Ингибирование метастазов опухоли антителами против нейропилина-2

Ингибирование метастазов опухоли антителами против нейропилина-2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антагонистам нейропилина-2 (Nrp2), в частности к антителам против Nrp2, и к их использованию для профилактики и лечения метастазов опухоли.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время точно установлено, что ангиогенез участвует в патогенезе ряда расстройств. Такими расстройствами являются солидные опухоли и метастазы, атеросклероз, ретролентальная фиброплазия, гемангиомы, хроническое воспаление, внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как пролиферирующие ретинопатии, например диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), неоваскулярная глаукома, иммунное отторжение трансплантированной ткани роговицы и других тканей, ревматоидный артрит и псориаз. Folkman et al., J. Biol, Chem., 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); и Garner A., «Vascular diseases», In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp.1625-1710.

В случае роста опухоли ангиогенез, очевидно, является ключевым фактором, играющим важную роль в переходе гиперплазии в неоплазию и в обеспечении питательными веществами, необходимыми для роста и метастазирования опухоли. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). В отличие от нормальных клеток, для роста опухолевых клеток и для их автономной пролиферации необходима неоваскуляризация. Опухоли обычно образуются из одной аберрантной клетки, которая может пролиферировать лишь до определенного размера, составляющего несколько кубических миллиметров, что определяется ее расстоянием от капиллярного русла, и такая клетка может оставаться «спящей», то есть может не подвергаться дальнейшему росту и диссеминации в течение длительного периода времени. Затем некоторые опухолевые клетки переключаются на ангиогенный фенотип с последующей активацией эндотелиальных клеток, которые пролиферируют и созревают, образуя новые капиллярные кровеносные сосуды. Эти вновь образованные кровеносные сосуды обеспечивают не только постоянный рост первичной опухоли, но также диссеминацию и реколонизацию метастатических опухолевых клеток. В соответствии с этим наблюдается связь между плотностью микрососудов в срезах опухоли и выживаемостью больных раком молочной железы, а также с опухолями некоторых других типов. Weidner et al., N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992). Точный механизм регуляции переключения ангиогенеза пока еще хорошо не изучен, однако очевидно, что неоваскуляризация опухолевой массы обусловлена суммарным балансом множества стимуляторов и ингибиторов ангиогенеза (Folkman Nat. Med. 1(l):27-31 (1995)).

В настоящее время считается, что в случае солидных опухолей подавляющее большинство, а по оценкам специалистов 90% летальных исходов связаны с метастазами (Gupta and Massague, Cell 127, 679-695 (2006)). Сложный процесс образования метастазов состоит из ряда отдельных стадий, включающих отделение опухолевых клеток от первичной опухоли, интравазацию опухолевых клеток в лимфатические или кровеносные сосуды и экстравазацию и рост опухолевых клеток во вторичных участках. Анализ региональных лимфоузлов при опухолях многих типов позволяет предположить, что лимфатическая сосудистая сеть является важным каналом диссеминации злокачественных опухолей человека. Кроме того, почти при всех карциномах присутствие опухолевых клеток в лимфоузлах является наиболее важным отрицательным прогностическим фактором. Хотя ранее считалось, что такие метастазы образуются в результате прохождения злокачественных клеток по лимфатическим сосудам, уже существующим возле опухолей, однако недавно проведенные экспериментальные исследования и отчеты о клинических патологиях (описанные в публикации Achen et al., Br. J. Cancer 94 (2006), 1355-1360 и Nathanson, Cancer 98, 413-423 (2003)) позволяют предположить, что лимфангиогенез может быть индуцирован солидными опухолями и тем самым может стимулировать распространение этих опухолей. Эти и другие недавно проведенные исследования позволяют предположить, что направленное воздействие на лимфатические сосуды и лимфангиогенез может служить терапевтической стратегией ограничения развития метастазов рака, и такая стратегия должна обеспечивать значительный благоприятный эффект у большого числа пациентов.

VEGFC, который является членом семейства факторов сосудистых эндотелиальных клеток (VEGF), представляет собой один из наиболее хорошо изученных медиаторов развития лимфатических сосудов. Было обнаружено, что сверхэкспрессия VEGFC в опухолевых клетках стимулирует опухолевый лимфангиогенез, приводящий к усилению развития метастазов в региональных лимфоузлах (Karpanen et al., Faseb. J. 20, 1462-1472 (2001); Mandriota et al. EMBO J. 20, 672-682 (2001); Skobe et al., Nat. Med. 7, 192-198 (2001); Stacker et al., Nat. Rev. Cancer 2, 573-583 (2002); Stacker et al., Faseb. J. 16, 922-934 (2002)). Экспрессия VEGFC также коррелирует с опухолевым лимфангиогенезом и метастазами в лимфоузлах при различных злокачественных заболеваниях человека (как описано в публикации Achen et al., 2006, см. выше). Кроме того, было обнаружено, что блокада VEGFC-опосредуемой передачи сигнала приводит к подавлению опухолевого лимфангиогенеза и к развитию метастазов в лимфоузлах у мышей (Chen et al., Cancer Res 65, 9004-9011 (2005); He et al., J. Natl Cancer Inst 94, 8190825 (2002); Krishnan et al., Cancer Res 63, 713-722 (2003); Lin et al., Cancer Res 65, 6901-6909 (2005)).

Известно, что VEGFC связывается по меньшей мере с двумя рецепторами, относящимися к семейству рецепторов клеточной поверхности, такими как рецепторы тирозинкиназы VEGF и рецепторы нейропилина (Nrp).

VEGFC, один из трех рецепторов VEGF, может связываться с VEGFR2 и VEGFR3, что приводит к димеризации этого рецептора (Shinkai et al., J Biol Chem 273, 31283-31288 (1998)), к активации киназы и к его аутофосфорилированию (Heldin, Cell 80, 213-223 (1995); Waltenberger et al., J. Biol Chem 269, 26988-26995 (1994)). Фосфорилированный рецептор индуцирует активацию множества субстратов, что приводит к ангиогенезу и лимфангиогенезу (Ferrara et al., Nat. Med. 9, 669-676 (2003)).

Семейство нейропилинов (Nrp) состоит из двух гомологичных белков, нейропилина-1 (Nrp1) и нейропилина-2 (Nrp2). С Nrp2, помимо рецепторов VEGF, также связывается VEGFC, который был сначала идентифицирован как рецептор семафорина класса 3 и медиатор регуляции действия аксонов (Favier et al., Blood 108, 1243-1250 (2006); Soker et al., J. Cell Biochem. 85, 357-368 (2002)). Существует множество данных, указывающих на участие Nrp2 в развитии сосудистой и лимфатической систем. У гомозиготных мутантов по Nrp2 было показано значительное снижение числа мелких лимфатических сосудов и капилляров в пренатальном периоде (Yuan et al., Development 129, 4797-4806 (2002)). Кроме того, серьезные нарушения и дефекты, приводящие к гибели эмбриона, наблюдаемые у мутантных мышей, гомозиготных по Nrp1, усиливаются в результате потери функции Nrp2, что приводит к раннему летальному исходу (Takashima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 3657-3662 (2002)). Однако роль Nrp2 в модуляции биологических процессов в кровеносных и лимфатических сосудах у взрослых и, в частности, его роль в развитии метастазов пока еще неясны.

Нейропилины (Nrp) имеют короткие внутриклеточные домены, однако неизвестно, обладают ли они какой-либо ферментативной активностью или активностью в передаче сигнала. Было высказано предположение, что функция Nrp заключается в усилении передачи сигнала VEGFR за счет повышения уровня связывания рецептора VEGF с лигандом (Favier et al., 2006, см. выше; Soker et al., 2002, см. выше). Кроме того, было обнаружено, что sema3F, семафориновый лиганд Nrp2, модулирует поведение эндотелиальных клеток in vitro и in vivo (Bielenberg et al., J. Clin. Invest. 114, 1260-1271 (2004); Favier et al., Blood 1243-12503 (2006)). Однако недавно появившиеся сообщения позволяют высказать другое предположение, а именно что Nrp могут функционировать независимо от рецепторов VEGF либо семафорин действует как модулятор миграции эндотелиальных клеток (EC) (Murga et al., Blood 105, 1992-1999 (2005); Pan et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007); Wang et al., J Biol Chem 278, 48848-48860 (2003)).

Антитела, нейтрализующие VEGF, подавляют рост различных опухолевых клеточных линий человека у «голых» мышей (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995); Borgström et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-924 (1996)), а также ингибируют внутриглазной ангиогенез у моделей с ишемической ретинопатией (Adamis et al., Arch. Ophthalmol 114:66-71 (1996)). Поэтому моноклональные антитела против VEGF и другие ингибиторы действия VEGF являются перспективными кандидатами для лечения опухолей и различных внутриглазных неоваскулярных заболеваний. Такие антитела описаны, например, в EP 817648, опубликованном 14 января 1998; и в заявках WO 98/45331 и WO 98/45332, опубликованных 15 октября 1998. Одно из таких антител против VEGF, а именно бевацизумаб, было разрешено Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA) для использования в комбинации с химиотерапией для лечения метастазирующего рака прямой и ободочной кишки (CRC) и немелкоклеточного рака легких (NSCLC). В настоящее время проводится большое число клинических испытаний по применению бевацизумаба для лечения различных злокачественных опухолей.

Специалистам известны также и другие антитела против VEGF и антитела против Nrp1, которые описаны, например, в публикациях Liang et al., J. Mol. Biol. 366, 815-829 (2007); Pan et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007); и Liang et al., J. Biol. Chem. 281, 951-961 (2006).

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на экспериментальных данных, полученных для высокоаффинного антитела, блокирующего функцию Nrp2. Результаты, полученные для этого антитела, показали, что Nrp2 играет определенную роль в модуляции миграции лимфатических эндотелиальных клеток (LEC) и что его функция выходит за пределы ранее приписываемой ей роли усилителя активации рецептора VEGF. Кроме того, полученные результаты продемонстрировали, что блокирование Nrp2 приводит к ингибированию лимфангиогенеза и значительному снижению метастазов в лимфоузлах и дистальных органах.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования миграции эндотелиальных клеток лимфатических сосудов, включающему введение млекопитающему, при необходимости, эффективного количества антагониста нейропилина-2 (Nrp2).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования опухолевого лимфангиогенеза, включающему введение млекопитающему с опухолью эффективного количества антагониста нейропилина-2 (Nrp2).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазов опухоли, включающему введение млекопитающему с опухолью эффективного количества антагониста нейропилина-2 (Nrp2).

Во всех вариантах изобретения предпочтительным млекопитающим является человек, такой как больной со злокачественной опухолью, у которого могут быть диагностированы метастазы или который может иметь риск развития метастазов.

В одном из вариантов изобретения злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из карциномы, лимфомы, бластомы, саркомы и лейкоза.

В другом варианте изобретения злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из плоскоклеточного рака, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких, аденокарциномы легких, плоскоклеточной карциномы легких, перитонеального рака, гепатоцеллюлярного рака, рака желудка, рака желудочно-кишечного тракта, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатомы, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака прямой и ободочной кишки, карциномы эндометрия или матки, карциномы слюнных желез, рака почек или ренального рака, рака печени, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, карциномы печени и рака головы и шеи различных типов, В-клеточной лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL); острого лимфобластного лейкоза (ALL);

волосато-клеточного лейкоза; хронического миелобластного лейкоза; лимфопролиферирующего расстройства после трансплантации (PTLD), патологической пролиферации сосудов, связанной с факоматозом, отеков, связанных с опухолями головного мозга, и синдрома Мейгса.

В еще одном варианте изобретения В-клеточная лимфома выбрана из группы, состоящей из низкозлокачественной/фолликулярной не-ходжкинской лимфомы (NHL); мелкоклеточной лимфоцитарной (SL) NHL; NHL средней стадии дифференцировки/фолликулярной NHL; диффузной NHL средней стадии дифференцировки; высокозлокачественной иммунобластной NHL; высокозлокачественной лимфобластной NHL; высокозлокачественной мелкоклеточной недифференцированной NHL; генерализованной NHL; лимфомы клеток коры головного мозга; лимфомы, связанной со СПИД; и макроглобулинемии Вальденстрема.

Антагонистами Nrp2 могут быть, но ими не ограничиваясь, антитело против Nrp2, включая антитела против Nrp2B и Nrp2A, такие как, например, антитела YW68.4.2, YW68.4.2.36, YW126.20, и их фрагменты и варианты, такие как аффинно-зрелые варианты.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу против Nrp2B, содержащему последовательность вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из YW68.4.2, YW68.4.2.36, и его фрагменту или варианту.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу против Nrp2A, содержащему последовательности вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепи YW126.20, или его фрагменту или варианту.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей антитело по любому из пп.33-38 формулы изобретения в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения метастазов опухолей, содержащей эффективное количество антагониста Nrp2 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

В других аспектах настоящее изобретение относится к антагонистам Nrp2, которые могут быть использованы для профилактики или лечения метастазов, и к применению антагонистов Nrp2, таких как антитела против Nrp2, для профилактики или лечения метастазов опухоли.

Краткое описание графического материала

Фигура 1. Характеристика моноклональных антител (mAb) против Nrp2^B (анти-Nrp2^B mAb). (A) Схематически представлена локализация Sema- и VEGF-связывающей области на Nrp2 по отношению к областям эпитопов для антитела против Nrp2^B. (B) ELISA-анализ, демонстрирующий связывание антитела против Nrp2^B с ECD hNrp2 (заштрихованные квадраты) и доменами B1-B2 hNrp2 (заштрихованные кружки), но не с ECD hNrp1 (незаштрихованные квадраты) или с доменами A1-A2 hNrp2 (незаштрихованные кружки). (C) Блокирование связывания VEGFC с Nrp2 под действием антитела против Nrp2^B. mAb в возрастающих количествах предварительно инкубировали в планшетах, покрытых ECD Nrp2 человека (5 мкг/мл), в течение 1-2 часов, а затем добавляли предварительно оттитрованный биотинилированный VEGFC человека (1 нМ) в течение 15 минут. Процент связанного VEGFC определяли с использованием конъюгатов «стрептавидин-HRP (ПХ)». (D) Блокирование связывания VEGF₁₆₅ с Nrp2 под действием антитела против Nrp2^B. (Е) Блокирование связывания Sema3F с LEC. LEC инкубировали с кондиционированной средой, содержащей Sema3F, связанный со щелочной фосфатазой (AP) (REF), в присутствии или в отсутствие антитела против Nrp2^B. AP-активность связанного с AP Sema3F детектировали колориметрически с одновременным проявлением. Какого-либо связывания с AP не наблюдалось (левая панель). Антитело против Nrp2^B не блокировало связывания Sema3F с LEC (средние панели). ECD Nrp2 использовали в качестве положительного контроля для блокирования связывания (правая панель). Масштабная шкала.

Фигура 2. Антитело против Nrp2^B подавляет VEGFC-индуцированную функцию in vitro и in vivo. (A) Примеры изображения окрашенных LEC, мигрирующих в ответ на действие 200 нг/мл VEGFC в течение 18 часов в присутствии или в отсутствие антитела против Nrp2^B (50 мкг/мл) или ECD VEGFR3 (50 мкг/мл). (B) Количественная оценка миграции LEC в ответ на действие 200 нг/мл VEGFC (n=6 для каждого условия эксперимента). (C) Количественная оценка миграции LEC в ответ на действие 10 нг/мл VEGF₁₆₅ в присутствии или в отсутствие антитела против Nrp2^B (50 мкг/мл) или ECD VEGFR3 (50 мкг/мл). N=6 для каждого условия эксперимента. (D) Количественная оценка числа пикселей, проводимая с помощью анализа микрокармана роговицы и описанная в (E). *p<0,05. (E) Примеры изображения LYVE-1-окрашенной роговицы, иллюстрирующие действие 150 нг гранул VEGFC (P) внутри роговицы и системного введения антитела против Nrp2^B (10 мг/кг, два раза в неделю) или ECD VEGFR3 (25 мг/кг, два раза в неделю). Для облегчения визуализации проводили LYVE-1-окрашивание, которое давало псевдоокраску красным, *p<0,05; величина ошибки представлена в виде стандартной ошибки среднего.

Фигура 3. Обработка Nrp2^B приводит к снижению активации VEGF-рецептора и к ингибированию образования комплекса Nrp2/VEGF-рецептор. (A) FACS-анализ уровней Nrp2, VEGFR2 и VEGFR3 на поверхности LEC после обработки контрольным антителом (10 мкг/мл; зеленая линия) или антителом против Nrp2^B (10 мкг/мл) в течение 5 минут (синяя линия) или в течение 20 часов (красная линия). (B) Количественная оценка миграции LEC в ответ на действие 20 нг/мл HGF в присутствии или в отсутствие антитела против Nrp2^B (50 мкг/мл) или ECD VEGFR3 (50 мкг/мл). N=6 для каждого условия эксперимента. (C) Уровень фосфорилирования VEGFR2 в LEC, детектированный путем ELISA-анализа с использованием антител, которые распознают общий или фосфорилированный по тирозину VEGFR2. VEGFC (в указанной концентрации) добавляли в течение 10 минут в присутствии или в отсутствие антитела против Nrp2^B (10 мкг/мл) или ECD VEGFR3 (10 мкг/мл) для индуцирования фосфорилирования VEGFR2, n=3 для каждого условия эксперимента. Уровень фосфорилирования VEGFR2 в клетках, обработанных антителом против Nrp2^B (10 мкг/мл), значительно отличался от уровня фосфорилирования VEGFC, стимулированного при 200 нг/мл, и постоянно составлял в пределах от уровня фосфорилирования, индуцированного 175 нг/мл, до уровня фосфорилирования, индуцированного 150 нг/мл VEGFC. (D) Количественная оценка миграции LEC в ответ на VEGFC (в указанной концентрации) в присутствии или в отсутствие антитела против Nrp2^B (10 мкг/мл) или ECD VEGFR3 (10 мкг/мл). Значительное снижение уровня миграции наблюдалось при 50 нг/мл VEGFC или при блокировании под действием ECD VEGFR3. *p<0,05; величина ошибки представляет собой стандартную ошибку среднего. Каждый эксперимент повторяли минимум три раза. (E) CO-IP.

Фигура 4. Nrp2 экспрессируется в лимфатических сосудах мышей с опухолью. (A-D) окрашивание LYVE-1 (левая колонка - красный) для мечения лимфатических сосудов, окрашивание Nrp2 (средняя колонка - зеленый) и перекрывание (A) в тонком кишечнике и (B) в лимфоузлах здоровой взрослой мыши. Сигнал Nrp2 не совпадает с локализацией LYVE-1-меченных лимфатических сосудов в любом органе. Окрашивание Nrp2 воспалительных клеток редко наблюдалось в фибростромальном ядре кишечных ворсинок и в зародышевых центрах лимфатических узлов. (C) В лимфатических узлах животных с опухолями сигнал Nrp2 не совпадает с локализацией LYVE-1-положительных лимфатических сосудов, выстилающих LN-синусы. Наблюдалось также дополнительное окрашивание Nrp2 воспалительных клеток. (D) Интенсивное окрашивание Nrp2 также наблюдалось в лимфатических сосудах опухолей 66cl4. На опухолевых клетках также можно было наблюдать слабое мембранное окрашивание. На второй день только окрашенный контроль не обнаруживал какого-либо сигнала. Области, обрамленные рамкой, показаны в виде вставки с большим увеличением. Масштабная шкала *** для A-C и ** для D.

Фигура 5. Обработка антителом против Nrp2^B приводила к снижению числа метастазов в легких у модели с опухолью 66c14. (A) Ниже проанализирован график среднего объема опухоли 66c14, построенный при исследовании на модели с указанной опухолью. Животным два раза в неделю i.p. вводили дозу 10 мг/кг антитела против Nrp2^B или контрольного антитела после достижения среднего размера опухоли 100 мм³, и такую дозу вводили на протяжении всего исследования. (B) Количественную оценку проводили путем визуального наблюдения числа узлов с метастазами на одно легкое у животных, обработанных контролем и антителом против Nrp2^B. (C) Примеры изображения легких для животных, обработанных контролем (слева) и антителом против Nrp2^B (справа). Перед фиксацией легкие раздували путем перфузии правого желудочка сердца. Для облегчения визуализации узлы помечали белым цветом. (D, E) Пример трехмерного изображения легких, сканированных с помощью микро-KT (компьютерной томографии), иллюстрирующего узлы с метастазами (красным) у животных, обработанных контролем (D) и антителом против Nrp2^B (E). Положения продольного среза (верхняя вставка) и поперечного среза (нижняя вставка) показаны черными и красными пунктирными линиями соответственно. Этот анализ подтвердил, что большинство узлов находится на поверхности легких. (F) Количественная оценка числа узлов с метастазами на легкое, проводимая с помощью микро-KT-анализа легких. (G) FACS-анализ in vitro уровней Nrp2 на поверхности культивированных опухолевых клеток 66c14. (H) окрашивание H&E узлов легких, иллюстрирующих опухолевые клетки с метастазами. Величина ошибки представлена в виде стандартной ошибки среднего. Масштабная шкала *** для C и ** для H.

Фигура 6. Обработка антителом против Nrp2^B приводила к снижению числа метастазов в легких у модели с опухолью С6. (A) Ниже проанализирован график среднего объема опухоли С6, построенный при исследовании на модели с указанной опухолью. Животным два раза в неделю i.p. вводили дозу антитела против Nrp2^B (10 мг/кг), ECD VEGFR3 (25 мг/кг) или контрольного антитела (10 мг/кг) после достижения среднего размера опухоли 100 мм³, и такую дозу вводили на протяжении всего исследования. (B) Количественную оценку проводили путем визуального наблюдения числа узлов с метастазами на легкое у животных, обработанных контролем, ECD VEGFR3 и антителом против Nrp2^B. (C) Примеры изображения легких животных, обработанных контролем (слева), ECD VEGFR3 (в середине) и антителом против Nrp2^B (справа). Перед фиксацией легкие раздували путем перфузии правого желудочка сердца. Для облегчения визуализации узлы помечали белым цветом. (D) Пример трехмерного изображения легких, сканированных с помощью микро-KT (компьютерной томографии), иллюстрирующего узлы с метастазами (красным) у животных, обработанных контролем (слева) и антителом против Nrp2^B (справа). Положения продольного среза (верхняя вставка) и поперечного среза (нижняя вставка) показаны черными и красными пунктирными линиями, соответственно. Этот анализ подтвердил, что большинство узлов находится на поверхности легких. (Е) FACS-анализ уровней Nrp2 на поверхности in vitro культивированных опухолевых клеток 66c14. (F) окрашивание H&E узлов легких, демонстрирующее опухолевые клетки с метастазами. Величина ошибки представлена в виде стандартной ошибки среднего. Масштабная шкала *** для C и ** для F.

Фигура 7. Обработка антителом против Nrp2^B приводила к уменьшению числа опухолевых лимфатических сосудов. (A, B) Количественная оценка плотности сосудистой системы (А), детектируемой с помощью IHC PECAM-1, и плотности лимфатических сосудов (В), детектируемой с помощью IHC LYVE-1 в опухолях 66cl4, обработанных контрольным антителом или антителом против Nrp2^B. Плотность сосудов определяли по 6 примерам изображений, полученных для каждой из 6 опухолей на группу и оцениваемых по среднему числу пикселей с помощью ImageJ. (C) Примеры изображений окрашенных PECAM-1 сосудов (верхний ряд) и окрашенных LYVE-1 лимфатических сосудов (средний и нижний ряды) в опухолях C6, обработанных контрольным антителом (левый столбец), ECD VEGFR3 (средний столбец) или антителом против Nrp2^B (правый столбец). Области в рамке, показанные в среднем ряду, представлены с большим увеличением в нижнем ряду. Справа от этих изображений приводится количественная оценка плотности сосудистой системы (верхний график) и плотности лимфатических сосудов (нижний график). (D) окрашенные LYVE-1 опухоли, собранные у животных, обработанных антителом против Nrp2^B (нижние панели) на день 4 (сбор 1) и на день 11 (сбор 2), демонстрируют разрушение лимфатических сосудов по сравнению с лимфатическими сосудами, собранными у животных, обработанных контролем (верхние панели). Слева представлены кривые роста в зависимости от времени сбора. Величина ошибки представлена в виде стандартной ошибки среднего. Масштабная шкала ***.

Фигура 8. Обработка антителом против Nrp2^B приводила к уменьшению числа функциональных лимфатических сосудов опухоли и к замедлению развития метастазов в первичном лимфоузле. (A, B) После внутрикожной лимфангиографии полистирольные флуоресцентные микросферы (зеленые) наблюдались исключительно в лимфатических сосудах, меченных LYVE-1 IHC (красные). Области в рамке на фигуре A представлены на фигуре В с большим увеличением. (C-D) Обработка антителом против Nrp2^B приводила к уменьшению интенсивности Эванса голубого в опухолях C6 (C) (P=0,035) и 66cl4 (D) (P=0,005), что указывает на уменьшение числа функциональных лимфатических сосудов в этих обработанных опухолях. (E) Процент животных с небольшими лимфоузлами (SLN), содержащими β-gal-экспрессирующие опухолевые клетки C6, в различные периоды времени после имплантации опухоли в уши мышей, обработанных контролем (черные) и антителом против Nrp2^B (красные). Обработка антителом против Nrp2^B приводила к замедлению поступления клеток в SLN (p=0,006). Число животных на каждое условие обработки в каждый период времени составляло 7 (N=7).

Фигура 9. Экспрессия Nrp2 в различных злокачественных опухолях человека. (A-F) Данные микромассива Affymetrix HG-U133A и B GeneChip® для оценки уровня экспрессии Nrp2 в здоровой толстой кишке и в аденокарциноме прямой и ободочной кишки (A), в здоровых тканях головы и шеи и в плоскоклеточной карциноме головы и шеи (B), в здоровой поджелудочной железе и в аденокарциноме поджелудочной железы (C), в здоровой коже и в злокачественной меланоме (D), в здоровой щитовидной железе и в папиллярной карциноме щитовидной железы (E), и в здоровой молочной железе и в Her2-инфильтрирующей аденокарциноме протоков (F). Каждый период времени представлен для одного пациента.

Фигура 10. Аминокислотная последовательность Fab-фрагментов антитела против Nrp2^B YW68.4.2 и YW68.4.2.36.

Фигура 11. Аминокислотная последовательность Fab-фрагмента антитела против Nrp2^A YW126.20.

Фигура 12. Выравнивание последовательностей вариабельного домена легкой цепи антитела против Nrp2^A YW126.20 с последовательностью κ1 человека.

Фигура 13. Выравнивание последовательностей вариабельного домена легкой цепи антитела против Nrp2^A YW126.20 с последовательностью III (hum III) человека.

Дополнительная фигура 1. FACS-анализ уровней рецепторов для VEGF всех типов на поверхности in vitro культивированных LEC. FACS-анализ Nrp1, Nrp2, VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3 на культивированных LEC.

Дополнительная фигура 2. Антитело против Nrp2^B не блокирует индуцированную VEGF₁₆₅ миграцию. (A-B) Количественная оценка клеток HUVEC (A) и LEC (B), мигрирующих в ответ на 200 нг/мл VEGF в течение 18 часов в присутствии или в отсутствие антитела против Nrp1^B, антитела против Nrp2^B (50 мкг/мл) или обоих антител (50 мкг/мл). *p<0,05. Величина ошибки представлена в виде стандартной ошибки среднего.

Дополнительная фигура 3. Влияние антитела против Nrp2^B на опосредуемую VEGFC пролиферацию, сосудистую проницаемость и связанную VEGFC передачу внутриклеточного сигнала. (A) Количественная оценка пролиферации LEC, индуцированной 200 нг/мл VEGFC в присутствии или в отсутствие антитела против Nrp2^B (50 мкг/мл) или ECD VEGFR3 (50 мкг/мл), как было определено по включению BrdU (n=6 на одно условие эксперимента). (B) Анализ сосудистой проницаемости кожи мышей. Изображения получали для кожи одного и того же животного. Синяя окраска указывает на утечку Эванса голубого из сосудистой системы в ответ на чрескожную доставку VEGFC после системной обработки антителом против Nrp2^B (10 мг/кг) или ECD VEGFR3 (25 мг/кг). (C) Количественная оценка красителя Эванса голубого, экстрагированного из образцов кожи в анализе на проницаемость. Указанные величины представляют собой средние величины, полученные для 6 независимых экспериментов. *p<0,05; величина ошибки представлена в виде стандартной ошибки среднего.

Дополнительная фигура 4. Антитело против Nrp2^B не блокирует индуцированный Sema3F коллапс конуса роста. (A) Изображения конусов роста гиппокампа E17.5, окрашенных фаллоидином, конъюгированным с родамином. В контрольных конусах роста обнаружены крупные, богатые актином структуры на окончании каждого аксона, которые уменьшались после обработки Sema3F. Антитело против Nrp2^B (50 мкг/мл) не блокирует такой коллапс. В противоположность этому, ECD Nrp2 (10 мкг/мл) блокирует такой коллапс. (B) Контроль качества для иммуногистохимического анализа с использованием антитела против Nrp2. Изображение представляет фаговый клон, который распознает Nrp2, функционирующий в IHC на свежезамороженных срезах. Уровень экспрессии белка Nrp2 аналогичен уровню экспрессии Nrp2, наблюдаемому с использованием in situ гибридизации (Chen et al., Neuron 19, 547-559 (1997)). Это антитело было затем использовано для иммуногистологического анализа (IHC) на свежезамороженных срезах опухоли. Масштабная шкала для главного изображения = **мкм и для изображений вставки = **мкм.

Подробное описание изобретения

Определения

Термины «нейропилин», «NRP» или «Nrp» являются взаимозаменяемыми и означают нейропилин-1 (NRP1, Nrp1), нейропилин-2 (NRP2, Nrp2) и их изоформы и варианты, описанные в публикации Rossignol et al. (2000) Genomics 70:211-222. Нейропилины представляют собой не-тирозинкиназные рецепторы размером 120-130 кДа. Существует множество сплайсированных вариантов и растворимых изоформ NRP-1 и NRP-2. Основная структура нейропилинов включает пять доменов: три внеклеточных домена (a1a2, b1b2 и c), трансмембранный домен и цитоплазматический домен. Домен a1a2 гомологичен компонентам комплемента C1r и C1s (CUB), которые обычно содержат четыре цистеиновых остатка, образующие два дисульфидных мостика. Домен b1b2 гомологичен факторам свертывания крови V и VIII. Центральная часть домена с обозначена MAM, что обусловлено ее гомологией с меприном, A5 и рецепторными белками тирозинфосфатазы µ. Домены a1a2 и b1b2 ответственны за связывание с лигандом, а домен с играет решающую роль в гомодимеризации или гетеродимеризации. Gu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277; 18069-76; He and Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-51.

Термин «опосредуемая нейропилином биологическая активность» означает, в основном, физиологические или патологические события, в которых важную роль играют нейропилин-1 и/или нейропилин-2. Неограничивающими примерами таких активностей являются регуляция аксонов в процессе развития эмбриональной нервной системы или регенерации нейронов, ангиогенез (включая моделирование сосудов), онкогенез и образование метастазов опухоли.

Используемый в настоящем описании термин «опосредуемая нейропилином-2 биологическая активность» или «опосредуемая Nrp2 биологическая активность» означает, в основном, физиологические или патологические события, в которых важную роль играет Nrp2, например, такие как усиление активации рецептора VEGF и, в частности, способность модулировать миграцию эндотелиальных клеток (EC) лимфатических сосудов, лимфангиогенез у взрослых, в частности лимфангиогенез и образование метастазов опухоли.

Используемый в настоящем описании термин «антитело» используется в самом широком смысле, и, в частности, термин охватывает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают нужной биологической активностью.

Используемый в настоящем описании термин «моноклональное антитело» означает антитело, полученное из популяции, в основном, гомогенных антител, то есть отдельных антител, входящих в эту популяцию и являющихся идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются в высокой степени специфическими и нацелены на одну антигенную детерминанту. Кроме того, в отличие от стандартных препаратов (поликлональных) антител, которые обычно содержат различные антитела, нацеленные на различные детерминанты (эпитопы), каждое моноклональное антитело нацелено на одну детерминанту антигена. Термин «моноклональный» указывает на тип антитела, полученного по существу из гомогенной популяции антител, но этот термин не подразумевает, что это антитело должно быть получено каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с помощью гибридомной технологии, впервые описанной Kohler et al. (1975) Nature 256:495, или методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть также выделены из фаговых библиотек антител методами, описанными, например, Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 и Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597.

Представленные в настоящем описании моноклональные антитела, в частности, включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой цепи и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям, присутствующим в антителах конкретного вида или принадлежащим конкретному классу или подклассу антител, а остальная часть этой(их) цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям, присутствующим в антителах другого вида или принадлежащим другому классу или подклассу антител; а также фрагменты этих антител, при условии, что они обладают нужной биологической активностью (см. патент США № 4816567; и Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851-6855).

«Гуманизованные» формы не-человеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность не-человеческого иммуноглобулина. По большей части, гуманизованные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитела-реципиенты), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области не-человеческого антитела (донорного антитела), такого как антитело мыши, антитело крысы, антитело кролика или антитело примата, не являющегося человеком, которое имеет нужную специфичность, аффинность или функцию. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) иммуноглобулина человека могут быть заменены соответствующими не-человеческими остатками. Кроме того, гуманизованные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в антителе-реципиенте или в донорном антителе. Такие модификации могут быть введены для дополнительного улучшения функции антитела. Как правило, гуманизованное антитело может содержать по существу весь по меньшей мере один, а обычно два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные петли, соответствующие петлям не-человеческих иммуноглобулинов, и все или по существу все области FR являются последовательностями иммуноглобулина человека. Гуманизованное антитело может также, но необязательно, содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Более подробное описание см. в публикации Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; и Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

Термин «видоспецифическое антитело» означает антитело, которое обладает более высокой аффинностью связывания с антигеном млекопитающего первого вида, чем с гомологом антигена млекопитающего другого вида. Обычно видоспецифическое антитело «специфически связывается» с антигеном человека (то есть имеет величину аффинности связывания (K_d), составляющую не более чем примерно 1×10^-7 M, предпочтительно не более чем примерно 1×10^-8 M и наиболее предпочтительно не более чем примерно 1×10^-9 M), но имеет аффинность связывания с гомологом антигена млекопитающего, не являющегося человеком, другого вида, которая по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 500 раз, или по меньшей мере примерно в 1000 раз меньше аффинности связывания с антигеном человека. Видоспецифическое антитело может представлять собой антитело любого типа, определенного выше, и предпочтительным является гуманизованное антитело или антитело человека.

Используемый в настоя