы в гомотримере) вместе координируют атом цинка и что связывание цинка является важным для стабильности тримера и биологической активности (Hymowitz et al., выше, Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).

В литературе сообщалось, что Apo2L/TRAIL может играть роль в модуляции иммунной системы, включая аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит (см., например, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)).

Опубликовано также, что растворимые формы Apo2L/TRAIL индуцируют апоптоз в ряде раковых клеток, включая опухоли толстой кишки, легкого, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почки, яичника и мозга, так же как меланому, лейкоз и множественную миелому (см., например, Wiley et al., выше; Pitti et al., выше; патент США 6030945, опубликованный 29 февраля 2000 г.; патент США 6746668, опубликованный 8 июня 2004 г.; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Исследования in vivo на моделях опухолей у мышей позволяют далее предполагать, что Apo2L/TRAIL, отдельно или в сочетании с химиотерапией или радиотерапией, может оказывать существенные противоопухолевые эффекты (см., например, Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., выше; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); патентную заявку PCT US/00/15512; патентную заявку PCT US/0l/23691). В отличие от многих типов раковых клеток, большинство нормальных типов клеток человека, по-видимому, являются устойчивыми к индукции апоптоза конкретными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше). Jo et al. опубликовали, что меченная полигистидином растворимая форма Apo2L/TRAIL индуцирует апоптоз in vitro в нормальных выделенных гепатоцитах человека, в отличие от не относящихся к человеку (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); см. также Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Считают, что конкретные препараты рекомбинантных Apo2L/TRAIL могут различаться в отношении биохимических свойств и биологических активностей для клеток, пораженных заболеванием, в отличие от нормальных клеток, в зависимости, например, от присутствия или отсутствия молекулы метки, содержания цинка и % содержания тримера (см. Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).

Обнаружено, что Apo2L/TRAIL связывается по меньшей мере с пятью различными рецепторами. По меньшей мере два из рецепторов, связывающих Apo2L/TRAIL, содержат функциональный, цитоплазматический домен смерти. Один из таких рецепторов обозначен «DR4» (и альтернативно, как TR4 или TRAIL-R1) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); см. также WO 98/32856, опубликованную 30 июля 1998; WO 99/37684, опубликованную 29 июля 1999 г.; WO 00/73349, опубликованную 7 декабря 2000 г.; US 6433147, опубликованную 13 августа 2002 г.; US 6461823, опубликованную 8 октября 2002 г. и US 6342383, опубликованную 29 января 2002 г.).

Другой такой рецептор для Apo2L/TRAIL обозначен DR5 (его альтернативно обозначают также как Apo-2; TRAIL-R или TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER) (см., например, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), WO 98/51793, опубликованную 19 ноября 1998 г.; WO 98/41629, опубликованную 24 сентября 1998 г.; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986, опубликованную 20 августа 1998 г.; EP 870827, опубликованную 14 октября 1998 г.; WO 98/46643, опубликованную 22 октября 1998 г.; WO 99/02653, опубликованную 21 января 1999 г.; WO 99/09165, опубликованную 25 февраля 1999 г.; WO 99/11791, опубликованную 11 марта 1999 г.; US 2002/0072091, опубликованную 13 августа 2002 г.; US 2002/0098550, опубликованную 7 декабря 2001 г.; US 6313269, опубликованную 6 декабря 2001 г.; US 2001/0010924, опубликованную 2 августа 2001 г.; US 2003/01255540, опубликованную 3 июля 2003 г.; US 2002/0160446, опубликованную 31 октября 2002 г., US 2002/0048785, опубликованную 25 апреля 2002 г.; US 6342369, опубликованную в феврале 2002 г.; US 6569642, опубликованную 27 мая 2003 г., US 6072047, опубликованную 6 июня 2000 г., US 6642358, опубликованную 4 ноября 2003 г.; US 6743625, опубликованную 1 июня 2004 г.). Опубликовано, что, подобно DR4, DR5 содержит цитоплазматический домен смерти и способен подавать сигнал апоптоза при связывании лиганда (или при связывании молекулы, такой как антитело-агонист, которое мимикрирует активность лиганда). Кристаллическая структура комплекса, сформированного между Apo-2L/TRAIL и DR5, описана в Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

При связывании лиганда как DR4, так и DR5 могут независимо запускать апоптоз посредством привлечения и активации инициатора апоптоза, каспазы-8, через содержащую домен смерти адапторную молекулу, обозначенную FADD/Mort1 (Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)).

Опубликовано, что Apo2L/TRAIL также связывает такие рецепторы, обозначенные DcR1, DcR2 и OPG, которые, как полагают, функционируют как ингибиторы, а не передатчики сигнала (см., например, DCR1 (обозначенный также как TRID, LIT или TRAIL-R3) (Pan et al., Science, 276: 111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); и Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)); DCR2 (называемый также TRUNDD или TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)), OPG (Simonet et al., выше). В отличие от DR4 и DR5, рецепторы DcR1 и DcR2 не передают сигнал апоптоза.

Конкретные антитела, связывающие рецепторы DR4 и/или DR5, опубликованы в литературе. Например, анти-DR4 антитела, направленные против рецептора DR4 и обладающие агонистической или апоптической активностью в конкретных клетках млекопитающих, описаны, например, в WO 99/37684, опубликованной 29 июля 1999 г.; WO 00/73349, опубликованной 12 июля 2000 г.; WO 03/066661, опубликованной 14 августа 2003 г. См. также, например, Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); WO 02/097033, опубликованную 2 декабря 2002 г.; WO 03/042367, опубликованную 22 мая 2003; WO 03/038043, опубликованную 8 мая 2003 г.; WO 03/037913, опубликованную 8 мая 2003 г. Подобным образом были описаны конкретные анти-DR5 антитела, см., например, WO 98/51793, опубликованную 8 ноября 1998 г.; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada; WO 03/038043, опубликованную 8 мая 2003 г.; WO 03/037913, опубликованную 8 мая 2003 г. Кроме того, были описаны некоторые антитела, обладающие перекрестной реактивностью как к рецептору DR4, так и к рецептору DR5 (см., например, патент США 6252050, опубликованный 26 июня 2001 г.).

Неопластическая трансформация некоторых клеток млекопитающих в определенных случаях связана с характерными изменениями в экспрессии антигенов сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X. Относительно высокие количества сиалил-Льюис A/X присутствуют, например, в некоторых аденокарциномах толстой кишки, поджелудочной железы и желудка человека, и анализы с применением антител, направленных против углеводных структур данных антигенов, применяют в качестве средств для детекции злокачественных опухолей поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта (см., например, Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 49:2:303-311 (2002)). Уровень экспрессии данных углеводных маркеров опухоли коррелирует также с клиническим исходом, временем выживания пациента и признаками метастазирования.

Показано, что как сиалил-Льюис A, так и сиалил-Льюис X связываются с семейством углевод-связывающих белков, вовлеченных в экстравазацию клеток из кровотока, называемых селектинами. Некоторые сообщения позволяют предполагать, что сиалил-Льюис A и X являются лигандами для E-селектина и могут являться ответственными за адгезию клеток опухоли человека на эндотелии. Сиалированные структуры Льюиса, присутствующие на поверхности раковых клеток, несут углеводные цепи гликопротеинов и гликолипидов и связывают E-селектин, присутствующий на эндотелиальных клетках. Селектины и их углеводные лиганды соответственно могут играть важную роль в избирательном хоминге опухолевых клеток во время метастазирования.

Считают, что биосинтез сиалил-Льюис A и X зависит от конечного добавления фукозы из гуанозиндифосфат-фукозы (GDP- Fuc) в альфа (1,3) и альфа (1,4) связь сиалированных предшественников специфическими для типа клеток и стадии развития ферментами, стадии, катализируемой альфа-1,3/1,4-фукозилтрансферазами (альфа 1,3/1,4 Fuc-T, FUT).

К настоящему времени клонировали и охарактеризовали несколько генов фукозилтрансферазы человека. Экспрессия данных генов (FUT 3-7) и их ферментативные продукты (Fuc-TIII-VII), по-видимому, являются тканеспецифическими. Ферменты, кодируемые пятью генами, обозначены FUTIII, FUTIV, FUTV, FUTVI и FUTVII. Три гена, кодирующие FUTIII, FUTV и FUTVI, локализованы в физически близких положениях на хромосоме 19pl3.3. Биохимические исследования и молекулярное клонирование позволяют предполагать, что линиеспецифическую экспрессию молекулы сиалил-Льюис A/X определяет линиеспецифическая экспрессия генов альфа-1,3-фукозилтрансферазы, ферментативные продукты которых действуют на конститутивно экспрессирующиеся олигосахаридные предшественники для получения локализованных на поверхности детерминант сиалил-Льюис A/X. Фукозилтрансферазами человека, ответственными за активность в эпителиальных тканях, являются FUT3 и FUT6. Транскрипты FUT3 (называемого также геном Льюис альфа(1,3/1,4)фукозилтрансферазы) и FUT6 (гена альфа(1,3)фукозилтрансферазы плазмы) присутствуют как в нормальных, так и в трансформированных тканях. Транскрипты фукозилтрансферазы распространены также в многочисленных линиях клеток аденокарциномы, с заметно повышенной экспрессией FUT3 и 6 в карциноме толстой кишки (см., например, Ugorski et al., Acta Biochimica Polonica, 49:303-311 (2002); Nakamori et al., Dis. Colon Rectum., 40:420-431 (1997); Takada et al., Cancer Res., 53:354-361 (1993); Ichikawa et al., J. Surg. Oncol., 75:98-102 (2000); Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res., 2002 Mar; 21(1):107-13; Matsumoto et al., Br J Cancer. 2002 Jan 21; 86(2):161-7; Ito et al., J Gastroenterol. 2001 Dec; 36(12):823-9; Nakagoe et al., Cancer Detect Prev. 2001; 25(3):299-308; Kumamoto et al., Cancer Res. 2001 Jun 1; 61 (11:4620-7; Murata et al., Dis Colon Rectum. 2001 Apr; 44 (4):A2-A4; Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res. 2001 Mar; 20(1):85-90; Nakagoe et al., J Gastroenterol. 2001 Mar; 36(3):166-72; Nakagoe et al., Tumour Biol. 2001 Mar-Apr; 22(2):115-22; Nakagoe et al., Can J Gastroenterol. 2000 Oct; 14(9):753-60; Izawa et al., Cancer Res. 2000 Mar 1; 60(5):1410-6; Tanaka et al., Hepatogastroenterology. 1999 Mar-Apr; 46(26):875-82; Matsushita et al., Cancer Lett. 1998 Nov 27; 133 (2):151-60; Sato et al., Anticancer Res. 1997 Sep-Oct; 17 (5A):3505-11; Yamada et al., Br J Cancer. 1997; 76(5):582-7; Nakamori et al., Dis Colon Rectum. 1997 Apr; 40(4):420-31; Srinivas et al., Scand J Immunol. 1996 Sep; 44(3):197-203; Matsushita et al., Lab Invest. 1990 Dec; 63(6):780-91; Ashizawa et al., J Exp Clin Cancer Res. 2003 Mar; 22 (1):91-8; Nakagoe et al., J Exp Clin Cancer Res. 2002 Sep; 21(3):363-9; Nakagoe et al., Anticancer Res. 2002 Jan-Feb; 22(1A):451-8; Nakagoe et al., J Clin Gastroenterol. 2002 Apr; 34(4):408-15; Nakagoe et al., Cancer Lett. 2002 Jan 25; 175(2):213-21; Tatsumi et al., Clin Exp Metastasis. 1998 Nov; 16(8):743-50; Ikeda et al., J Surg Oncol. 1996 Jul; 62(3):171-6; Ikeda et al., Eur J Surg Oncol. 1995 Apr; 21 (2):168-75; Togayachi et al., Int J Cancer. 1999 Sep 24; 83 (1):70-9; Satoh et al., Clin Cancer Res. 1997 Apr; 3(4):495-9; Satoh et al., Respiration. 1998; 65(4):295-8; Satoh et al., Anticancer Res. 1998 Jul-Aug; 18(4B):2865-8; Fukuoka et al., Lung Cancer. 1998 May; 20(2):109-16; Fujiwara et al., Anticanefer Res. 1998 Mar-Apr; 18(2A):1043-6; Ogawa et al., Int J Cancer. 1997 Apr 22; 74 (2):189-92; Ogawa et al., J Thorac Cardiovasc Surg. 1994 Aug; 108(2):329-36; Asao et al., Cancer. 1989 Dec 15; 64 (12):2541-5; Narita et al., Breast Cancer. 1996 Mar 29; 3(1):19-23; Yamaguchi et al., Oncology. 1998 Jul-Aug; 55(4):357-62; Sikut et al., Int J Cancer. 1996 May 29; 66 (5):617-23; Saito et al., Anticancer Res. 2003 Jul-Aug; 23(4):3441-6; Fujii et al., Urol Int. 2000; 64 (3):129-33; Idikio et al., Glycoconj J. 1997 Nov; 14 (7):875-7; Inoue et al., Obstet Gynecol. 1992 Mar; 79(3):434-40; Yamashita et al., Eur J Cancer. 2000 Jan; 36(1):113-20; Hamanaka et al., Pancreas. 1996 Aug; 13(2):160-5; Ho et al., Cancer Res. 1995 Aug 15; 55(16):3659-63).

Сущность изобретения

Описанное здесь изобретение относится к способам и анализам для исследования экспрессии одного или нескольких биомаркеров в образце ткани или клеток млекопитающего, где экспрессия одного или нескольких таких биомаркеров является показателем того, будет ли образец ткани или клеток чувствительным к апоптоз-индуцирующим веществам, таким как Apo2L/TRAIL и антителам-агонистам анти-DR5. В различных вариантах осуществления изобретения этими способами и анализами исследуют экспрессию таких биомаркеров, как конкретные фукозилтрансферазы, в частности фукозилтрансфераза 3 (FUT3) и/или фукозилтрансфераза 6 (FUT6), так же как антигены сиалил-Льюис A и/или X.

Как обсуждают выше, большинство нормальных типов клеток человека, по-видимому, являются устойчивыми к индукции апоптоза конкретными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., выше, Walzcak et al., выше). Обнаружили также, что некоторые популяции пораженных заболеванием типов клеток человека (такие, как конкретные популяции раковых клеток) устойчивы к индукции апоптоза конкретными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 1999, выше; Walczak et al., Nature Med., 1999, выше). Следовательно, при исследовании посредством анализа экспрессии конкретных биомаркеров в образце ткани или клеток млекопитающего можно удобно и эффективно получить информацию, применимую в определении подходящей или эффективной терапии для лечения пациентов. Например, информация, полученная из анализа для детекции экспрессии FUT3 или FUT6 в образце ткани или клеток млекопитающего, может предоставить терапевтам полезные данные, которые можно применять для определения оптимального терапевтического режима (с применением Apo2L/TRAIL или антител-агонистов рецептора смерти) для пациентов, страдающих нарушением, таким как злокачественная опухоль.

Изобретение относится к способам предсказания чувствительности образца ткани или клеток (такого, как раковая клетка) млекопитающего к Apo2L/TRAIL или антителу-агонисту рецептора смерти. В конкретных вариантах осуществления способы включают получение образца ткани или клеток млекопитающего и проверку в ткани или клетке экспрессии фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6. Способы могут включать также проверку в ткани или клетке экспрессии другого биомаркера, такого как антиген(ы) сиалил-Льюис A и/или X. Способы можно осуществлять во множестве форматов анализа, включая анализы, детектирующие экспрессию мРНК, ферментативные анализы, детектирующие присутствие ферментативной активности, иммуногистохимические анализы и другие, обсуждаемые здесь. Определение экспрессии таких биомаркеров в указанных тканях или клетках будет показателем того, что такие ткани или клетки будут чувствительными к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL или антитела-агониста рецептора смерти. В необязательных вариантах осуществления в тканях или клетках можно исследовать также экспрессию рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2.

Дополнительные способы по изобретению включают способы индукции апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающие стадии получения образца ткани или клеток млекопитающего, исследования в ткани или клетке экспрессии одного или нескольких биомаркеров, таких как фукозилтрансфераза 3, фукозилтрансфераза 6, антиген(ы) сиалил-Льюис A и/или X, и при определении того, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует один или несколько указанных биомаркеров, воздействия на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством Apo2L/TRAIL или антитела-агониста рецептора смерти. Стадии в способах для проверки экспрессии одного или нескольких биомаркеров можно проводить во множестве форматов анализа, включая анализы, детектирующие экспрессию мРНК, ферментативные анализы, детектирующие присутствие ферментативной активности, и иммуногистохимические анализы. В необязательных вариантах осуществления способы также включают проверку в образце ткани или клеток экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2. Необязательно, образец ткани или клеток содержит раковые ткань или клетки.

Дополнительные способы по изобретению включают способы лечения у млекопитающего нарушения, такого как связанное с иммунитетом нарушение или злокачественная опухоль, включающие стадии получения образца ткани или клеток от млекопитающего, проверку в ткани или клетках экспрессии одного или нескольких биомаркеров, таких как фукозилтрансфераза 3, фукозилтрансфераза 6, антиген(ы) сиалил-Льюис A и/или X, и при определении того, что указанный образец ткани или клеток экспрессирует один или несколько указанных биомаркеров, введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL или антитела-агониста рецептора смерти. Стадии в способах для проверки экспрессии одного или нескольких биомаркеров можно проводить во множестве форматов анализа, включая анализы, детектирующие экспрессию мРНК, ферментативные анализы, детектирующие присутствие ферментативной активности, и иммуногистохимические анализы. В необязательных вариантах осуществления способы также включают проверку в образце ткани или клеток экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2.

Дополнительно, способы предусматривают лечение злокачественной опухоли у млекопитающего. Дополнительно, способы включают, кроме введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL и/или антитела-агониста рецептора смерти, введение химиотерапевтического средства (средств) или радиотерапию.

Дополнительные варианты осуществления более подробно описаны в следующей формуле изобретения.

1. Способ предсказания чувствительности образца ткани или клеток млекопитающего к Apo2L/TRAIL, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, где экспрессия одного или нескольких указанных биомаркеров является показателем того, что указанный образец ткани или клеток является чувствительным к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL.

2. Способ по п.1, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют детекцией экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

3. Способ по п.1, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют посредством иммуногистохимии для детекции экспрессии антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X.

4. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

5. Способ по п.1, где образец ткани или клеток содержит ткань или клетки злокачественной опухоли.

6. Способ по п.5, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

7. Способ индукции апоптоза в образце ткани или клеток млекопитающего, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, и

после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров воздействия на указанный образец ткани или клеток эффективным количеством Apo2L/TRAIL.

8. Способ по п.7, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют тестированием экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

9. Способ по п.7, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют посредством иммуногистохимии для детекции экспрессии антигена(антигенов) сиалил-Льюис A и/или X.

10. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанном образце ткани или клеток.

11. Способ по п.7, где указанный образец ткани или клеток содержит ткань или клетки злокачественной опухоли.

12. Способ по п.11, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

13. Способ по п.7, где на указанные клетки воздействуют эффективным количеством полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281 фиг.1.

14. Способ лечения у млекопитающего нарушения, такого как связанное с иммунитетом нарушение или злокачественная опухоль, включающий стадии:

получения образца ткани или клеток от указанного млекопитающего;

исследования образца ткани или клеток для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, и

после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL.

15. Способ по п.14, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют детекцией экспрессии мРНК фукозилтрансферазы 3 или фукозилтрансферазы 6.

16. Способ по п.14, где указанную экспрессию одного или нескольких биомаркеров исследуют посредством иммуногистохимии для детекции экспрессии антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X.

17. Способ по п.14, дополнительно включающий стадию исследования экспрессии рецепторов DR4, DR5, DcR1 или DcR2 в указанной ткани или клетке.

18. Способ по п.14, где образец ткани или клеток содержит ткань или клетки злокачественной опухоли.

19. Способ по п.18, где указанные клетки или ткань злокачественной опухоли содержат злокачественные клетки или ткань толстой кишки, колоректальные, желудочно-кишечные или поджелудочной железы.

20. Способ по п.14, где указанному млекопитающему вводят эффективное количество полипептида Apo2L/TRAIL, содержащего аминокислоты 114-281 фиг.1.

21. Способ по п.14, где указанное млекопитающее также получает химиотерапевтическое средство (средства) или радиотерапию.

22. Способ по п.14, где указанному млекопитающему также вводят цитокин, цитотоксическое средство или ингибирующее рост средство.

23. Способ по п.7, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

24. Способ по п.14, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

25. Способ по п.6, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки толстой кишки или колоректальные.

26. Способ по п.1, где указанный Apo2L/TRAIL представляет собой полипептид, содержащий аминокислоты 41-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1), или его биологически активный фрагмент.

27. Способ по п.26, где указанный Apo2L/TRAIL представляет собой полипептид, содержащий аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

28. Способ по п.12, где указанные клетки злокачественной опухоли представляют собой злокачественные клетки толстой кишки или колоректальные.

29. Способ по п.20, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL состоит из аминокислот 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

30. Способ предсказания чувствительности клеток злокачественной опухоли млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных, к Apo2L/TRAIL, включающий стадии:

получения клеток злокачественной опухоли млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных;

исследования клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, где экспрессия одного или нескольких указанных биомаркеров является показателем того, что указанные клетки злокачественной опухоли являются чувствительными к апоптоз-индуцирующей активности Apo2L/TRAIL.

31. Способ индукции апоптоза в клетках злокачественной опухоли млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных, включающий стадии:

получения клеток злокачественной опухоли млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных;

исследования клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, и

после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров воздействия на указанные клетки злокачественной опухоли эффективным количеством полипептида Apo2L/TRAIL.

32. Способ по п.31, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 41-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1) или их фрагмент, обладающий апоптотической активностью.

33. Способ по п.32, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

34. Способ по п.32, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

35. Способ лечения у млекопитающего злокачественной опухоли толстой кишки или колоректальной, включающий стадии:

получения образца клеток злокачественной опухоли указанного млекопитающего, из толстой кишки или колоректальных;

исследования клеток злокачественной опухоли для детекции экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы из фукозилтрансферазы 3, фукозилтрансферазы 6, антигена (антигенов) сиалил-Льюис A и/или X, и

после детекции экспрессии одного или нескольких указанных биомаркеров введения указанному млекопитающему эффективного количества Apo2L/TRAIL.

36. Способ по п.35, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 41-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1) или их фрагмент, обладающий апоптотической активностью.

37. Способ по п.36, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL присоединен к молекуле полиэтиленгликоля.

38. Способ по п.36, где указанный полипептид Apo2L/TRAIL содержит аминокислоты 114-281 фиг.1 (SEQ ID NO:1).

Краткое описание фигур

На фиг.1 показана нуклеотидная последовательность кДНК лиганда Apo-2 человека (SEQ ID NO:2) и его производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1). «N» в положении нуклеотида 447 использован, чтобы указать, что нуклеотидное основание может представлять собой «T» или «G».

На фиг.2A и 2B показана нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) для полноразмерного DR4 человека и его производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности DR4 человека опубликованы также в Pan et al., Science, 276:111 (1997).

На фиг.3A показана последовательность DR5 человека из 411 аминокислот (SEQ ID NO:5), как опубликовано в WO 98/51793 19 ноября 1998 г. В данной области известен вариант транскрипционного сплайсинга DR5 человека. Этот вариант сплайсинга кодирует последовательность DR5 человека из 440 аминокислот (SEQ ID NO:6), показанную на фиг.3B и 3C, как опубликовано в WO 98/35986 20 августа 1998 г.

На фиг.3D показаны нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:7) для полноразмерного DcRl человека и его производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности для DcRl человека (и его конкретных доменов) показаны и описаны также в WO 98/58062.

На фиг.3E показаны нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:9) для полноразмерного DcR2 человека и его производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:10). Соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности для DcR2 человека (и его конкретных доменов) показаны и описаны в WO 99/10484.

На фиг.4 показаны нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:11) для полноразмерной (1,3/1,4) фукозилтрансферазы (FUT3) человека и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12). Данные последовательности соответствуют инвентарному номеру в GenBank HSU27328 и описаны, например, в Kukowska-Latallo et al., Genes Dev. 1990 Aug; 4 (8):1288-303.

На фиг.5 показаны нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:13) полноразмерной альфа (1,3) фукозилтрансферазы (FUT6) человека и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:14). Данные последовательности соответствуют инвентарному номеру в GenBank HSU27333 и описаны, например, в Koszdin and Bowen, Biochem Biophys Res Commun. 1992 Aug 31; 187 (1):152-7.

На фиг.6 показана обобщенная таблица данных, полученных при анализе 28 линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по чувствительности или устойчивости к апоптотической активности Apo2L (+0,5% эмбриональной бычьей сыворотки «FBS» или 10% FBS) или моноклонального антитела к DR5 «mab», перекрестно-сшитого «XL» или не перекрестно-сшитого (+0,5% эмбриональной бычьей сыворотки «FBS» или 10% FBS) и по экспрессии FUT 3, FUT 6, сиалил-Льюис A и сиалил-Льюис X.

На фиг.7 показано сравнение чувствительности различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, к антителу к DR5 и экспрессии FUT 3, как измерено количественной ПЦР.

На фиг.8 показано сравнение чувствительности различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по чувствительности или устойчивости к антителу к DR5 (плюс перекрестносшивающее средство) и экспрессии сиалил-Льюис X или A, как определено FACS.

На фиг.9A показан коэффициент ранговой корреляции Спирмэна при анализе чувствительности или устойчивости различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, и корреляции с экспрессией FUT3.

На фиг.9B показаны результаты точного теста Фишера для анализа чувствительности («чувств.») или устойчивости («уст.») различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, и статистическая значимость между экспрессией FUT 3 и сиалил-Льюис A/X и чувствительностью соответствующих линий клеток к апоптотической активности антитела к DR5.

На фиг.10 показано сравнение различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по экспрессии рецепторов DcRl или DcR2 (как определено количественной ПЦР) и статус (чувствительные или устойчивые) конкретных линий клеток по отношению к Apo2L или антителу к DR5.

На фиг.11 показано сравнение различных линий раковых клеток, из толстой кишки или колоректальных, по экспрессии рецепторов DcRl или DcR2 (как определено FACS) и статус (чувствительные или устойчивые) конкретных линий клеток по отношению к Apo2L или антителу к DR5.

На фиг.12 показано иммуногистохимическое окрашивание сиалил-Льюис A и X в четырех линиях раковых колоректальных клеток, CaCo2, SW 1417, DLD-1 и Colo 205, и его корреляция с экспрессией сиалил-Льюис A и X, как измерено FACS, и ее корреляция с чувствительностью к Apo2L.

На фиг.13 показаны обобщенные результаты IHC экспериментов, демонстрирующие экспрессию сиалил-Льюис A и X в образцах ткани нормальной слизистой толстой кишки, нормальной ткани печени, первичного рака толстой кишки и метастазов рака толстой кишки.

Подробное описание изобретения

Способы и процедуры, описанные или приведенные в ссылках здесь, как правило, хорошо понятны специалистам в данной области и обычно выполнимы ими с применением общепринятой методологии, такой как, например, широко применяемые методологии молекулярного клонирования, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. В соответствующих случаях процедуры, предусматривающие применение коммерчески доступных наборов и реагентов, обычно проводят в соответствии с определенными производителем протоколами и/или параметрами, если не указано иначе.

Перед описанием настоящих способов и анализов следует понимать, что настоящее изобретение не является ограниченным конкретными описанными методологией, протоколами, линиями клеток, видами или родами животных конструкциями и реагентами, так как их, конечно можно изменять. Следует понимать также, что применяемая здесь терминология предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Следует заметить, что, как применяют здесь и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают объекты ссылки множественного числа, если контекст явно не требует другого. Так, например, ссылка на «генетическое изменение» включает множество таких изменений, а ссылка на «зонд» включает ссылку на один или несколько зондов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и так далее.

Все упомянутые здесь публикации приведены здесь в качестве ссылки, чтобы раскрывать и описывать способы и/или материалы, в связи с которыми процитированы публикации. Процитированные здесь публикации включены сюда для их описания перед датой подачи настоящей заявки. Ничего здесь не следует истолковывать как признание, что авторы настоящего изобретения не имеют права называть дату публи