Соль алискирена и серной кислоты
Настоящее изобретение относится к новой соли алискирена, - гидросульфату алискирена в кристаллической или сольватированной форме, а также к ее получению и применению в качестве лекарственного средства или активного ингредиента в фармацевтической композиции. 4 н. и 3 з.п. ф-лы.
Реферат
Изобретение относится к новой соли ингибитора ренина 2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(3-амино-2,2-диметил-3-оксопропил)-2,7-ди(1-метилэтил)-4-гидрокси-5-амино-8-[4-метокси-3-(3-метоксипропокси)фенил]октанамиду формулы
Указанное соединение (МНН - алискирен) подробно описано в ЕР 678503 А.
Активный ингредиент алискирен является свободным основанием, которое подробно описано в ЕР 678503 А и которое содержит одну основную аминогруппу в положении 5, рКа 9,79. Таким образом, одна кислотная группа может связываться с неразделенной парой электронов аминогруппы.
В патенте ЕР 678503 А в качестве специфических солей алискирена описаны гидрохлорид (пример 137) и полуфумарат (пример 83). Однако в этом документе свойства указанных солей подробно не описаны. В то же время активный ингредиент алискирен в форме полуфумарата предлагается использовать в качестве антигипертензивного агента. Полуфумарат, в отличие от свободного основания и гидрохлорида, характеризуется более простой обработкой, способен по крайней мере частично кристаллизоваться и является более доступным. Кроме того, в данной области техники известно, что сильные кислоты, в отличие от слабых кислот, не образуют стабильной соли алискирена.
Температура плавления полуфумарата в открытом тигле составляет 96,6°С (скорость нагрева 10 К/мин), а энтальпия плавления 28,9 Дж·г-1.
При обработке полуфумарата алискирена возникают значительные трудности. Обычно при получении галеновых составов, включающих полуфумарат алискирена, требуется высокое содержание лекарственной субстанции (ЛС), что создает проблемы при формировании таблеток.
Например, полуфумарат алискирена образует иглообразные кристаллы, что отрицательно влияет на объемные свойства ЛС, например, на текучесть и объемную плотность. ЛС характеризуется нестабильностью при прессовании, что приводит к ослаблению связей между частицами и изменению полиморфизма под давлением и/или аморфизации при прессовании. Полуфумарат алискирена содержит высокоэластичный компонент, что также приводит к ослаблению связей между частицами. В связи с высокой дозой (от 300 до 600 мг свободного основания в таблетке) возникает необходимость в высоком содержании ЛС при получении таблеток приемлемого размера.
Качество ЛС значительно изменяется и влияет на условия переработки ЛС в таблетки, например, распределение частиц по размеру, объемная плотность, текучесть, свойства при увлажнении, площадь поверхности и адгезивные свойства. Кроме того, алискирен является высокогигроскопичным. При контактировании с водой полиморфные формы ЛС превращаются в аморфные формы, что снижает стабильность по сравнению с кристаллической формой. Комбинация этих ограничений приводит к возникновению значительных трудностей при получении стандартных таблеток.
Прямое прессование является непригодным для стандартного получения по причине, например, высокой гигроскопичности, иглообразной формы частиц, низкой текучести, что приводит к проблемам при переработке и равномерном распределении дозы. Способ ротационного прессования приводит к снижению насыпного объема ЛС. Более того, предварительное прессование ЛС в процессе ротационного прессования приводит к значительным трудностям и не позволяет при дальнейшем прессовании получать таблетки с достаточной твердостью и низкой хрупкостью в отсутствие высокого содержания эксципиентов, что связано с низкой способностью ЛС к прессованию. Установлено, что невозможно получить стандартные таблетки с содержанием алисрикена более приблизительно 35% (например, с достаточной твердостью и низкой хрупкостью) и использовать стандартный процесс переработки в таблетки (например, проблемы, связанные с прилипанием к пресс-форме и извлечением из нее в процессе ротационного прессования и таблетирования).
Как указано выше, в связи с низкой кристаллизуемостью, гигроскопичностью и относительно низкой стабильностью, прежде всего в присутствии влаги, усложняется способ получения, прежде всего при выделении конечного продукта. Из-за указанных выше нежелательных свойств полуфумарата алискирена возрастает продолжительность процессов фильтрации и высушивания. Полуфумарат алискирена также чувствителен к процессу грануляции.
Следовательно, несмотря на широкую распространенность алискирена в медицине, указанные нежелательные свойства значительно снижают экономичность способа его получения. В связи с этим существует необходимость в получении более стабильных, например, кристаллических форм алискирена, которые существенно упростят процессы высушивания, фильтрования или грануляции после завершения химического синтеза, а также на следующей стадии переработки в фармацевтические составы. Было предпринято множество неудачных попыток поиска улучшенных форм соли, т.е. в значительной степени кристаллических, а также физически и химически стабильных. Только соль по настоящему изобретению, ее сольваты и полиморфные формы характеризуются необходимыми улучшенными свойствами.
Было установлено, что образование солей алискирена с необходимыми преимуществами представляет проблему. В большинстве случаев образуются, например, аморфные соли с низкой стабильностью (такие как твердые пены, воски или масла). Авторами в результате интенсивных исследований было установлено, что соль алискирена по настоящему изобретению характеризуется значительными преимуществами по сравнению с полуфумаратом алискирена.
Настоящее изобретение относится к соли соединения формулы I
и серной кислоты, или, соответственно, к их аморфной форме, сольвату, прежде всего, гидрату, а также к полиморфной форме.
Предпочтительными солями алискирена являются, например, сульфат (SO4 2-) и гидросульфат (HSO4 -). В случае сульфата две молекулы алискирена связаны с одной молекулой сульфата. В случае гидросульфата одна молекула алискирена связана с одной молекулой гидросульфата. Наиболее предпочтителен гидросульфат алискирена.
Предпочтительные соли, выбирают из группы, включающей
соль алискирена в аморфной форме, или
соль алискирена в кристаллической или частично кристаллической форме, прежде всего в их сольватной форме.
Соль по изобретению существует предпочтительно в предварительно очищенной и в значительной степени очищенной форме, например, чистота которой составляет >95%, предпочтительно >98%, более предпочтительно >99%. Энантиомерная чистота солей по настоящему изобретению составляет >98%, предпочтительно >99%.
Неожиданно было установлено, что по сравнению с полуфумаратом, соль по изобретению, включая ее аморфные формы, сольваты, такие как гидраты соли, а также их соответствующие полиморфные формы, характеризуются улучшенными свойствами. При указанных условиях соль, прежде всего, кристаллическая соль и частично кристаллическая соль, включая сольваты соли, характеризуются четкой температурой плавления, что связано с высокой эндотермической энтальпией плавления. Соль по изобретению, прежде всего, кристаллическая форма или частично кристаллическая форма характеризуются стабильностью и более высоким качеством по сравнению с полуфумаратом алискирена в процессе хранения и транспортировки.
Кроме того, обе формы соли по изобретению как кристаллическая, так и аморфная, являются менее гигроскопичными по сравнению с чем полуфумаратом, предпочтительно, при относительной влажности менее 40%. Таким образом, установлено, что соль по изобретению характеризуется высокой физической стабильностью. Такое свойство в основном обусловлено более высокой энтальпией плавления соли по изобретению, хотя температуры плавления обеих солей сопоставимы.
Улучшенные физико-химические свойства определенных солей или определенных сольватов солей имеют большое значение как при получении фармацевтически активной субстанции, так и при получении, хранении и применении галеновых препаратов. Таким образом, за счет улучшенных физических параметров можно обеспечить более высокое качество составов. Высокая стабильность соли или сольватов соли обеспечивает также экономические преимущества в связи с упрощением стадий переработки в процессе получения. Предпочтительная высокая кристаллизуемость соли или сольватов соли позволяет использовать определенные аналитические методы, прежде всего различные методы рентгеноструктурного анализа, который обеспечивает четкий и простой контроль полученных форм. Этот фактор также имеет большое значение для качества активной субстанции и галеновых форм при получении, хранении и введении пациентам. Кроме того, исключается необходимость выполнять набор условий для стабилизации активного ингредиента в галеновых составах.
Таким образом, неожиданно было установлено, в отличие от общепринятого мнения, что сильная кислота, а именно серная кислота, может образовывать стабильную соль алискирена.
Изобретение соответственно относится к кристаллическим, а также частично кристаллическим и аморфным солям алискирена. Степень кристаллизуемости соли предпочтительно составляет более 30%, более предпочтительно более 40%, еще более предпочтительно более 50%, например, 55-60%.
Изобретение относится как к сольватам, таким как гидраты, так и к полиморфным формам солей по изобретению.
Сольваты и также гидраты солей по изобретению получают, например, в виде полу-, моно-, ди-, три-, тетра-, пента", гексасольватов или гидратов, соответственно. Растворители, использованные для кристаллизации, такие как ацетонитрил, спирты, предпочтительно метанол, этанол, альдегиды, кетоны, прежде всего, ацетон, эфиры, например, этилацетат, или алканы, прежде всего, пентан, гексан, гептан или циклогексан, включены в кристаллическую решетку. Предпочтительным сольватом является сольват ацетонитрила. Количество молекул выбранного растворителя или воды в составе сольвата или гидрата, образующегося при кристаллизации и на следующих стадиях процесса (или образование свободного основания), обычно является непредсказуемым и зависит от комбинаций условий получения и различных типов взаимодействия между алисрикеном и выбранным растворителем, прежде всего, ацетонитрилом. Относительную стабильность образующихся кристаллов или твердых аморфных солей, сольватов и гидратов, также как и соответствующих сольватов соли или гидратов соли, определяют экспериментальным путем. Таким образом, невозможно однозначно оценить химический состав и стехиометрическое соотношение молекул в образующемся твердом веществе, поскольку при данных обстоятельствах могут образоваться как различные твердые кристаллические, так и различные аморфные вещества.
Предпочтительными являются сольваты и гидраты солей, поскольку молекулы растворителя или воды в кристаллической структуре связаны сильными межмолекулярными связями, и поэтому вносят значительный вклад в образование структуры этих кристаллов, которые, в свою очередь, являются чрезвычайно стабильными. В отличие от указанных кристаллических структур сольваты полуфумарата являются нестабильными. Однако молекулы растворителя или воды также присутствуют в определенных кристаллических решетках и связаны между собой достаточно слабыми межмолекулярными связями. Такие молекулы в большей или меньшей степени включаются в образующуюся кристаллическую структуру, но с более низким энергетическим эффектом. Содержание растворителя или воды в твердом аморфном веществе в основном можно точно определить, также как и в кристаллических сольватах или гидратах, но эта величина в значительной степени зависит от условий высушивания и окружающей среды. Напротив, в случае стабильных сольватов или гидратов существует четкое стехйометрическое соотношение между фармацевтически активной субстанцией и растворителем или водой. Во многих случаях указанное соотношение не соответствует точному стехиометрическому составу, которое обычно составляет более низкие значения по сравнению с теоретическим значением из-за некоторых дефектов в кристаллах. Соотношение органических молекул и молекул растворителя или воды для более слабо связанных молекул воды изменяется в значительной степени, например, образуются ди-, три- или тетрагидраты. С другой стороны, твердые аморфные вещества, содержащие растворитель или воду, характеризуются нестехиометрическим составом, однако, стехиометрические структуры могут образовываться случайно.
В некоторых случаях невозможно определить точный стехиометрический состав (для молекул растворителя или воды), поскольку образуется многослойная структура и форму включенных молекул растворителя или воды практически невозможно определить.
В предпочтительном варианте изобретения присутствуют две части сольвата на три части соли.
Твердые кристаллы идентичного химического состава, образующие различные кристаллические решетки, называются полиморфными формами.
Следует понимать, что любая ссылка в данном контексте на соли по изобретению также означает соответствующие сольваты, такие как гидраты, и полиморфные модификации, а также аморфные формы.
На рентгеновской порошковой диаграмме соли наблюдается множество дискретных пиков и практически отсутствуют сигналы некристаллического или аморфного компонентов. Следовательно, продукт характеризуется неожиданно высокой степенью кристаллизации.
Указанный способ определения структуры кристалла позволяет в нормальных условиях, таких как высокая физическая, химическая и энантиомерная чистота исследуемых кристаллов, с высокой точностью определить структуру на молекулярном или атомном уровне, а именно, симметрию и размер элементарных ячеек, положение атомов и температурные факторы, а с использованием определенного объема кристаллической ячейки можно получить изображение распределения электронной плотности с учетом молекулярной массы. Указанный рентгеноструктурный анализ позволяет повысить степень разрешения определяемой структуры.
При нагревании в открытом контейнере со скоростью Тr=10 К/мин температура плавления образца составляет 97,1°С и энтальпия плавления 39,3 Дж·г-1. Указанная температура плавления означает величину, определенную только в открытом контейнере.
Эти две термодинамические характеристики свидетельствуют о преимуществе физических свойств по сравнению с двумя соответствующими значениями для полуфумарата, а именно температура плавления полуфумарата в открытом тигле составляет 96,6°С и энтальпия плавления 28,9 Дж·г-1. Эти термодинамические характеристики свидетельствуют о высокой стабильности указанной кристаллической формы. Они вносят основной вклад в физическую и химическую стабильность гидросульфата алискирена.
При анализе инфракрасного спектра поглощения гидросульфата алискирена в таблетках бромида калия наблюдаются следующие пики при длине волны в см-1 (интенсивность сигналов поглощения: (w) = слабая, (m) = средняя и (st) сильная). Спектры регистрируют методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием с использованием микроскопа Hyperion фирмы Bruker Optics, Германия.
СО для всех полос поглощения в режиме нарушенного полного отражения (ИК-НПВО) составляет ±2 см-1: 3353 (ушир.), 3078, 2960, 2935, 2876, 1660 (С=O), 1516 (амид II), 1470, 1444, 1425, 1389, 1371, 1260, 1234 (арил-O), 1191, 1163, 1140, 1047, 872, 809, 768, 723.
Гидросульфат алискирена характеризуют также по межплоскостным расстояниям, определенным по пикам на порошковой дифрактограмме. Порошковые дифрактограммы получают на порошковом дифрактометре Scintag XDS2000 в режиме отражения с использованием излучения Сu-Ка1+2 и детектора дисперсии энергии при комнатной температуре. Предпочтительную характеристику гидросульфата алискирена проводят с использованием межплоскостных расстояний d, определенных на порошковой дифрактограмме, т.е. получают средние значения ±СО.
По наиболее интенсивным пикам на дифрактограмме определяют межплоскостные расстояния: d (±0,1 Å): 21,3, 12,4, 10,7, 10,1, 8,4, 7,9, 6,7, 6,0, 5,3, 4,9, 4,7, 4,5, 4,4, 4,1.
Характерным признаком качества очищенной субстанции как для физико-химических процессов, таких как высушивание, просеивание, измельчение, так и для способов получения галеновых составов, которые получают в смеси с фармацевтическими эксципиентами, то есть для способов смешивания, грануляции, высушивания с распылением и таблетирования, является абсорбция или потеря воды в активной субстанции в зависимости от температуры и относительной влажности окружающей среды. При получении определенных составов свободная и связанная вода поступает из эксципиентов и/или в процессе обработки в зависимости от соответствующего способа формирования состава. Таким образом, фармацевтически активная субстанция находится в свободной воде в течение достаточно длительного периода времени, причем вода характеризуется различной активностью в зависимости от температуры (парциального давления паров).
Точную характеристику такой активности определяют по изотермическим свойствам, которые регистрируют через определенные промежутки времени и при определенной относительной влажности методом динамической сорбции паров (прибор DVS фирмы Surface Measurement Systems LTD, Marlow, Buckinghamshire, Великобритания). В таблице 4 представлено изменение массы, т.е. абсорбция или потеря воды в зависимости от относительной влажности при 25°С для образца 9,5 мг гидросульфата алискирена в течение 4 ч. Приведены следующие циклы изменения относительной влажности: от 40 до 0% и от 0 до 95%.
Таблица 4 | |||
Относительная влажность (%) | Изменение массы (%) (десорбция) | Относительная влажность (%) | Изменение (%) (сорбция) |
40 | 2,20 | 0 | 0,00 |
30 | 1,67 | 10 | 0,46 |
20 | 1,25 | 20 | 0,84 |
10 | 0,88 | 30 | 1,31 |
0 | 0,00 | 40 | 1,98 |
50 | 3,39 | ||
60 | 7,07 | ||
70 | 8,88 | ||
80 | 13,43 | ||
90 | 25,83 | ||
95 | 40,62 |
Ошибка измерения сорбции методом термогравиметрии составляет 0,1%. Следовательно, гидросульфат алискирена в данных условиях, которые соответствуют реальным условиям получения форм галеновых составов, характеризуется значительной степенью сорбции или потери воды при относительной влажности более 40%. Указанная величина в значительной степени сопоставима со свойствами для полуфумарата, однако, при относительной влажности менее 40% гидросульфат алискирена захватывает меньшее количество воды по сравнению с полуфумаратом. Указанное свойство является чрезвычайно важным на последних стадиях химического синтеза, а также на практике на всех стадиях получения различных галеновых лекарственных форм.
Благодаря указанным улучшенным свойствам гидросульфата, указанная соль является пригодной для прессования непосредственно при получении соответствующей таблетки.
Кроме достаточно высоких физико-химических свойств, преимущества гидросульфата заключаются в усовершенствовании и упрощении способа получения лекарственного средства. Например, при использовании способа, описанного, например, в патенте ЕР 678503 А, полуфумарат получают на отдельной стадии после удаления N-защитных групп. Однако при использовании серной кислоты удаление N-защитных групп и образование соли можно проводить на одной стадии, что позволяет повысить эффективность способа.
Другой объект изобретения относится к получению солей по изобретению.
Соли по изобретению, включая их аморфную и кристаллическую формы, получают следующим образом.
Для получения соли процесс проводят в системе растворителя, в котором оба реагента, а именно основание алискирена и соответствующая кислота, характеризуются достаточно высокой растворимостью. Целесообразно использовать растворитель или смеси растворителей, в которых образующаяся соль слаборастворима или нерастворима для того, чтобы инициировать кристаллизацию или осаждение. В одном варианте получения соли по изобретению используют растворитель, в котором указанная соль характеризуются высокой растворимостью, и затем добавляют в этот раствор антирастворитель, т.е. такой растворитель, в котором образующаяся соль характеризуются низкой растворимостью. В другом варианте кристаллизация соли включает концентрирование солевого раствора, например, при нагревании, при необходимости при пониженном давлении, или медленном упаривании растворителя, например, при комнатной температуре, или при добавлении затравочных кристаллов для осаждения, или при использовании воды с необходимой активностью для образования гидратов.
Используют растворители, такие как, например, С3-С7-алкилнитрилы, прежде всего, ацетонитрил, С1-С5алканолы, предпочтительно этанол и изопропанол, сложные эфиры, прежде всего, (С1-С5)алкиловый эфир (С2-С7)алканкарбоновой кислоты, такой как этилацетат или изопропилацетат, простые ди(С1-С5)алкиловые эфиры, такие как трет-бутилметиловый эфир, и кроме того, тетрагидрофуран, и (С5-С8)алканы, прежде всего, пентан, гексан, циклогексан или гептан и смеси указанных растворителей с водой. Наиболее предпочтительным растворителем является ацетонитрил.
Для получения гидратов прежде всего используют процесс растворения и кристаллизации или процесс кристаллизации в равновесии с водой.
Способ растворения и кристаллизации заключается в том, что
(1) свободное основание алискирена растворяют в органическом растворителе,
(2) в раствор, полученный на стадии 1, добавляют серную кислоту, предпочтительно в виде водного раствора,
(3) раствор выдерживают для индукции кристаллизации,
(4) кристаллы отделяют фильтрованием и высушивают, при этом получают соль.
На стадии растворения (1) в качестве органического растворителя предпочтительно используют спирт, такой как этанол или изопропанол, или алкилнитрил, прежде всего ацетонитрил, и воду. При необходимости растворитель нагревают до температуры выше комнатной, например, от 25° до 60°С, более предпочтительно от 30° до 50°С.
На стадии (2) предпочтительно используют водный раствор серной кислоты при концентрации от 10 до 30%, более предпочтительно от 15 до 25%, например, 20% раствор.
На стадии (3) раствор предпочтительно выдерживают для медленного упаривания растворителя. Указанную стадию проводят предпочтительно при охлаждении до комнатной температуры или ниже, более предпочтительно от -10° до 10°С, еще более предпочтительно от -5° до 10°С, наиболее предпочтительно от 0° до 5°С. Концентрирование раствора также проводят при нагревании до температуры выше комнатной, например, от >25° до 100°С, более предпочтительно от 30° до 70°С. Обычно раствор выдерживают в течение от 1 до 48 ч, предпочтительно от 17 до 36 ч, более предпочтительно от 20 до 30 ч.
На стадии (4) высушивание проводят предпочтительно при повышенной температуре, более предпочтительно от 20° до 50°С, наиболее предпочтительно от 30° до 40°С. Высушивание можно проводить при давлении от 1 до 100 мбар, предпочтительно от 10 до 50 мбар, более предпочтительно от 20 до 40 мбар, например, 30 мбар. Высушивание обычно проводят до постоянной массы образца. В зависимости от условий, высушивание занимает от 5 до 48 ч, предпочтительно от 10 до 24 ч, например, от 15 до 20 ч.
Способы получения солей также являются объектами настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте кристаллизацию оптимизируют, например, ускоряют при добавлении по крайней мере одного кристалла для затравки.
Соли по изобретению можно использовать, например, в форме фармацевтических композиций, которые содержат активную субстанцию, например, в терапевтически эффективном количестве, необязательно в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, например, с неорганическим или органическим, твердым или необязательно также жидким фармацевтически приемлемым носителем, который является приемлемым для энтерального, например, перорального или парентерального введения.
Изобретение относится прежде всего к фармацевтической композиции, прежде всего, в твердой лекарственной форме, предпочтительно для перорального введения, необязательно в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
Фармацевтические препараты указанного типа можно использовать, например, для профилактики и лечения заболеваний или состояний, которые поддаются лечению при блокировании рецептора AT1, например,
заболевания или состояния, выбранного из группы, включающей следующие заболевания:
(a) гипертензия, застойная сердечная недостаточность, почечная недостаточность, прежде всего хроническая почечная недостаточность, рестеноз после подкожной транслюминальной ангиопластики и рестеноз после хирургического шунтирования коронарной артерии,
(b) атеросклероз, резистентность к инсулину и синдром X, сахарный диабет 2 типа, ожирение, нефропатия, почечная недостаточность, например, хроническая почечная недостаточность, гипотиреоз, состояние после инфаркта миокарда (ИМ), коронарная болезнь сердца, гипертензия у пожилых пациентов, семейная дислимидемическая гипертензия, повышенное образование коллагена, фиброз и гипертензия после реконструкции сосудов (антипролиферативное действие комбинации). Все эти заболевания или состояния сопровождаются или не сопровождаются гипертензией,
(c) эндотелиальная дисфункция с гипертензией или без нее,
(d) гиперлипидемия, гиперлипопротеинемия, атеросклероз и гиперхолестеринемия и
(e) глаукома.
Первичное назначение включает лечение высокого кровяного давления и застойной сердечной недостаточности, а также состояния после инфаркта миокарда.
Специалист в данной области техники может выбрать пригодную и стандартную модель животного для подтверждения указанных в данном контексте терапевтических показаний и высокой эффективности.
Фармацевтическую активность при введении типичных солей по настоящему изобретению или комбинации активных агентов по настоящему изобретению можно оценивать, например, с использованием соответствующих фармакологических моделей, известных в предшествующем уровне техники. Специалист в данной области техники может выбрать пригодную модель животных для подтверждения указанных в данном контексте показаний и высокой эффективности.
Эффективность лекарственного средства оценивали с использованием различных моделей животных, включая гипертензию крыс, вызванную ацетатом дезоксикортикостерона (ДОКА), и спонтанную гипертензию крыс (SHR), которые получали нормальный солевой корм или корм с высоким содержанием соли (4-8% в корме крыс или 1% NaCl в качестве питьевой воды).
Модель ДОКА использовали при однократном или продолжительном введении. Протокол испытаний с однократным ввведением позволяет оценивать действие различных исследуемых веществ в течение 6 ч с использованием крыс, которым имплантировали катетеры в бедренную артерию и вену. Испытания при однократном ввведении позволяют оценивать исследуемые вещества по их способности снижать повышенное кровяное давление на сформировавшейся фазе гипертензии, вызванной ДОКА. И наоборот, испытания при продолжительном введении позволяют оценивать способность исследуемых веществ предотвратить или замедлить повышение кровяного давления на стадии развития гипертензии, вызванной ДОКА. Следовательно, при испытаниях с продолжительным введением можно регистрировать кровяное давление с помощью радиодатчика, который хирургическим путем имплантируют в брюшную аорту крыс до начала лечения гипертензии, индуцированной ДОКА, т.е. до индукции гипертензии. Кровяное давление регистрировали непрерывно в течение 6 недель (приблизительно за одну неделю до введения ДОКА и в течение 5 недель после введения).
Крыс анестезировали 2-3% изофлурана при ингаляции кислородом, затем амиталом натрия (амобарбитал) в дозе 100 мг/кг массы тела. Степень анестезии регистрировали по уровню ритмичности дыхания.
Испытания при введении однократной дозы
Крысам проводили одностороннюю нефректомию во время имплантации ДОКА. Шерсть состригали с левого бока и с шеи со стороны спины, протирали (кожу) стерильными тампонами, пропитанными спиртом и смесью повидон/иод. Во время операции крыс помещали на подогреваемый матрас для поддерживания температуры тела 37°С.
Через кожу и прилежащую мышцу делали надрез размером 20 мм, чтобы извлечь левую почку. Почку очищали от окружающей ткани, извлекали и накладывали две прочные лигатуры вокруг почечной артерии и вены, проксимальных к месту ее соединения с аортой (шелк 3-0). Затем почечную артерию и вену отделяли и почку извлекали. Мышцы и кожу сшивали (шелк 4-0) и зажимали зажимами из нержавеющей стали, соответственно. В то же время, на шее со стороны спины делали надрез размером 15 мм и имплантировали подкожно пеллет с замедленным высвобождением в течение 3 недель (фирмы Innovative Research of America, Sarasota, Флорида), содержащий ацетат дезоксикортикостерона (100 мг/кг). Затем рану зажимали зажимом из нержавеющей стали и обе раны обрабатывали смесью повидон/иод, крысам после операции вводили внутримышечно прокаин пенициллина G (100000 Ед) и бупренофин (0,05-0,1 мг/кг) подкожно. Крысам немедленно обеспечивали доступ к питьевому раствору 1% NaCl+0,2% КСl. Указанное введение продолжали в течение по крайней мере 3 недель, в течение которых у животных развивалась гипертензия и их использовали для испытаний.
За 48 ч до испытаний животных анестезировали изофлураном и вводили катетеры в бедренную артерию и вену для измерения артериального давления, для отбора крови и введения исследуемых соединений. Для восстановления крыс выдерживали в течение 48 ч в фиксированном состоянии в клетке из оргстекла, которую также использовали для испытаний.
Испытания при продолжительном введении
Указанные испытания проводили анлогично тому, как описано выше, но крысам имплантировали радиодатчик за 7-10 сут до односторонней нефректомии и введения ДОКА и соли. Кроме того, крысам не вводили катетеры в бедренную артерию и вену. Радиодатчик имплантировали, как описано в статье М.К.Bazil, С.Krulan и R.L.Webb. J.Cardiovasc. Pharmacol. 22: 897-905 (1993).
Условия испытаний вводили в компьютер для анализа кровяного давления, сердечного ритма и т.п., в определенные периоды времени. Исходные данные собирали в различные периоды времени и через различные интервалы времени. Например, исходные данные или значения до введения дозы обычно включали средние величины по трем последовательным значениям, полученным через каждые 24 ч до введения лекарственного средства.
Кровяное давление, сердечный ритм и активность определяли в предварительно определенные периоды времени до, во время и после введения лекарственного средства. Все измерения проводили с использованием животных в бесстрессовом и спокойном состоянии. Максимальное время испытаний определялось сроком работы батареек и составляло девять месяцев. В указанный период крысам вводили носитель перорально (1-3 мл/кг) не более 2-х раз в сутки или лекарственное средство в питьевой воде или в корме. Для более коротких испытаний в течение 8 недель лекарственные средства вводили подкожно из имплантированных осмотических мининасосов. Скорость осмотических мининасосов устанавливали в зависимости от необходимой скорости и времени доставки лекарственного средства. Доза алисрикена составляла от 1 до 10 мг/кг/сут.
Кроме того, для изучения действия алисрикена использовали крыс со спонтанной гипертензией (SHR), которую индуцировали при непрерывном введении соли для подавления системы ренин-ангиотензин (RAS) или непрерывном отсутствии соли для активации RAS у крыс SHR. Указанные испытания проводили для более интенсивной оценки действия различных исследуемых веществ. Эксперименты проводили с использованием крыс SHR, полученных на фирме Taconic Farms, Germantown, Нью-Йорк (Tac:N(SHR)fBR). Радиометрическое устройство (Data Sciences International, Inc., St. Paul, Миннесота) имплантировали в нижнюю брюшную аорту всем экспериментальным животным в возрасте от 14 до 16 недель. После операции всех крыс SHR выдерживали в течение по крайней мере 2 недель до начала испытаний для восстановления. Сердечно-сосудистые параметры непрерывно регистрировали с использованием радиодатчика и получение сигналы преобразовывали в цифровые данные, которые сохраняли в компьютере. Кровяное давление (среднее артериальное, систолитическое и диастолитическое давление) и сердечный ритм регистрировали у крыс (SHR), которые находились в сознании и в бесстрессовом свободном состоянии в клетках. Артериальное кровяное давление и сердечный ритм измеряли каждые 10 мин в течение 10 с и регистрировали. Данные, полученные для каждой крысы, представляли в виде средних значений, полученных в течение 24 ч, и собирали образцы каждый день (144-10 мин). Исходные значения кровяного давления и сердечного ритма представляли в виде средних величин по трем последующим значениям, полученным через каждые 24 ч, до начала лечения лекарственным средством. Всех крыс помещали отдельно в клетки с контролируемой температурой, влажностью и с циклом свет - темнота (12 ч/12 ч).
Кроме сердечно-сосудистых параметров, для всех крыс также регистрировали массу тела один раз в неделю. Лекарственное средство вводили перорально в питьевой воде один раз в сутки через желудочный зонд или с использованием осмотических мининасосов, как указано выше. При введении с питьевой водой потребление воды регистрировали пять раз в неделю. Затем рассчитывали дозы алискирена (свободное основание) для каждой отдельной крысы по потреблению воды, концентрации лекарственного средства в питьевой воде и индивидуальной массы тела. Все свежие растворы лекарственного средства в питьевой воде готовили каждые три - четыре дня. Обычная доза алискирена в питьевой воде находится в интервале от 3 до 30 мг/кг/сут. Однако, если экспериментальной крысе вводили комбинацию лекарственных средств, использовали дозы, аналогичные дозам при монотерапии.
При введении лекарственного средства через желудочный зонд доза алискирена (свободное основание) находится в интервале от 1 до 50 мг/кг/сут.
После завершения испытаний при продолжительном введении крыс SHR или крыс ДОКА анестезировали и из тела быстро удаляли сердце. После отделения и удаления предсердий, левого желудочка и, левого и правого желудочков (общая масса), их взвешивали и полученные результаты регистрировали. Массу левого желудочка и общую массу желудочков затем нормализовали по массе тела и регистрировали. Все значения, полученные для кровяного давления и сердечной массы, представляли в виде средних значений для группы ±СО.
Функцию и структуру сосудов оценивали после введения комбинации для оценки ее эффективности. Крыс SHR испытывали по методике, описанной в статье Intengan H.D., Thibault G., Li J.S., Schiffrin E.L., Circulation 100 (22); 2267-2275 (1999). Аналогичным образом, оценивали функцию сосудов у крыс ДОКА, как описано в статье Intengan H.D., Park J.B., Schiffrin E.L., Hypertension 34 (4 Part 2): 907-913 (1999).
Фармацевтические препараты по настоящему изобретению, которые при необходимости могут дополнительно содержать фармакологически активные субстанции, получают известным способом, например, при смешивании, грануляции, нанесении покрытия, растворении или лиофилизации, и полученные препараты содержат от приблизительно 0,1% до 100%, прежде всего, от приблизительно 1% до приблизительно 50%, лиофилизата и вплоть до 100% активной субстанции.
Изобретение также относится к композициям, содержащим соли по изобретению.
Изобретение также относится к применению солей по изобретению, предпочтительно для получения фармацевтических препаратов, предназначенных, прежде всего, для профилактики и также для лечения заболеваний или состояний, которые поддаются лечению при ингибировании ренина. Прежде всего, указанные соли можно использовать для лечения высокого кровяного давления, почечной недостаточности, дисфункции левого желудочка и сердечной недостаточности.
Изобретение также относится к применению для профилактики и лечения заболеваний или состояний, которые поддаются лечению при ингибировании ренина, и указанное применение заключается в том, что пациенту, включая че