Способ получения полипептидов

Способ получения полипептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США №60/552678, поданной 11 марта 2004, на приоритет которой претендует настоящая заявка в соответствии с § 119 35 U.S.C. и содержание которой приведено здесь в качестве ссылки.

Область изобретения

Изобретение относится к способу получения полипептида, гетерологичного для E. coli. Более конкретно изобретение относится к применению органофосфата для улучшения выхода таких полипептидов.

Описание родственной области техники

Экспрессия гетерологичных белков в Escherichia coli, которой способствует хорошо изученная молекулярная биология микроорганизма и относительная простота генетических манипуляций с ним, является очень производительной и в лабораторных условиях, и на производстве. Как правило, для регуляции экспрессии гетерологичного белка применяют индуцибельный промотор (например, промотор щелочной фосфатазы, промотор tac, арабинозный промотор и т.д.). Потребность в индукционном событии предоставляет исследователю возможность контролировать синхронизацией экспрессии белка-мишени. Эта возможность особенно важна для тех гетерологичных белков, высокая концентрация которых не допускается у хозяина. Посредством достижения высокой плотности клеток перед индукцией экспрессии можно максимально увеличить объемный выход желательного белка.

Клетки перестают расти, когда микроорганизм лишают требуемого питательного вещества. Лимитирующим компонентом может являться углерод, азот, фосфат, кислород или любой из требуемых клетке элементов. В таких условиях клетки выходят из фазы роста. Способом облегчить ответы культуры на стресс, вызванный ограничением питательного вещества, является предоставление питания отсутствующим компонентом. Общепринятые компоненты питания, вводимые в процессы подпитываемой ферментации, включают в себя глюкозу, аминокислоты, кислород и т.д.

В случае клеточного фосфора (P), необходимость источника фосфата неудивительна, с учетом того, что P представляет собой наиболее широко распространенный элемент в клетке кроме углерода, кислорода, азота и водорода. Slanier, Adelberg and Ingraham, The Microbial World. 4^th ed. (Prentice Hall, NJ 1976), p. 1357. Фосфор является необходимым компонентом многочисленных макромолекул, таких как нуклеиновые кислоты, липополисахариды и мембранные липиды. Кроме того, его роль в макроэргических фосфоангидридных связях делает его особенно важным в энергетическом обмене. E. coli способна утилизировать в качестве первичного источника P неорганический фосфат (Pi), органофосфат или фосфонат. Поглощения Pi из окружающей среды можно достичь посредством двух систем транспортеров, систем Pit и Pst. Что касается органофосфатов, то большинство из них не являются транспортабельными, и сначала их нужно гидролизовать ферментативно в периплазме, прежде чем высвобожденный Pi может доставлять транспортная система (системы) Pi. Только немногие органофосфаты являются транспортабельными, и глицерол-3-фосфат (G3P) является одним из таких примеров. G3P и глицерофосфат-1-фосфат (G1P) известны как альфа-глицерофосфаты. В ответ на ограничение Pi и ограничение углерода E. coli способна поглощать доступный интактный G3P из внешней среды во внутриклеточный компартмент, где G3P подвергают метаболизму для получения необходимого фосфата или углерода. Wanner, "Phosphorus Assimulation and Control of the Phosphate Regulon", in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Neidhardt, ed. (второе издание), American Society for Microbiology Press (1996), pp. 1357-1365.

Дополнительными ссылками на G3P являются Silhavy et al., J. Bacteriol., 126: 951-958 (1976) о периплазматическом белке, связанном с транспортной системой sn-глицерол-3-фосфата в E. coli; Argast et al., J. Bacteriol., 136: 1070-1083 (1978) о второй транспортной системе sn-глицерол-3-фосфата в E. coli; Elvin et al., J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985) об обмене Pi, опосредованном glpT-зависимой системой транспорта G3P; Rao et al., J. Bacteriol., 175: 74-79 (1993) об эффекте мутаций glpT и glpD на экспрессию гена phoA в E. coli; и Elashvili et al., Appl. Environ. Microbiol., 64: 2601-2608 (1998) о генах phnE и glpT, усиливающих утилизацию органофосфатов в E. coli K-12. Кроме того, в статье Vergeles et al. Eur. J. Biochem., 233: 442-447 (1995) описана высокая эффективность глицерол-2-фосфата (G2P), известного иначе как бета-глицерофосфат, и G3P как нуклеотидил-акцепторов в реакциях эстерификации фосфодиэстеразой в яде змеи.

Современное представление о двух транспортных системах для поглощения экзогенного G3P в E. coli, транспортных систем Ugp и GlpT, подробно суммировано в книге Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology edited by Neidhardt et. al. (второе издание), выше, pp. 1364 в отношении ссылок 13 и 81. Оперон Ugp относится к регулону pho. Его индуцируют ограничением фосфата и положительно регулируют белком phoB. Система Ugp представляет собой периплазматическую зависимую от связывания белка многокомпонентную транспортную систему с ugpB, кодирующим периплазматический связывающий белок, ugpA и ugpC, кодирующими интегральные белки мембранных каналов, и ugpC, кодирующим АТФазу. GlpT является частью системы glp, опосредующей поглощение и метаболизм глицерина, G3P и глицерол-фосфорил фосфодиэфиров (Lin et al., Annu. Rev. Microbiol., 30: 535-578 (1976); Chapter 20; pg 307-342 Dissimilatory Pathways for sugars, polyols and carboxylates. Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, второе издание). Такая транспортная система представляет собой анионообменник, для которого известно, что он опосредует отток Pi из цитоплазмы посредством обмена с внешним G3P. В штамме дикого типа, выращиваемом на G3P, в то время как немного Pi высвобождают клетки, поглощающие G3P посредством системы Ugp, возможно высвобождение Pi в периплазму при поглощении G3P через систему GlpT. При высвобождении репрессивного количества Pi в результате опосредованного glpT-пермеазой оттока активность регулона pho, включая систему Ugp, выключается. В определенных условиях GlpT представляет собой единственный путь выхода Pi из клетки посредством обмена с внешним G3P. Elvin et al., J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985); Rosenberg, ”Phosphate transport in prokaryotes," p. 205-248. In B. P. Rosen and S. Silver (ed.), Ion Transport in Prokaryotes (Academic Press, Inc., New York, 1987).

Когда сравнивают производительность систем Ugp и GlpT по транспорту G3P, максимальные скорости двух систем одинаковы. Кажущаяся аффинность для G3P выше у системы Ugp, чем у системы GlpT. Вероятно, обе системы способны поставлять достаточно G3P для роста клетки, если он доступен в среде для роста. Однако G3P, транспортируемый исключительно через систему Ugp, может служить единственным источником фосфата, но не углерода, тогда как GlpT-транспортированный G3P может служить единственным источником обоих (Schweizer et al., J. Bacteriol., 150: 1154-1163(1982)). Картированы два гена ugp, кодирующие pho-регулон-зависимую систему транспорта G3P (Schweizer et al., J. Bacteriol., 150: 1164-1171 (1982)), характеризована область ugp, содержащая данные гены (Schweizer et al., Mol. and Gen. Genetics, 197: 161-168 (1984)), и изучена регуляция оперона ugp (Schweizer et al., J. Bacteriol., 163: 392-394 (1985); Kasahara et al., J. Bacteriol., 173: 549-558 (1991); Su et al., Molecular & General Genetics, 230: 28-32 (1991); Brzoska et al., "ugp-dependent transport system for sn-glycerol 3-phosphate of Escherichia coli" p. 170-177 in A. Torriani-Gorini, F.G. Rothman, S. Silver, A. Wright, and E. Yagil (ed.), Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms (American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987); Brzoska et al., J. Bacteriol., 176: 15-20 (1994); and Xavier et al., J. Bacteriol., 177: 699-704 (1995)).

В штаммах дикого типа существует стабильный внутриклеточный пул G3P, поддерживаемый при приблизительно 200 мкМ. Внутри G3P можно синтезировать ферментативным превращением глицерина в G3P глицеролкиназой (кодируемой glpK) при росте на глицерине как единственном источнике углерода, или восстановлением гликолитического промежуточного соединения, дигидроксиацетон-фосфата, G3P-синтазой, продуктом гена gpsA, при росте на источниках углерода, отличных от глицерина. Так как G3P представляет собой важное промежуточное соединение, формирующее каркас всех фосфолипидных молекул, внутренние глицерол-фосфаты можно получить также разложением фосфолипидов и триацилглицерина. Как метаболит внутренний G3P можно направить в путь биосинтеза фосфолипидов или окислить G3P-дегидрогеназой для формирования дигидроксиацетон-фосфата и ввести в гликолитический путь.

В ситуациях, где промотор AP служит для регуляции экспрессии гетерологичного белка в E. coli, поскольку индукция происходит только после истощения Pi в среде, клетки с индуцированной активностью промотора AP обычно голодают по фосфату, и их жизнеспособность снижена. Они могут быть вынуждены извлекать фосфат, необходимый для клеточных функций. Возможные последствия такого извлечения фосфата могут включать в себя оборачиваемость рибосом, низкую клеточную энергетику и увеличение экспрессии протеаз и протеолиза (St. John and Goldberg, J. Bacteriol., 143: 1223-1233 (1980)), потенциально приводя к менее здоровым клеткам со сниженной способностью накапливать белок.

Улучшение метаболического состояния E. coli, вероятно, может увеличить способность клеток синтезировать белки. Если подавать фосфат медленно, клетки могут только почувствовать низкую концентрацию Pi в периплазме, таким образом индуцируя регулон pho без внутриклеточного голодания по атому P (см. U.S. Pat. No 5304472). Существует необходимость предоставления дополнительных способов для продукции гетерологичных полипептидов в E. coli.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу для улучшения экспрессии гетерологичных полипептидов в E. coli. Показано, что подпитка транспортируемым органофосфатом, таким как альфа-глицерофосфат, различных хозяев - E. coli, включая хозяев с и без гена glpT дикого типа и хозяев с и без гена phoA дикого типа, таких как, например, E. coli (ugp+ ΔglpT phoA-), улучшает экспрессию гетерологичного белка в масштабе и встряхиваемой колбы, и 10-л-ферментера, и ожидают проводить подобное в большем масштабе, таком как 10000 л. Наблюдали улучшение выхода продукта для экспрессии гетерологичных белков в многочисленных модельных системах, применяющих множество промоторов, включая индуцибельные промоторы, такие как промотор tac, T7 или AP. Дополнительным преимуществом является то, что продукт можно получить раньше в фазе активного роста, т.е. за более короткое время, чем другим способом. В конкретных вариантах осуществления больше продукта можно получить раньше в фазе активного роста для значительного улучшения производительности.

Таким образом, настоящее изобретение соответствует формуле изобретения. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения гетерологичного для E. coli полипептида, предусматривающему (a) культивирование клеток E. coli, содержащих кодирующую полипептид нуклеиновую кислоту, в культуральной среде при подпитке культуральной среды транспортабельным органофосфатом, так что нуклеиновая кислота является экспрессированной, и (b) выделение полипептида из клеток. В предпочтительном варианте осуществления органофосфат представляет собой глицерофосфат, более предпочтительно альфа-глицерофосфат и/или бета-глицерофосфат, и еще более предпочтительно смесь глицерол-2-фосфата и глицерол-3-фосфата или один глицерол-3-фосфат. В другом предпочтительном аспекте культивирование проводят во встряхиваемой колбе или ферментере, предпочтительно в ферментере. В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выделяют из цитоплазмы, периплазмы или культуральной среды клеток. Также предпочтительно, чтобы экспрессия нуклеиновой кислоты являлась регулируемой индуцибельным промотором, таким как промотор щелочной фосфатазы, промотор tac, или промотор T7, и предпочтительно экспрессию нуклеиновой кислоты начинают в фазе активного роста на стадии культивирования. В одном из вариантов осуществления E. coli представляет собой дикий тип. В другом варианте осуществления E. coli является дефектной по хромосомальному glpT и хромосомальному phoA, но предпочтительно не является дефектной по хромосомальному ugp. Предпочтительно неорганический фосфат также присутствует на стадии культивирования.

Без ограничения какой-либо одной теорией считают, что при данном способе клетки подпитывают транспортабельными фосфорорганическими соединениями, так что pstS системы Pho не будет воспринимать доставку фосфата, но будет все еще обеспечивать фосфат после расщепления в цитоплазме, и далее что подача транспортабельного органофосфата, такого как G3P, потенциально обогащает клетки утилизируемым промежуточным соединением, которое можно легко направлять в важные метаболические пути.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показана экспрессия секретируемого фрагмента антитела ламы в хозяине - E. coli BL21 с применением промотора tac в культуре во встряхиваемой колбе, с применением или воды, или 200 мМ G3P в качестве дополнения к низкофосфатной (CRAP) или высокофосфатной (THCD) среде.

На фиг.2 показана экспрессия цитоплазматического Apo2L в хозяине - E. coli HMS174 с применением промотора T7 в культуре во встряхиваемой колбе, с применением или воды, или 200 мМ G3P в качестве дополнения к среде CRAP.

На фиг.3 показан эффект подпитки G3P во время ферментации на накопление со временем секретируемого IGF-I. Применяли хозяина - E. coli дикого типа, промотор AP, и непрерывную подпитку глюкозой.

На фиг.4 показан эффект мутации glpT и подпитки G3P во время ферментации на накопление со временем секретируемого IGF-I. Применяли хозяина - E. coli ΔglpT, промотор AP и различную скорость подачи G3P.

На фиг.5 показана схема плазмиды pAPApo2-P2RU.

На фиг.6 показана нуклеотидная последовательность кДНК лиганда Apo-2 человека (SEQ ID NO: 1) и производная от нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2). «N» в положении нуклеотида 447 (в SEQ ID NO: 1) применяют, чтобы указывать, что нуклеотидное основание может представлять собой «T» или «G».

На фиг.7 показан эффект подпитки G3P на специфическое накопление Apo2L в хозяине - E. coli ΔglpT (43F6), при трех различных скоростях подачи и контроле без подпитки G3P.

На фиг.8 показано преимущество подпитки глицерофосфатом над неорганическим фосфатом для специфического общего накопления Apo2L для хозяина дикого типа по glpT (43E7), где плотность клеток увеличена до превышающей 200 OD550.

На фиг.9 показан эффект на специфическое общее накопление Apo2L замены неорганического фосфата на глицерофосфат в хозяине - E. coli дикого типа по glpT (43E7) и хозяине - E. coli ΔglpT (43F6).

На фиг.10 показан эффект на специфическое общее накопление Apo2L замены альфа-глицерофосфата на смесь 50:50 альфа- и бета-глицерофосфата в качестве подпитки по сравнению с контролем без подпитки в хозяине - E. coli ΔglpT (61G1).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Определения

Как применяют здесь, «полипептид» относится в общем смысле к пептидам и белкам, обладающим более чем десятью аминокислотами. «Гетерологичные» полипептиды представляют собой полипептиды, чужеродные для применяемой клетки-хозяина, такие как человеческий белок, производимый E. coli. В то время как полипептид может являться прокариотическим или эукариотическим, предпочтительно он является эукариотическим, более предпочтительно относящимся к млекопитающим, и наиболее предпочтительно человеческим.

Примеры полипептидов млекопитающих включают в себя такие молекулы, как, например, реннин; гормон роста, включая гормон роста человека или бычий гормон роста; фактор, высвобождающий гормон роста; паратиреоидный гормон; тиреостимулирующий гормон; липопротеины; 1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; тромбопоэтин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор и фактор фон Виллебранда; противосвертывающие факторы, такие как белок C; атриальный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа или человеческий урокиназный или тканевой активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; фактор некроза опухолей-альфа и -бета; антитела против домена(доменов) ErbB2, такие как 2C4 (WO 01/00245; гибридома ATCC HB-12697), связывающие область во внеклеточном домене ErbB2 (например, один или несколько остатков в области от приблизительно 22 остатка до приблизительно 584 остатка ErbB2, включительно); энкефалиназа; мюллеров ингибирующий фактор; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; бактериальный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы для гормонов и факторов роста; интегрин; белок A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как мозговой нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5, или -6 (NT-3, NT-4, NT-5, или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF; кардиотрофины (факторы гипертрофии сердца), такие как кардиотрофин-1 (CT-1); тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 или TGF-5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I); белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; CD-белки, такие как CD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; морфогенетический белок кости (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин (HSA) или бычий сывороточный альбумин (BSA); колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, IL-1 - IL-10; анти-HER-2-антитело; лиганд Apo2 (Apo2L); супероксиддисмутаза; Т-клеточные рецепторы; поверхностно-мембранные белки; стимулятор гомолиза; вирусные антигены, такие как, например, часть оболочки AIDS; транспортные белки; рецепторы хоминга; адресины; регуляторные белки; антитела; и фрагменты любых из перечисленных выше полипептидов.

Предпочтительные интересующие полипептиды включают в себя такие полипептиды, как HSA, BSA, анти-IgE, анти-CD20, анти-IgG, t-PA, gp120, анти-CD11a, анти-CD18, 2C4, анти-VEGF, VEGF, TGF-бета, активин, ингибин, анти-HER-2, ДНКаза, IGF-I, IGF-II, мозговой IGF-I, гормон роста, цепи релаксина, фактор, высвобождающий гормон роста, цепи инсулина или проинсулин, антитела и фрагменты антител, NGF, NT-3, BDNF, Apo2L и урокиназа. Наиболее предпочтительно полипептид представляет собой IGF-I или Apo2L.

Термины «лиганд Apo2», «Apo2L», и «TRAIL» применяют здесь попеременно в отношении последовательности полипептида, содержащей аминокислотные остатки 114-281, включительно, остатки 95-281, включительно, остатки 92-281, включительно, остатки 91-281, включительно, остатки 41-281, включительно, остатки 15-281, включительно, или остатки 1-281, включительно, аминокислотной последовательности, показанной на фиг.6 (SEQ ID NO:2), так же как биологически активные фрагменты, и делеционные, инсерционные и замещенные варианты вышеуказанных последовательностей. В одном из вариантов осуществления последовательность полипептида содержит остатки 114-281 из фиг.6 (SEQ ID NO:2). Не обязательно, последовательность полипептида содержит остатки 92-281 или остатки 91-281 из фиг.6 (SEQ ID NO:2). Полипептиды Apo2L может кодировать природная нуклеотидная последовательность, показанная на фиг.6 (SEQ ID NO:1). Не обязательно, кодон, кодирующий остаток Pro119 (фиг.6; SEQ ID NO:1), может представлять собой «CCT» или «CCG». В другом предпочтительном варианте осуществления фрагменты или варианты являются биологически активными и обладают по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, и даже более предпочтительно, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности с любой из вышеуказанных последовательностей. Определение охватывает замещенные варианты лиганда Apo2, в которых по меньшей мере одну из его природных аминокислот замещают остатком аланина. Определение охватывает также лиганд Apo2 с природной последовательностью, выделенный из природного источника лиганда Apo2, или полученный рекомбинантными или синтетическими способами. Лиганд Apo2 по изобретению включает в себя полипептиды, на которые ссылаются как на лиганд Apo2 или TRAIL, описанные в WO 97/01633, WO 97/25428 и WO 01/00832. Термины «лиганд Apo2» и «Apo2L» применяют для ссылки в общем смысле на формы лиганда Apo2, включающие в себя мономерную, димерную или тримерную формы полипептида. Для всей нумерации аминокислотных остатков, на которые ссылаются в последовательности Apo2L, применяют нумерацию в соответствии с фиг.6 (SEQ ID NO:2), если конкретно не указано иначе. Например, «D203» или «Asp203» относится к остатку аспарагиновой кислоты в положении 203 в последовательности, приведенной на фиг.6 (SEQ ID NO:2).

Термин «внеклеточный домен лиганда Apo-2» или «ECD лиганда Apo2» относится к форме лиганда Apo2, по существу свободной от трансмембранного и цитоплазматического доменов. Обычно ECD обладает менее чем 1% данных трансмембранного и цитоплазматического доменов, и предпочтительно обладает менее чем 0,5% данных доменов. «Биологически активный» или «биологическая активность» в отношении Apo2L относится к (a) обладанию способностью индуцировать или стимулировать апоптоз по меньшей мере в одном типе клеток опухоли или инфицированных вирусом клеток млекопитающих in vivo или ex vivo; (b) способности вызывать продукцию антитела (т.е. иммуногенности), (c) способности связывать и/или стимулировать рецептор для Apo2L; или (d) сохранению активности нативного или природного полипептида Apo2L.

«Контрольные последовательности» экспрессии относится к последовательностям ДНК, необходимых для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контрольные последовательности, подходящие для прокариот, включают в себя промотор, необязательно, последовательность оператора и участок связывания рибосомы.

Нуклеиновая кислота «функционально связана», когда ее помещают в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК для полипептида, если ее экспрессируют как пребелок, участвующий в секреции полипептида; промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он действует на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы содействовать трансляции. Как правило, «функционально связанный» означает, что связываемые последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторного лидера, смежными и в фазе считывания. Связывание осуществляют лигированием в подходящие участки рестрикции. Если таких участков не существует, можно применять синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

Как применяют здесь, выражения «клетка», «линия клеток» и «культура клеток» применяют попеременно, и все данные обозначения включают в себя потомство. Так, слова «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают в себя указанную первичную клетку и производные от нее культуры, независимо от числа переносов. Понятно также, что потомство может не являться точно идентичным по содержанию ДНК, из-за намеренных или случайных мутаций. Сюда включают мутантное потомство, обладающее той же функцией или биологической активностью, по какой отбирали первоначальные трансформированные клетки. Где подразумевают особые обозначения, это станет ясно из контекста.

Термин «органофосфат», как применяют здесь, относится к фосфатному соединению, содержащему один или несколько атомов углерода, которое может содержать также атомы галогенида. Данное фосфатное соединение должно являться таким, чтобы им можно было подпитывать культуру клеток, и она могла его утилизировать. Данные соединения часто применяют как пестициды. «Транспортабельные» органофосфаты можно транспортировать из внешнего окружения клетки в клетку без пре-гидролиза каким-либо образом. Если штамм E. coli не растет хорошо на органофосфате, утилизацию такого органофосфата можно улучшить сверхэкспрессией в E. coli продукта гена phnE. Данный ген после трансформации сообщает штамму E. coli фенотип непосредственной утилизации органофосфата. Смотри Elashvili et al., выше. Примеры подходящих органофосфатов включают в себя алкил-галофосфаты, такие как диизопропилфторфосфат, алкилфосфаты, такие как диизопропилфосфат и 3,4-дигидроксибутил-1-фосфат, так же как сахар- или алканол-содержащие фосфаты, такие как гексоза-6-фосфат и глицерол-3-фосфат. Предпочтительными являются глюкоза-1-фосфат, гексоза-6-фосфат и глицерофосфаты, такие как глюкоза-1-глицерофосфат, фруктоза-6-глицерофосфат, альфа-глицерофосфаты, такие как глицерол-1-фосфат и глицерол-3-фосфат, и бета-глицерофосфат (глицерол-2-фосфат), более предпочтительными являются глицерофосфаты, еще более предпочтительными являются альфа- и/или бета-глицерофосфаты, и еще более предпочтительными являются глицерол-2-фосфат и/или глицерол-3-фосфат, и самыми предпочтительными для применения здесь являются смесь глицерол-2- и глицерол-3-фосфата или глицерол-3-фосфат. Как применяют здесь, термин «G3P», не присутствующий в смеси, или «один G3P» относится к композиции, содержащей по меньшей мере приблизительно 80% глицерол-3-фосфата; она может содержать вплоть до приблизительно 20% примесей, таких как G2P. Смесь G3P и G2P содержит менее чем приблизительно 80% G3P.

Неорганический фосфат представляет собой фосфатное соединение, не содержащее атомов углерода, с фосфатом, обычно связанным с щелочным или щелочноземельным металлом, такое как фосфат калия, кальция, магния или натрия.

«Фаза активного роста» относится к фазе стадии культивирования, где клетки являются активно растущими и не строго ограниченными в питании, как находящиеся в стационарной фазе клетки.

Способы осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения гетерологичных для E. coli полипептидов. По данному способу клетки E. coli, содержащие кодирующую полипептид нуклеиновую кислоту, культивируют в культуральной среде при подпитке культуральной среды транспортабельным органофосфатом, так что нуклеиновая кислота является экспрессированной. Затем полипептид выделяют из клеток. Выделять можно из цитоплазмы, периплазмы или культуральной среды клеток. Культивирование можно проводить в любом подходящем сосуде, предпочтительно во встряхиваемой колбе или ферментере, более предпочтительно в ферментере.

Можно применять параметры культивирования и проводить производство полипептида общепринятым способом, таким как способы, описанные ниже.

A. Выбор нуклеиновой кислоты и ее модификации

Нуклеиновая кислота, кодирующая интересующий полипептид, представляет собой подходящую РНК, кДНК или геномную ДНК из любого источника при условии, что она кодирует интересующий полипептид(ы). Хорошо известны способы выбора подходящей нуклеиновой кислоты для экспрессии гетерологичных полипептидов (включая их варианты) в E. coli.

Если производят моноклональные антитела, ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделить и секвенировать с применением общепринятых способов (например, с применением олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Предпочтительным источником данной ДНК являются клетки гибридомы. После выделения ДНК можно помещать в экспрессирующие векторы, которыми затем здесь трансформируют бактериальные клетки-хозяева для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, включают в себя Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) и Plückthun, Immunol. Revs., 130: 151-188(1992).

Способы гуманизации не относящихся к человеку антител описаны в данной области. Предпочтительно, гуманизированное антитело обладает одним или несколькими аминокислотными остатками, введенными в него из источника, не относящегося к человеку. На данные не относящиеся к человеку аминокислотные остатки часто ссылаются как на «импортируемые» остатки, которые обычно взяты из «импортируемого» вариабельного домена. Гуманизацию по существу можно проводить по способу Winter и соавторов (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)) посредством замещения последовательностей гипервариабельной области на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие «гуманизированные» антитела представляют собой химерные антитела (U.S. Pat. No 4816567), где существенно меньше, чем интактный человеческий вариабельный домен замещен соответствующей последовательностью из не относящихся к человеку видов. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и, возможно, некоторые остатки FR замещают остатками из аналогичных участков антител грызунов.

Выбор человеческих вариабельных доменов, легких и тяжелых, для применения в получении гуманизированных антител является очень важным для уменьшения антигенности. По так называемому способу «наилучшего соответствия» последовательность вариабельного домена антитела грызунов отбирают по сравнению с полной библиотекой известных человеческих последовательностей вариабельных доменов. Затем человеческую последовательность, наиболее близкую к последовательности грызуна, принимают в качестве человеческой каркасной области (FR) для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). По другому способу применяют конкретную каркасную область, выведенную из консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас можно применять для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

Кроме того, важно, чтобы антитела являлись гуманизированными с сохранением высокой аффинности к антигену и других удобных биологических свойств. Для достижения данной цели по предпочтительному способу гуманизированные антитела получают способом анализа исходных последовательностей и различных умозрительных гуманизированных продуктов с применением трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и знакомы специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, иллюстрирующие и демонстрирующие возможные трехмерные конформационные структуры выбранных иммуноглобулиновых последовательностей-кандидатов. Проверка данных демонстраций позволяет анализ возможной роли остатков в функционировании иммуноглобулиновых последовательностей-кандидатов, т.е. анализ остатков, влияющих на способность иммуноглобулина-кандидата связывать его антиген. Таким образом можно выбирать и комбинировать остатки FR из последовательностей реципиента и импортируемых, так чтобы достигать желаемых характеристик антитела, таких как увеличенная аффинность для антигена(антигенов). Вообще, остатки гипервариабельной области непосредственно и наиболее существенно вовлечены во влияние на связывание антигена.

Рассматривают различные формы гуманизированного антитела или аффинно зрелого антитела. Например, гуманизированное антитело или аффинно зрелое антитело может представлять собой фрагмент антитела, такой как Fab, не обязательно, конъюгированный с одним или несколькими направляющими средствами (средством) для получения иммуноконъюгата. Альтернативно, гуманизированное антитело или аффинно зрелое антитело может представлять собой интактное антитело, такое как интактное антитело IgG1.

Fab'-SH-фрагменты можно выделить непосредственно из E. coli и химически объединить для получения F(ab')₂-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). По другому способу F(ab')₂-фрагменты можно выделить непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие способы получения фрагментов антитела очевидны практикующему специалисту в данной области. В других вариантах осуществления выбранное антитело представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv) (WO 93/16185; U.S. Pat. No 5571894 и 5587458). Фрагмент антитела может также представлять собой «линейное антитело», например, как описано в U.S. Pat. No 5641870. Данные линейные фрагменты антитела могут являться моноспецифическими или биспецифическими.

Биспецифические антитела представляют собой антитела, обладающие связывающими специфичностями по меньшей мере для двух различных эпитопов. Примерные биспецифические антитела могут связывать два различных эпитопа одного и того же белка. Биспецифические антитела можно получить как полноразмерные антитела или фрагменты антитела (например, биспецифические антитела F(ab')₂). Они могут являться слитыми из различных цепей антитела или могут являться одноцепочечными. Одна тяжелая цепь может являться достаточной самостоятельно.

По одному способу получения биспецифических антител, биспецифический иммуноадгезин получают введением в клетку-хозяина последовательностей ДНК, кодирующих первый слитный белок, состоящий из первого связывающего домена, слитого с последовательностью константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина с отсутствующим участком связывания легкой цепи; второй слитный белок, состоящий из второго связывающего домена, слитого с последовательностью константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, сохраняющего участок связывания легкой цепи; и легкую цепь иммуноглобулина соответственно. Затем клетку-хозяина культивируют, так чтобы экспрессировать последовательности ДНК для получения смеси из (i) гетеротримера, содержащего первый слитный белок, ковалентно связанный с парой второй слитный белок - легкая цепь иммуноглобулина; (ii) гетеротетрамера, содержащего две ковалентно связанные пары второй слитный белок - легкая цепь иммуноглобулина; и (iii) гомодимера, содержащего две ковалентно связанные молекулы первого слитного белка. Смесь продуктов удаляют из культуры клеток и гетеротример отделяют от других продуктов. Данный способ описан в WO 94/04690. Дополнительные подробности получения биспецифических антител смотри, например, в Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

Согласно другому подходу, описанному в U.S. Pat. No 5731168, поверхность раздела между парой молекул антитела можно сконструировать, чтобы максимизировать процент гетеродимеров, выделяемых из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность раздела содержит по меньшей мере C_H3-домен константного домена антитела. По данному способу одну или несколько боковых цепей небольших аминокислот из поверхности раздела первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). Компенсаторные «впадины» идентичного или похожего размера с большой боковой цепью(цепями) создают на поверхности раздела второй молекулы антитела заменой больших боковых цепей аминокислот на меньшие (например, аланина или треонина). Это предоставляет механизм для увеличения выхода гетеродимера над другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифические антитела включают в себя перекрестно сшитые или «гетероконъюгированные» антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть соединено с авидином, другое с биотином. Данные антитела, например, предлагают для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (U.S. Pat. No 4676980), и для лечения инфекции HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 и EP 03089). Гетероконъюгированные антитела можно получить с применением любых подходящих способов перекрестного сшивания. Подходящие средства для перекрестного сшивания хорошо известны в данной области и описаны, например, в U.S. Pat. No 4676980, вместе с рядом способов перекрестного сшивания.

Способы получения биспецифических антител из фрагментов антитела также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получить с применением химической связи. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) описали способ, где интактные антитела протеолитически расщепляют для получения F(ab')₂