Способ ионообменного разделения метионина и глицина

Способ ионообменного разделения метионина и глицина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к способам разделения и выделения индивидуальных алифатических аминокислот из их смесей и может быть использовано в биохимической, фармацевтической и пищевой промышленности.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ классической ионообменной хроматографии [А.с. СССР N 979991, G01N 31/08, 1981], в основе которого лежит сорбция молекул вещества неподвижной фазой, обусловленная их электростатическим связыванием с поверхностью пористых гранул твердого гидрофильного сорбента, находящегося в контакте с раствором.

Недостатками являются использование для регенерации сорбента большого количества вспомогательных реактивов, наличие стадии предварительной подготовки растворов аминокислот перед пропусканием их через ионообменник и протекание в системе ионообменник - сорбент различных необменных взаимодействий, что осложняет процесс выделения аминокислот и приводит к большим объемам промывных вод и низкой эффективности разделения.

Техническая задача изобретения заключается в разработке способа ионообменного разделения метионина и глицина, позволяющего увеличить эффективность разделения смеси аминокислот, исключить из технологического процесса большое количество вспомогательных реактивов, уменьшить объемы и степень загрязнения сточных вод.

Для решения технической задачи изобретения предложен способ ионообменного разделения метионина и глицина, характеризующийся тем, что разделение алифатических аминокислот метионина и глицина осуществляют в две стадии, на первой стадии проводят сорбцию аминокислот с обогащением фазы сорбента глицином, а раствора на выходе - метионином, для этого готовят полиамфолит Purolite S950 в H⁺-форме, проводят сорбцию смеси двух алифатических аминокислот в противоточной колонне с неподвижным слоем сорбента, для этого снизу пропускают раствор, содержащий смесь глицина и метионина, при этом глицин сорбируется на полиамфолите Purolite S950, на выходе появляется метионин, водный раствор которого собирают в приемник на выходе из колонны, через некоторое время - смесь аминокислот, сорбцию останавливают, в течение сорбции производят отбор проб через определенные промежутки времени, контролируют суммарную концентрацию аминокислот йодометрическим методом, метионина - спектрофотометрическим методом, глицина - по разности концентраций: суммарной и метионина, степень разделения исходного раствора составляет 60%, на второй стадии проводят элюирование глицина раствором соляной кислоты pH 1,2 из сорбента с подачей сверху, элюат, содержащий глицин, собирают в приемник, степень концентрирования глицина составляет 70%, после десорбции глицина проводят полную десорбцию смеси аминокислот, полиамфолит принимает исходную форму и готов к работе, при этом также отбирают пробы через определенные промежутки времени и проводят анализ каждой пробы йодометрическим и спектрофотометрическим методами, для полного отделения глицина от метионина повторяют двустадийный процесс разделения смеси аминокислот, полученной на выходе из колонны.

Технический результат заключается в увеличении эффективности разделения смеси аминокислот, исключении из технологического процесса вспомогательных реактивов, повышении выхода аминокислот и уменьшении объемов промывных вод.

На фиг.1 представлены зависимости отношения концентрации аминокислоты в растворе на выходе из колонны к исходной концентрации (c/c₀) от времени сорбции (t, мин) метионина (кривая 1) и глицина (кривая 2) на Purolite S950 (H⁺) при 298 К и скорости пропускания 7 см³/мин.

На фиг.2 представлены зависимости отношения концентрации аминокислоты в элюате к концентрации в смоле (c/c₀) от времени десорбции (t, мин) глицина (кривая 1) и метионина (кривая 2) из Purolite S950 раствором соляной кислоты с рН 1,2 и скоростью пропускания 8 см³/мин.

Способ ионообменного разделения алифатических аминокислот глицина и метионина из водных растворов реализуют следующим образом.

Разделение аминокислот проводится в две стадии: первая стадия - сорбция смеси аминокислот с обогащением жидкой фазы метионином, а твердой фазы глицином, вторая стадия - элюирование с обогащением раствора глицином.

В колонну загружают полиамфолит Purolite S950; подготовку смолы осуществляют следующим образом: пропускают через слой ионообменника последовательно раствор КОН с концентрацией 0,5 моль/дм³, дистиллированную воду, раствор соляной кислоты с концентрацией 0,5 моль/дм³, воду до полного удаления соляной кислоты из межгранульного пространства, полиамфолит переведен в Н⁺-форму и готов к использованию; проводят сорбцию, для этого снизу пропускают раствор, содержащий смесь глицина и метионина, на выходе из колонны первым появляется метионин, через некоторое время - смесь аминокислот, степень разделения исходного раствора составляет 60%, сорбцию прекращают. В течение сорбции через определенные промежутки времени отбирают пробы раствора на выходе из колонны. Суммарную концентрацию аминокислот в растворе определяют йодометрическим методом. Концентрацию метионина в отобранных пробах определяют спектрофотометрическим методом. Концентрацию глицина рассчитывают по разнице между суммарной концентрацией аминокислот и метионина.

На второй стадии осуществляют десорбцию глицина из полиамфолита раствором соляной кислоты с pH 1,2 с подачей элюента сверху. Степень концентрирования глицина составляет 70%. В течение десорбции проводят анализ отобранных через определенные промежутки времени растворов йодометрическим и спектрофотометрическим методами. После элюирования глицина и смеси аминокислот полиамфолит принимает исходную форму и готов к работе.

Для более глубокого разделения аминокислот ионообменный цикл, состоящий из двух стадий, повторяют.

Использование сорбента полиамфолитной природы позволяет достичь высокой степени разделения алифатических аминокислот (глицина и метионина), которые имеют схожие физико-химические характеристики и различаются длиной углеводородного радикала. Объемы разделяемых растворов и исходная концентрация аминокислот могут быть различны, поэтому требуемая производительность ионообменников варьируется, в связи с этим характеристики ионообменных колонн (высота, диаметр, скорость подачи раствора, объем сорбента и т.д.) подбираются для каждого случая отдельно.

Способ ионообменного разделения метионина и глицина поясняется следующим примером.

Пример. Разделение аминокислот проводят из водного раствора с содержанием глицина 0,025 моль/дм³ и метионина 0,0026 моль/дм³, приготовленного растворением аминокислот марки «Reanal» в дистиллированной воде. Сорбцию и десорбцию глицина осуществляют на амфолите Purolite S950 в H⁺-форме в колоне с внутренним диаметром 56 мм и высотой 158 мм. В колонну загружают полиамфолит Purolite S950, пропускают через слой ионообменника раствор КОН с концентрацией 0,5 моль/дм³, затем дистиллированную воду, после нее раствор соляной кислоты с концентрацией 0,5 моль/дм³ и снова воду до полного удаления соляной кислоты из межгранульного пространства. На первой стадии разделения проводят сорбцию, подавая в колонну раствор аминокислот снизу вверх со скоростью 7 см³/мин. Отбор проб на выходе из колонны осуществляют через 10 мин с точно фиксируемым временем для дальнейшего построения выходных кривых. Данные о ходе сорбции смеси глицин-метионин из водного раствора представлены в таблице 1.

Определение суммарной концентрации аминокислот в элюате осуществляют йодометрическим титрованием. Для этого в мерную колбу на 50 см³ пипеткой вносят 5 см³ исследуемого щелочного раствора, содержащего аминокислоту. Из цилиндра приливают 30 см³ свежеприготовленного фосфата меди, содержимое колбы доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр с синей лентой. Фильтрат должен быть прозрачным. Затем 10 см³ фильтрата пипеткой вносят в коническую колбу, добавляют 0,5 см³ ледяной уксусной кислоты и 7 см³ 10% раствора йодида калия. После перемешивания выделившийся йод титруют из микробюретки раствором тиосульфата натрия с концентрацией 0,01 моль/дм³, прибавляя в конце титрования 1-2 капли свежеприготовленного раствора крахмала, точку эквивалентности определяют по исчезновению синей окраски.

Наличие метионина в отобранных пробах определяют спектрофотометрическим методом. Для этого в мерную колбу вносят объем раствора метионина, такой, чтобы его концентрация находилась в пределах градуировочного графика от 0,0005 до 0,001 моль/дм³, затем добавляют раствор азотной кислоты до pH 1 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Перед началом измерений на портативном спектрофотометре UVMini-1240 проводят калибровку прибора по дистиллированной воде. Затем в кювету наливают растворы, содержащие метионин (met), и измеряют оптическую плотность (A) в интервале длин волн от 190 до 250 нм. Для проверки соответствия максимума строят дифференциальный спектр поглощения, определяют оптическую плотность раствора при λ=211 нм. По градуировочной функции, построенной в координатах A=f(c_met), устанавливают концентрацию метионина и пересчитывают концентрацию в исходном растворе.

Концентрацию глицина в водном растворе определяют по разнице между суммарной концентрацией аминокислот и метионина. Результаты исследований представлены на фиг.1 и фиг.2.

Как видно на фиг.1, выделение метионина из раствора с глицином происходит в интервале времени от 110 до 175 мин от начала сорбции. Оптимальное время разделения глицина и метионина при сорбции составляет 150 мин от начала процесса, при этом степень разделения составляет 60%.

Процесс десорбции глицина из раствора с метионином осуществляется раствором соляной кислоты с концентрацией 0,1 моль/дм³, которая подается в колонну сверху вниз, со скоростью пропускания 8 см³/мин.

Контроль осуществляют отбором проб на выходе из колонны через каждые 10 мин и дальнейшим их анализом. Определения концентраций аминокислот осуществляют приведенным выше способом. Данные о ходе десорбции смеси глицин-метионин представлены в таблице 2.

Как видно из фиг.2, выходные кривые десорбции глицина и метионина расположены практически параллельно. Концентрирование глицина происходит на 70% в интервале времени элюирования от 40-110 мин.

При необходимости через колонну повторно пропускают смесь аминокислот, полученную ранее на выходе из колонны (содержащую глицин и оставшийся метионин). В результате на выходе получают раствор метионина, глицин сорбируется на смоле. После этого процесс элюирования глицина соляной кислотой и промывки сорбента водой повторяют.

Как видно из примера, таблиц и фигур, выделение метионина происходит на стадии сорбции смеси аминокислот, а выделение глицина - при элюировании, при этом ионит переходит в исходное рабочее состояние.

Предлагаемый способ ионообменного разделения метионина и глицина позволяет эффективно разделять алифатические аминокислоты - глицин и метионин из гидролизатов различного генезиса и биохимических сточных вод сочетанием процессов сорбции и десорбции, исключить стадию регенерации сорбента, использование значительного количества вспомогательных реактивов и стадию предварительной подготовки растворов аминокислот перед пропусканием через ионообменник, уменьшить объемы промывных вод.

Таблица 1
Способ ионообменного разделения метионина и глицина
№ пробы	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Время отбора, мин	95	112	132	162	215	250	265	270	275	285	300
Суммарная концентрация, моль/дм3	0	0,00001	0,0007	0,0017	0,0118	0,022	0,0236	0,0248	0,0256	0,0264	0,027
Концентрация метионина, моль/дм3	0	0,00001	0,0007	0,0017	0,00172	0,00219	0,00223	0,00218	0,00224	0,00205	0,00196
Концентрация глицина, моль/дм3	0	0	0	0	0,01	0,02	0,021	0,0226	0,023	0,024	0,025
Cгл/c0 гл	0	0	0	0	0,395	0,777	0,838	0,887	0,916	0,955	0,982
Cмет/c0 мет	0	0,004	0,28	0,68	0,84	0,88	0,89	0,87	0,89	0,82	0,79

Таблица 2
Способ ионообменного разделения метионина и глицина
Номер пробы	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Время отбора, мин	40	78	93	108	123	142	147	160	200
Суммарная концентрация, моль/дм3	0,03	0,02	0,0124	0,0076	0	-	-	-	-
Концентрация глицина, моль/дм3	0,025	0,017	0,01	0,0053	0,0012	0	-	-	-
Концентрация метионина, моль/дм3	0,0026	0,0026	0,0026	0,0025	0,0014	0,0008	0,0007	0,00002	0
Cсумм/c0 сумм	1	0,67	0,41	0,25	0	-	-	-	-
Cгл/c0 гл	1	0,68	0,4	0,212	0,048	0	-	-	-
Cмет/c0 мет	1	1	1	0,95	0,55	0,32	0,26	од	0

Способ ионообменного разделения метионина и глицина, характеризующийся тем, что разделение алифатических аминокислот метионина и глицина осуществляют в две стадии, на первой стадии проводят сорбцию аминокислот с обогащением фазы сорбента глицином, а раствора на выходе - метионином, для этого готовят полиамфолит Purolite S950 в Н⁺-форме, проводят сорбцию смеси двух алифатических аминокислот в противоточной колонне с неподвижным слоем сорбента, для этого снизу пропускают раствор, содержащий смесь глицина и метионина, при этом глицин сорбируется на полиамфолите Purolite S950, на выходе появляется метионин, водный раствор которого собирают в приемник на выходе из колонны, через некоторое время - смесь аминокислот, сорбцию останавливают, в течение сорбции производят отбор проб через определенные промежутки времени, контролируют суммарную концентрацию аминокислот иодометрическим методом, метионина - спектрофотометрическим методом, глицина - по разности концентраций: суммарной и метионина, степень разделения исходного раствора составляет 60%, на второй стадии проводят элюирование глицина раствором соляной кислоты с рН 1,2 из сорбента с подачей сверху, элюат, содержащий глицин, собирают в приемник, степень концентрирования глицина составляет 70%, после десорбции глицина проводят полную десорбцию смеси аминокислот, полиамфолит принимает исходную форму и готов к работе, при этом также отбирают пробы через определенные промежутки времени и проводят анализ каждой пробы иодометрическим и спектрофотометрическим методами, для полного отделения глицина от метионина повторяют двустадийный процесс разделения смеси аминокислот, полученной на выходе из колонны.