Варианты глюкоамилазы

Варианты глюкоамилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вариантам глюкоамилазы с улучшенными свойствами и к способам применения вариантов глюкоамилазы.

Предпосылки создания изобретения

Глюкоамилаза (1,4-альфа-D-глюканглюкогидролаза, ЕС 3.2.1.3) представляет собой фермент, который катализирует высвобождение D-глюкозы с невосстановленных концов крахмала или молекул родственного олиго- и полисахарида. Глюкоамилазы продуцируются несколькими нитевидными грибами и дрожжами.

В промышленности фермент глюкоамилазы используется для конверсии кукурузного крахмала, который уже частично гидролизован, альфа-амилазой в глюкозу. В производстве высокофруктозного кукурузного сиропа (HFCS) глюкоза, кроме того, превращается глюкозоизомеразой в смесь, состоящую в равной степени из глюкозы и фруктозы. Указанная смесь представляет собой широко используемый во всем мире высокофруктозный кукурузный сироп. Наиболее используемыми для высокофруктозного кукурузного сиропа являются глюкоамилазы, получаемые из Talaromyces emersonii и Aspergillus niger.

При высоких концентрациях твердых веществ, используемых в промышленности для производства высокофруктозного кукурузного сиропа, глюкоамилаза синтезирует ди-, три- и тетрасахариды из глюкозы, которая получается конденсацией. Это происходит из-за медленного гидролиза альфа-(1-6)-D-глюкозидных связей в крахмале и образования различных аккумулирующих продуктов конденсации, главным образом изомальтозы, из D-глюкозы. Соответственно, выход глюкозы в традиционном способе не превышает 95% от теоретического выхода. Количество HFCS, получаемого в мире указанным способом, является очень большим, и даже небольшое увеличение выхода глюкозы на тонну крахмала является коммерчески важным.

Целью настоящего изобретения является снижение образования продуктов конденсации частных глюкоамилаз, которые получают из организмов грибов, в частности штаммов рода Talaromyces и рода Aspergillus, и которые сами выбраны на базе их подходящих свойств, например, в конверсии крахмала.

Краткое описание изобретения

Авторами было обнаружено, что при введении некоторых изменений в конкретные положения в конкретных участках аминокислотной последовательности родительской глюкоамилазы скорость образования альфа-(1-6)-связей снижается, и/или образование изомальтозы снижается. Снижение скорости, при которой глюкоамилаза расщепляет и, соответственно, образует альфа-(1-6)-связи, по отношению к скорости, с которой она расщепляет альфа-(1-4)-связи, имеет практическое значение. Глюкоамилаза, которая может продуцировать глюкозу со значительно сниженным количеством побочных продуктов, представляет большой коммерческий интерес, например, в получении подслащивающих веществ из крахмала.

Авторами настоящего изобретения получен ряд вариантов родительской глюкоамилазы, которые показывают сниженную конденсацию. При использовании варианта глюкоамилазы по изобретению в способе осахаривания может быть получен сироп с очень высоким процентным содержанием глюкозы. Сниженная конденсация получается при мутации, например, при замещении, и/или делеции, и/или инсерции выбранных положений в родительскую глюкоамилазу. Это будет описано подробно ниже.

Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к варианту родительской глюкоамилазы, который имеет сниженную продукцию продукта конденсации по сравнению с родительской глюкоамилазой.

Соответственно, во втором аспекте настоящее изобретение относится к варианту родительской глюкоамилазы, содержащему изменение в одном из следующих участков: участок 248-255, например, в одном или нескольких из положений 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254 и/или 255, участок 309-318, например, в одном или нескольких из положений 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 и/или 318, и/или участок 409-415, например, в одном или нескольких из положений 409, 410, 411, 412, 413, 414 и/или 415, где (а) изменение представляет собой независимо (i) инсерцию аминокислоты, следующей после аминокислоты, которая занимает положение, (ii) делецию аминокислоты, которая занимает положение, или (iii) замещение аминокислоты, которая занимает положение, другой аминокислотой, (b) вариант имеет активность глюкоамилазы, и (с) каждое положение соответствует участку или положению аминокислотной последовательности родительской глюкоамилазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и/или участку или положению в гомологичной глюкоамилазе, которая показывает, по меньшей мере, 50% гомологии с аминокислотными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 2.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к конструкции ДНК, содержащей ДНК-последовательность, кодирующую вариант глюкоамилазы согласно первому аспекту.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору экспрессии, который несет ДНК-конструкцию согласно второму аспекту.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, которая трансформирована ДНК-конструкцией согласно второму аспекту или вектором согласно третьему аспекту.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к клетке согласно четвертому аспекту, которая является микроорганизмом, в частности бактерией или грибом.

В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к способу конверсии крахмала или частично гидролизованного крахмала в сироп, содержащий декстрозу, где указанный способ включает осахаривание гидролизата крахмала в присутствии варианта глюкоамилазы согласно первому аспекту.

В других аспектах настоящее изобретение относится к применению варианта глюкоамилазы по любому из первого или второго аспектов в способе конверсии крахмала, предпочтительно, в непрерывном способе конверсии крахмала, применению в способе получения олигосахаридов, мальтодекстринов или сиропов глюкозы, применению в способе получения высокофруктозного кукурузного сиропа, применению в способе получения алкогольного напитка, топливного или питьевого этанола и/или применению в способе ферментации для получения органического соединения.

Подробное описание изобретения

Используемые определения

Номенклатура

В настоящем описании и формуле изобретения используются традиционные однобуквенные и трехбуквенные коды для аминокислотных остатков.

Для легкости обозначения варианты глюкоамилазы по изобретению описываются с использованием следующей номенклатуры: исходная аминокислота (аминокислоты):положение (положения):замещенная аминокислота (аминокислоты).

Согласно данной номенклатуре, например, замещение аланина аспарагином в положении 30 обозначается как А30N, делеция аланина в том же положении обозначается как А30^* и инсерция дополнительного остатка аминокислоты, такой как лизин, обозначается как А30АК.

Делеция последовательного фрагмента аминокислотных остатков, таких как аминокислотные остатки 30-33, обозначается как Δ(А30-N33).

Когда конкретная глюкоамилаза содержит «делецию» по сравнению с другой глюкоамилазой, и инсерция выполняется в этом положении, это обозначается как *36D - для инсерции аспарагиновой кислоты в положении 36.

Множественные мутации разделяются знаками плюс: A30N+E34S, представляющие мутации в положениях 30 и 34, замещение аланина и глутаминовой кислоты на аспарагин и серин соответственно. Множественные мутации также могут быть разделены следующим образом, т.е. означает то же, что и знак плюс: A30N/E34S.

Когда один или несколько альтернативных аминокислотных остатков может быть введен в данном положении, это указывается как A30N или А30Е.

Кроме того, когда положение, традиционное для модификации, идентифицируется здесь без какой-либо предлагаемой специальной модификации, должно быть понятно, что любой аминокислотный остаток может замещать аминокислотный остаток, присутствующий в положении. Таким образом, например, когда указывается модификация аланина в положении 30, но не уточняется, должно быть понятно, что аланин может быть удален или замещен любой другой аминокислотой, т.е. любой одной из R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.

Термины «полярный» (C, T, S, D, N, Y, W, H, K, E, R, Q), «неполярный» (A, C, V, I, L, M, K, F, Y, W, H), «алифатический» (V, I, L), «ароматический» (F, Y, W, H), «небольшой» (A, C, D, G, N, P, T, S), «очень маленький» (A, C, G, T, S), «заряженный» (K, R, D, E) используются для аминокислотных остатков согласно определению в W.R. Taylor в The Classification of Amino Acid Conservation, J. Theor. Biol., 119 (1986) 205-218. Кроме того, термин «шестизвенное ароматическое соединение» используется для аминокислотных остатков, содержащих неконденсированную шестизвенную ароматическую кольцевую систему (т.е. F, Y). Также термин «отрицательный» используется для аминокислотных остатков, которые имеют отрицательно заряженную боковую цепь при нейтральном рН (т.е. D, E).

В контексте настоящего изобретения гомология может быть определена как степень идентичности между двумя последовательностями, показывающая происхождение первой последовательности от второй. Гомология может быть традиционно определена с помощью компьютерных программ, известных в области техники, таких как GAP, предусмотренной в пакете программ GCG (описанном выше). Таким образом, GAP GCGv8 может быть использована с матрицей количественной оценки неисправностей для идентичности и следующими параметрами исправления неисправностей: штраф GAP создания 5,0 и штраф GAP расширения 0,3, соответственно, для сравнения нуклеиновой кислотной последовательности, и штраф GAP создания 3,0 и штраф GAP расширения 0,1, соответственно, для сравнения белковой последовательности. GAP использует способ Needleman and Wunsch, (1970), J. Mol. Biol., 48, p. 443-453 для получения выравнивания и расчета идентичности.

Структурное выравнивание между SEQ ID NO: 1 и другой глюкоамилазой может быть использовано для идентификации эквивалентных/соответствующих положений. Один способ получения указанного структурного выравнивания состоит в использовании программы Pile Up из GCG-пакета, использующего значения исправления неисправностей GAP-штрафов, т.е. штраф gap создания 3,0 и штраф gap расширения 0,1. Другие способы структурного выравнивания включают гидрофобный кластерный анализ (Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) и обратную заправку (Huber T., Torda A.E., PROTEIN SCIENCE, Vol. 7, № 1, рр. 142-149 (1998).

В настоящем контексте термин «производная от» предназначен не только для указания глюкоамилазы, полученной или производимой штаммом рассматриваемого организма, но также глюкоамилазы, кодированной ДНК-последовательностью, выделенной из такого штамма и полученной в организме-хозяине, преобразованном указанной ДНК-последовательностью. Наконец, термин предназначен для указания глюкоамилазы, которая кодирована ДНК-последовательностью синтетической кДНК и/или источником кДНК и которая имеет идентифицирующие характеристики рассматриваемой глюкоамилазы. Термин также указывает, что родительская глюкоамилаза может представлять собой вариант природной глюкоамилазы, т.е. вариант, который является результатом модификации (инсерции, замещения, делеции) одного или нескольких аминокислотных остатков природной глюкоамилазы.

Варианты глюкоамилазы по изобретению

Настоящее изобретение предусматривает вариант родительской глюкоамилазы, содержащий изменение в одном из следующих участков: участок 248-255, например, в положении 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254 и/или 255, участок 309-318, например, в положении 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 и/или 318, и/или участок 409-415, например, в положении 409, 410, 411, 412, 413, 414 и/или 415, где (а) изменение представляет собой независимо (i) инсерцию аминокислоты, следующей после аминокислоты, которая занимает положение, (ii) делецию аминокислоты, которая занимает положение, или (iii) замещение аминокислоты, которая занимает положение, другой аминокислотой, (b) вариант имеет активность глюкоамилазы, и (с) каждый участок и/или положение соответствует положению аминокислотной последовательности родительской глюкоамилазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и/или участку и/или положению в гомологичной глюкоамилазе, которая показывает, по меньшей мере, 50% гомологию с аминокислотными последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1.

Предпочтительными являются варианты, содержащие изменение в одном или нескольких из следующих положений: 252, 312, 314, 315, 412, где каждое положение соответствует положению аминокислотной последовательности родительской глюкоамилазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Предпочтительным в положении, соответствующем L252 в SEQ ID NO: 1, является замещение любым неполярным остатком (А, С, F, G, Н, I, К, М, V, W, Y), более предпочтительно, неполярным остатком, который также является небольшим остатком (V, С, А, G), даже более предпочтительно, неполярным остатком, который также является очень маленьким остатком (А, G), и, наиболее предпочтительно, остатком А.

Предпочтительным в положении, соответствующем V312 в SEQ ID NO: 1, является замещение любым полярным остатком (С, D, Е, Н, К, N, Q, R, S, Т, W, Y), более предпочтительно, полярным остатком, который является также небольшим остатком (С, Т, S, D, N), даже более предпочтительно, полярным остатком, который также является очень маленьким остатком (С, Т, S), и, наиболее предпочтительно, остатком S.

Предпочтительным в положении, соответствующем Q314 в SEQ ID NO: 1, является замещение любым полярным, алифатическим или ароматическим остатком (C, D, E, F, H, I, K, L, N, R, S, T, V, W, Y), более предпочтительно, заряженным, алифатическим или ароматическим остатком ( D, E, F, H, I, K, L, R, V, W, Y), более предпочтительно, алифатическим или ароматическим остатком (F, H, I, L, V, W, Y), более предпочтительно, ароматическим остатком (F, H, W, Y), даже более предпочтительно, ароматическим остатком, который является также шестизвенным ароматическим остатком (F, Y), и, наиболее предпочтительно, остатком Y.

Предпочтительным в положении, соответствующем инсерции после Q314 в SEQ ID NO: 1, является инсерция любого алифатического или ароматического остатка (V, I, L, F, Y, W, H), более предпочтительно, алифатического остатка (V, I, L), и, наиболее предпочтительно, инсерция остатка I.

Предпочтительным в положении, соответствующем G315 в SEQ ID NO: 1, является замещение любым неполярным остатком (A, C, F, H, I, K, L, M, V, W, Y), замещение полярным остатком либо остатком, который не является небольшим остатком (C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, W, Y), также предпочтительным является замещение либо небольшим, либо заряженным остатком (D, E, F, H, I, K, L, M, Q, R, W, Y), более предпочтительно, замещение остатком, который не является небольшим остатком (E, F, H, I, K, L, M, Q, R, W, Y), или замещение остатком, который не является ни небольшим, ни положительным остатком (E, F, H, I, L, M, Q, W, Y), или замещение остатком, который не является ни небольшим, ни отрицательным остатком (I, L, M, F, Y, W, H, K, R), или замещение ароматическим или алифатическим остатком, который также не является небольшим остатком (F, Y, W, H, I, L), или замещение ароматическим или алифатическим остатком, который также не является ни небольшим, ни заряженным остатком (F, Y, W, I, L), или, более предпочтительно, замещение ароматическим остатком, который также не является заряженным остатком (F, Y, W), даже более предпочтительно, ароматическим остатком, который является также шестизвенным ароматическим остатком (F, Y), и, наиболее предпочтительно, остатком Y.

Предпочтительным в положении, соответствующем L412 в SEQ ID NO: 1, является замещение любым полярным остатком (C, D, E, H, K, N, Q, R, S, T, W, Y), более предпочтительно, заряженным остатком (H, K, R, E, D), еще более предпочтительно, отрицательным остатком (D, E), и, наиболее предпочтительно, остатком D.

Более предпочтительными являются варианты, содержащие одно или несколько из следующих изменений: замещение A, F, G или V в положении 252; замещение S в положении 312; замещение E, F, N, R, T, W или Y в положении 314; замещение A, D, F, H, K, L, N, Q, R, S, T или Y в положении 315; замещение D в положении 412, или инсерция аминокислотного остатка I между положениями 314 и 315, где каждое положение соответствует положению аминокислотной последовательности родительской глюкоамилазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Даже более предпочтительными являются варианты, содержащие одну или несколько из следующих комбинаций замещений: 314F + 315N, 314W + 315N, 314Y + 315N, 314L + 315A, 314N + 315R, 314R + 315D, 315R + 463T, 315R + 556E, 315L + 529N, где каждое положение соответствует положению аминокислотной последовательности родительской глюкоамилазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и, в частности, варианты, содержащие одно или несколько из следующих замещений: V312S, Q314E, Q314F, Q314N, Q314R, Q314T, Q314W, Q314Y, G315A, G315D, G315F, G315H, G315K, G315L, G315N, G315Q, G315R, G315S, G315T, G315Y, L252A, L252F, L252G, L252V, L412D, или инсерцию аминокислотного остатка I между положениями 314 и 315 (Q314QI), где каждое положение соответствует положению аминокислотной последовательности родительской глюкоамилазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Более предпочтительными являются варианты, содержащие одну или несколько из следующих комбинаций замещений: Q314F и G315N, Q314W и G315N, Q314Y и G315N, Q314L и G315A, Q314N и G315R, Q314R и G315D, G315R и A463T, G315R и K556E, G315L и D529N, где каждое положение соответствует положению аминокислотной последовательности родительской глюкоамилазы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Варианты изобретения могут иметь, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100% активности глюкоамилазы зрелой глюкоамилазы SEQ ID NO: 2.

Варианты изобретения могут иметь конденсацию, которая снижена, по меньшей мере, на 5%, предпочтительно, по меньшей мере, на 10%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 15%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, еще предпочтительно, по меньшей мере, на 25%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 30% относительно глюкоамилазы родительской глюкоамилазы SEQ ID NO: 2.

Родительские глюкоамилазы

Родительская глюкоамилаза, рассматриваемая согласно настоящему изобретению, включает глюкоамилазы дикого типа, глюкоамилазы грибов, в частности, глюкоамилазы грибов, получаемые из Talaromyces, в частности, Talaromyces emersonii, рассмотренных в WO 99/28448 (см. SEQ ID NO: 7 из WO 99/28448) и в SEQ ID NO: 1 в настоящем описании. В другом варианте основа глюкоамилазы является производной от Aspergillus-штамма, такая как глюкоамилазы Aspergillus niger и Aspergillus awamori и их варианты или мутанты, гомологи-глюкоамилазы и другие глюкоамилазы, структурно и/или функционально подобные им.

Предпочтительно, родительская глюкоамилаза содержит один или несколько конкретных аминокислотных остатков, выбранных из перечня, содержащего L-аминоостаток в положении 252, Q-аминоостаток в положении 314, G-аминоостаток в положении 315 и L-аминоостаток в положении 412.

Предпочтительно, родительская глюкоамилаза содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, или их аллельные варианты, или их фрагмент, который имеет активность глюкоамилазы.

Фрагмент SEQ ID NO: 2 представляет собой полипептид, который имеет одну или несколько аминокислот, делетированных из амино- и/или карбоксильного конца данной аминокислотной последовательности. Аллельный вариант обозначает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих тот же самый хромосомный локус. Аллельный вариант имеет место естественно через мутацию и может дать полиморфизм в популяциях. Генные мутации могут быть молчащими (без изменения в кодированном полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодированный аллельным вариантом гена.

Традиционной родительской глюкоамилазой может быть глюкоамилаза, имеющая аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, по меньшей мере, 50%, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 70%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 98% (т.е. гомолог родительской глюкоамилазы).

Аминокислотные последовательности гомологичных родительских глюкоамилаз могут отличаться от аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 инсерцией или делецией одного или нескольких аминокислотных остатков и/или замещением одного или нескольких аминокислотных остатков другими аминокислотными остатками. Предпочтительно, аминокислотные изменения являются минорной природы, т.е. представляют собой консервативные аминокислотные замещения, которые не влияют значительно на укладку и/или активность белка; небольшие делеции, обычно от 1 до 30 аминокислот; небольшие удлинения амино- или карбоксильных концов, такие как аминоконцевой остаток метионина; небольшой линкерный пептид до примерно 20-25 остатков; или небольшое удлинение, которое облегчает очистку изменением результирующего заряда или другой функции, такой как полигистидинный тракт, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Родительские полипептиды могут также представлять собой аллельные варианты или фрагменты полипептидов, которые имеют активность глюкоамилазы.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 или ее фрагмент могут быть использованы для разработки зонда нуклеиновой кислоты для идентификации или клонирования ДНК-кодирующих полипептидов, имеющих активность глюкоамилазы, из штаммов различных генераций или частиц в соответствии со способами, хорошо известными в области техники. В частности, такие зонды могут быть использованы для гибридизации с геномными или кДНК рода или рассматриваемых частиц после стандартных операций саузерн-блоттинга для того, чтобы идентифицировать и выделить соответствующий ген. Такие зонды могут быть значительно короче, чем полная последовательность, но должны быть длиной, по меньшей мере, 15, предпочтительно, по меньшей мере, 25, и, более предпочтительно, по меньшей мере, 35 нуклеотидов. Также могут использоваться более длинные зонды. Могут использоваться как ДНК-, так и РНК-зонды. Зонды обычно метят для определения соответствующего гена (например, с помощью ³²Р, ³Н, ³⁵S, биотина или авидина).

Таким образом, библиотека геномных ДНК или кДНК, полученная из таких других организмов, может быть скринирована для ДНК, которая гибридизирует с зондами, описанными выше, и которая кодирует полипептид, имеющий активность глюкоамилазы. Геномная или другая ДНК из таких других организмов может быть выделена электрофорезом агарозного или полиакриламидного геля или другой технологией выделения. ДНК из библиотек или отдельная ДНК может быть перенесена и зафиксирована на нитроцеллюлозе или другом традиционном материале носителя. Для длинных зондов длиной, по меньшей мере, 100 нуклеотидов материал носителя окончательно промывается 3 раза каждый в течение 15 мин с использованием 2× додецилсульфата натрия (SSC), 0,2% раствора хлорида и цитрата натрия (SDS), предпочтительно, по меньшей мере, при 45°C (очень низкая жесткость), более предпочтительно, по меньшей мере, при 50°C (низкая жесткость), более предпочтительно, по меньшей мере, при 55°C (средняя жесткость), более предпочтительно, по меньшей мере, при 60°C (средняя-высокая жесткость), даже более предпочтительно, по меньшей мере, при 65°C (высокая жесткость), и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, при 70°C (очень высокая жесткость).

Рассматриваемая родительская глюкоамилаза имеет, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100%, активности глюкоамилазы зрелой глюкоамилазы SEQ ID NO: 1.

Клонирование ДНК-последовательности, кодирующей родительскую глюкоамилазу

ДНК-последовательность, кодирующая родительскую глюкоамилазу, может быть выделена из любой клетки или микроорганизма, продуцирующих рассматриваемую глюкоамилазу, с использованием различных способов, хорошо известных в области техники. Во-первых, геномная ДНК или библиотека кДНК должны быть созданы с использованием хромосомной ДНК или матричной РНК из организма, который продуцирует исследуемую глюкоамилазу. Затем, если аминокислотная последовательность глюкоамилазы является известной, могут быть синтезированы меченые олигонуклеотидные зонды и использованы для идентификации глюкоамилазокодирующих клонов из геномной библиотеки, полученной из рассматриваемого организма. Альтернативно, меченый олигонуклеотидный зонд, содержащий гомологи последовательностей гена другой известной глюкоамилазы, может быть использован в качестве зонда для идентификации глюкоамилазокодирующих клонов с использованием гибридизации и условий промывки от очень низкой до очень высокой жесткости. Это описано выше.

Еще другой способ идентификации глюкоамилазокодирующих клонов включает введение фрагментов геномной ДНК в вектор экспрессии, такой как плазмида, трансформацию глюкоамилаза-отрицательных бактерий получаемой библиотеки геномных ДНК и затем высевание трансформированных бактерий на агар, содержащий субстрат для глюкоамилазы (т.е. мальтозу), с обеспечением в результате идентификации клонов, экспрессирующих глюкоамилазу.

Альтернативно, ДНК-последовательность, кодирующая фермент, может быть получена синтетически установленными стандартными способами, например, фосфороамидитным способом, описанным S.L. Beaucage and M.H. Caruther, (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, или способом, описанным Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, p. 801-805. В фосфороамидитном способе синтезируют олигонуклеотиды, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, гибридизуют, лигируют и клонируют в соответствующие векторы.

Наконец, ДНК-последовательность может быть смешанного геномного и синтетического происхождения, смешанного синтетического и кДНК происхождения или смешанного геномного и кДНК происхождения, полученная лигирующими фрагментами синтетического, геномного или кДНК происхождения (как присуще, фрагменты соответствуют различным частям полной ДНК-последовательности) в соответствии со стандартной технологией. ДНК-последовательность может быть также получена цепной полимеразной реакцией (PCR) с использованием специальных затравок, например, как описано в US 4683202 или R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, pp. 487-491.

Сайт-направленный мутагенез

Как только выделяется глюкоамилазокодирующая ДНК-последовательность и идентифицируются желательные сайты для мутации, мутации могут быть введены с использованием синтетических олигонуклеотидов. Указанные олигонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, фланкирующие желательные сайты мутации. В специальном способе однонитевой интервал ДНК, глюкоамилазокодирующая последовательность, создается в векторе, несущем ген глюкоамилазы. Затем синтетический нуклеотид, производящий желательную мутацию, гибридизуется в части-гомологе однонитевой ДНК. Оставшийся интервал затем заполняется ДНК-полимеразой I (фрагментом Кленова), и структура лигируется с использованием Т4-лигазы. Отдельный пример данного способа описан в Morinaga et al., (1984), Biotechnology 2, p. 646-639. US 4760025 рассматривает введение олигонуклеотидов, кодирующих множественные мутации при осуществлении минимальных изменений кассеты. Однако, способом Моринага может быть введен даже больший ряд мутаций в любой момент, потому что может быть введена мультитуда олигонуклеотидов различных длин.

Другой способ введения мутаций в глюкоамилазокодирующие ДНК-последовательности описан в Nelson and Long, (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151. Он включает 3-стадийную генерацию PCR-фрагмента, содержащего желательную мутацию, введенную при использовании химически синтезированной ДНК-нити в качестве одной из затравок в PCR-реакциях. Из PCR-генерированного фрагмента ДНК-фрагмент, несущий мутацию, может быть выделен отщеплением эндонуклеазами рестрикции и повторно введен в экспрессирующую плазмиду.

Кроме того, Sierks et al., (1989), “Site-directed mutagenesis at the active site Trp120 Aspergillus awamori glucoamylase. Protein Eng., 2, 621-625; Sierks et al., (1990), “Determination of Aspergillus awamori glucoamylase catalytic mechanism by site-directed mutagenesis at the active site Asp176, Glu179, and Glu180”. Protein Eng. vol. 3, 193-198 также описан сайт-специфический мутагенез в Aspergillus-глюкоамилазе.

Экспрессия вариантов глюкоамилазы

Согласно изобретению ДНК-последовательность, кодирующая вариант глюкоамилазы, полученный способами, описанными выше, или любыми альтернативными способами, известными в области техники, может быть выражена в форме фермента с использованием вектора экспрессии, который обычно включает контрольные последовательности, кодирующие промотор, оператор, сайт связывания рибосомы, сигнал инициирования трансляции и, необязательно, репрессорный ген или различные активаторные гены.

Вектор экспрессии

Рекомбинантным вектором экспрессии, несущим ДНК-последовательность, кодирующую вариант глюкоамилазы изобретения, может быть любой вектор, который может быть традиционно подвергнут рекомбинантным ДНК операциям, и выбор вектора часто зависит от клетки-хозяина, в которую он должен быть введен. Вектором может быть вектор, который при введении в клетку-хозяин интегрируется в геном клетки-хозяина и воспроизводится вместе с хромосомой(ами), в которую он интегрируется. Примеры подходящих векторов экспрессии включают рМТ838.

Промотор

В векторе ДНК-последовательность должна быть функционально соединена с традиционной промоторной последовательностью. Промотором может быть любая ДНК-последовательность, которая показывает транскрипционную активность в клетке-хозяине выбора и может быть получена из генов, кодирующих белки, либо гомологи или гетерологи клетки-хозяина.

Примерами подходящих промоторов для направления транскрипции ДНК-последовательности, кодирующей вариант глюкоамилазы изобретения, особенно, в бактериальном хозяине, являются промотор lac-оперона E.coli, dagA промоторы гена агаразы Streptomyces coelicolor, промоторы гена альфа-амилазы (amyL) Bacillus licheniformis, промоторы гена мальтогенной амилазы (amyM) Bacillus stearothermophilus, промоторы альфа-амилазы (amyQ) Bacillus amyloliquefaciens, промоторы генов xylA и xylB Bacillus subtilis и т.д. Для транскрипции в грибковом хозяине примерами используемых промоторов являются промоторы, производные от гена, кодирующего A. oryzae TAKA амилазу, промотор триозафосфатизомеразы (TPI) из S. cerevisiae (Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, p. 419-434), аспарагиновая протеиназа Rhizomucor miehei, нейтральная альфа-амилаза A. niger, кислотостойкая альфа-амилаза A. niger, глюкоамилаза A. niger, липаза Rhizomucor miehei, щелочная протеаза A. oryzae, триозафосфатизомераза A. oryzae или ацетамидаза A. nidulans.

Вектор экспрессии

Вектор экспрессии изобретения может также содержать подходящий терминатор транскрипции и, в эукариотах, последовательности полиаденилирования, функционально соединенные с ДНК-последовательностью, кодирующей вариант глюкоамилазы изобретения. Последовательности терминирования и полиаденилирования могут быть традиционно получены из тех же источников, что и промотор.

Вектор может, кроме того, содержать ДНК-последовательность, обеспечивающую возможность вектору вопроизводится в рассматриваемой клетке-хозяине. Примерами таких последовательностей являются области начала репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 и pIJ702.

Вектор может также содержать селектируемый маркер, например, ген продукта, из которого комплементируется дефект в клетке-хозяине, такой как dal-гены из B. subtilis или B. licheniformis, или маркер, который придает устойчивость к действию антибиотиков, такую как устойчивость к ампицилину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Кроме того, вектор может содержать селекционные маркеры Aspergillus, такие как amdS, argB, niaD и sC, маркер, дающий рост устойчивости к гигромицину, или селекция может быть котрансформацией, например, как описано в WO 91/17243.

Методики, используемые для лигирования конструкции ДНК по изобретению, кодирующей вариант глюкоамилазы, промотор, терминатор и другие элементы, соответственно, и для введения их в подходящие векторы, содержащие информацию, необходимую для воспроизведения, хорошо известны специалистам в данной области техники (ср., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).

Клетки-хозяева

Клетка изобретения, содержащая либо ДНК-конструкцию, либо вектор экспрессии изобретения, как определено выше, преимущественно используется как клетка-хозяин в рекомбинантном производстве варианта глюкоамилазы изобретения. Клетка может быть трансформирована ДНК-конструкцией по изобретению, кодирующей вариант, традиционно при интеграции ДНК-конструкции (в одной или нескольких копиях) в хромосому-хозяин. Указанная интеграция обычно считается преимуществом, когда ДНК-последовательность более вероятно стабильно поддерживается в клетке. Интеграция ДНК-конструкций в хромосому-хозяин может быть осуществлена в соответствии с традиционными способами, например, рекомбинацией гомологов или гетерологов. Альтернативно, клетка может быть трансформирована вектором экспрессии, как описано выше в связи с различными типами клеток-хозяев.

Клеткой по изобретению может быть клетка высшего организма, такого как млекопитающее, насекомого или растения, но, предпочтительно, ею является микробная клетка, например, бактериальная или грибковая (включая дрожжи) клетка.

Примерами подходящих бактерий являются положительные бактерии Грама, такие как Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, или Streptomyces lividans или Streptomyces murinus, или грамотрицательные бактерии, такие как E.coli. Трансформация бактерий может быть осуществлена, например, протопластической трансформацией или при использовании компетентных клеток способом, известным как таковой.

Дрожжевой организм может быть благоприятно выбран из частиц Saccharomyces или Schizosaccharomyces, например, Saccharomyces cerevisiae.

Клеткой-хозяином может также быть нитевидный грибок, например, штамм, принадлежащий к частицам Aspergillus, наиболее предпочтительно, Aspergillus oryzae или Aspergillus niger, или штамм Fusarium, такой как штамм Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (в законченном состоянии называемый Gribberella zeae, предварительно Sphaeria seae, синоним Gibberella roseum и Gibberella roseum f. sp. cerealis) или Fusarium sulphureum (в законченном состоянии называемый Gibberella puricaris, синоним Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum и Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (синоним Fusarium crokkwellnse) или Fusarium venenatum.

В предпочтительном варианте изобретения клеткой-хозяином является дефицитный по протеазе, или протеаза-минус, штамм.

Это может быть, например, дефицитный по протеазе штамм Aspergillus oryzae JaL 125, имеющий удаленный ген щелочной протеазы, называемый “alp”. Данный штамм описан в WO 97/35956 (Novo Nordisk) или в патенте ЕР 429490.

Нитевидные грибковые клетки могут быть трансформированы способом, включающим образование протопласта и трансформацию протопластов с последующей регенерацией стенки клетки известным самим по себе образом. Использование Aspergillus в качестве микроорганизма-хозяина описано в ЕР 238023 (Novo Nordisk A/S), содержание которого поэтому приводится в качестве ссылки.

Экспрессия вариантов глюкоамилазы в растениях

ДНК-последовательность, кодирующая рассматриваемый полипептид, такой как глюкоамилаза настоящего изобретения, может быть трансформирована и экспрессирована в трансгенных растениях, как описано ниже.

Трансгенное растение может быть двудольным или однодольным (для краткости dicot или monocot). Примерами однодольных растений являются злаки, такие как мятлик луговой (пырей, Поа), фуражный злак, такой как Festuca, Lolium, умеренный злак, такой как Agrostis, и зерновые злаки, например, пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза).

Примерами двудольных растений являются табак, бобовые, такие как люпины, картофель, сахарная свекла, горох, бобы и соя, и крестоцветные растения (семейство Brassicaceae), такие как цветная капуста, рапс и близко родственный модельный организм Arabidopsis thaliana.

Примерами частей растений являются стебель, каллюс, листья, корень, плоды, семена и клубни, а также отдельные ткани, составляющие эти части, например, эпидермис, мезофилл, паренхима, сосудистые ткани, меристемы. В настоящем контексте частью растения считаются отдельные отсеки растительной клетки, такие как хлоро