Способы получения растворимых многопроходных трансмембранных белков

Способы получения растворимых многопроходных трансмембранных белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Сложные трансмембранные белки трудно экспрессировать в клетках-хозяевах. Обычно эти белки токсичны для хозяина, а различные системы экспрессии дают низкие выходы экспрессированного белка. Кроме того, эти трансмембранные полипептиды трудно солюбилизировать, агрегация и денатурация затрудняют получение белкового продукта удовлетворительного качества и в количестве, достаточном для эффективного применения.

Примером трансмембранного белка является подсемейство с 4 доменами семейства гена A (MS4A), которое включает CD20, β цепь высокоаффинного рецептора IgE, HTm4 и т.п. Эти белки являются структурно родственными, по меньшей мере, в 4 трансмембранных доменах клеточной поверхности (Ishibashi et al., 2001, Gene 264: 87-93). Хотя интервалы идентичности всей аминокислотной последовательности в полипептидах семейства MS4A составляют 25-40%, аминокислоты первых трех трансмембранных доменов имеют более высокую степень идентичности и гомологии, чем полипептид в целом (Ishibashi et al., 2001, Supra; Liang el al., 2001, Genomics 72: 119-127). Структурно полипептиды MS4A также имеют общий мотив внеклеточной петли. Как N-, так и С-конец полипептида MS4A обнаружены на стороне цитоплазмы клеточной мембраны (Ishibashi et al., 2001, Supra). N- и С-концы выявляют значительно более высокую дивергенцию последовательностей между полипептидами семейства гена MS4A (Ishibashi el al., 2001, Supra).

Несмотря на значительное структурное сходство, полипептиды семейства гена MS4A неодинаково экспрессируются в отдельных типах клеток (Liang et al., 2001, Supra). CD20 экспрессируется исключительно в В клетках (Stashenko et al., 1980, J. Immunol, 125: 1678-1685). β цепь высокоаффинного рецептора IgE (FcεRIβ) экспрессируется исключительно в тучных клетках и базофилах (Kinet, 1999, Annu. Rev. Immunol, 17: 931-972). FcεRIβ связывает IgE и опосредует внутриклеточную передачу сигнала (т.е. дегрануляцию), инициированную связыванием антигена (Dombrowicz et al., 1996, Immunity. 8: 517-529; Lin et al., 1996, Cell, 85:985-995). HTm4 экспрессируется в гемопоэтической ткани и служит в качестве регулятора клеточного цикла гемопоэтических клеток (Donato et al., 2002, J. Clin. Invest., 109: 51-58). Эти белки имеют общее свойство, сложную структуру трансмембранных белков. Это свойство очень затрудняет экспрессию в клетке-хозяине и солюбилизацию при использовании клеточной мембраны в "нативной" конфигурации.

Трансмембранные полипептиды, например CD20, являются потенциальными мишенями для терапевтических средств при лечении заболеваний, таких как рак и аутоиммунные заболевания. Первоначально CD20 был идентифицирован в качестве маркера для В клеток более 20 лет назад, а в настоящее время установлено, что в качестве маркера он присутствует в большинстве В клеточных лимфом. CD20 является мишенью для терапии с помощью моноклональных антител при лечении неходжкинской лимфомы (NHL), и, в частности, мишенью для химерного антитела ритуксимаба (RTTUXAN^®), ведущего лекарственного препарата при лечении NHL. Ритуксимаб распознает CD20, экспрессирующийся на В клетках. Связывание ритуксимаба зависит от конформации, он связывается с CD20 в зависимости от структуры петли между третьим и четвертым трансмембранными спиральными доменами, содержащими цистеиновые остатки в положениях 167 и 183.

Значительное препятствие в создании терапевтических препаратов, нацеленных на трансмембранные полипептиды, такие как CD20, представляет неспособность продуцировать достаточные количества этих полипептидов в клетках-хозяевах, в частности в бактериальных клетках, и неспособность получать очищенные рекомбинантные или природные трансмембранные полипептиды в нативной конформации. Необходимы способы получения и солюбилизации природных/или рекомбинантных трансмембранных полипептидов в нативной конформации.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время найдено, что трансмембранные полипептиды, например, состоящие из единичного трансмембранного домена или множества трансмембранных доменов, можно эффективно продуцировать в бактериальных клетках-хозяевах и солюбилизировать при использовании клеточных мембран с хорошим выходом и с адекватной нативной конформацией для того, чтобы их можно было использовать в качестве иммуногенов и лигандов, например, в количественном анализе. Трансмембранные полипептиды можно продуцировать, выделять и солюбилизировать способами по данному описанию, с хорошим выходом и с подходящей "нативной" конформацией.

Способы продуцирования трансмембранных полипептидов включают экспрессию в клетках, например в бактериальных клетках, под контролем активного строго регулируемого промотора, например, phoA промотора в Е.coli. В одном варианте изобретения строго регулируемый промотор содержит как элемент позитивного контроля, так и элемент негативного контроля и может содержать ряд таких элементов. Промотор может быть мутантным промотором, например, таким, в который встроен гетерологичный элемент позитивного или негативного контроля. Кроме того, промотор может содержать терминаторы транскрипции, например терминаторы транскрипции лямбда, позиционированные таким образом, чтобы предупредить возможное считывание возможного "апстрим" промотора. Для экспрессии белка в Е.coli промотор может являться, например, phoA или его мутациями, содержащими дополнительные элементы негативного контроля, такими как phac и tphac, мутантные промоторы, раскрываемые ниже, в разделе Примеры, которые содержат дополнительный оператор lac.

Векторы для экспрессии трансмембранных полипептидов включают полинуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный полипептид под контролем строго регулируемого промотора. Такие полипептиды включают, например, полипептиды, имеющие, по меньшей мере, четыре трансмембранных домена, такие как CD20 и мутантный C2S-CD20, раскрываемый ниже, в разделе Примеры. Кодируемые полипептиды могут иметь один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или двадцать четыре или более трансмембранных домена. Другие примеры включают рецептор EG-VEGF, GPR73, имеющий семь трансмембранных доменов, бета цепь высокоэффективного IgE рецептора (FcεRIβ), HTm4, MS4A4A, MS4A6, MS4A7 и RA1c. Вектор может также включать гены тРНК с редкими кодонами бактериальной клетки-хозяина, и/или полинуклеотидную последовательность, прилегающую непосредственно к первому кодону, кодирующую лидерный пептид, для стимуляции инициации трансляции. Лидерная последовательность обычно содержит последовательность инициации трансляции (TIS) и спейсер для эффективной элонгации. Последовательность инициации трансляции в данном описании называют TIS, но ее также называют областью инициации трансляции (ТIR).

В одном варианте изобретения лидерная последовательность содержит активную TIS, кодирующую, по меньшей мере, часть trp лидерной последовательности, например около 6-12 аминокислот. Спейсерная последовательность отделяет последовательность инициации трансляции от первой трансмембранной области и обычно кодирует малый внутренний участок белка, известного как хорошо экспрессирующийся в клетке-хозяине, например, такого как "Е" белок в Е.coli. Спейсерная последовательность обычно неструктурирована и в значительной степени гидрофильна.

В одном варианте изобретения вектор для экспрессии растворимых мультитрансмембранных белков содержит строго регулируемый промотор, такой как phoA промотор или его мутант, элементы негативного и/или позитивного контроля и полинуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность, включающую активную последовательность инициации трансляции и спейсерную последовательность для элонгации трансляции, позиционированную между TIS и первой трансмембранной областью белка.

Например, векторы могут содержать phoA, phac или tphac промотор, элемент негативного контроля, такой как оператор lac, лидерную последовательность, кодирующую последовательность инициации трансляции, например, участок trp лидера, такой как аминокислотная последовательность из девяти аминокислот KAIFVLKGS, и спейсерную последовательность, кодирующую последовательность трансляции элонгации, такую как участок гена trp Е, например, найденный в LE лидерной последовательности (SEQ ID NO: 25) или sLE лидерной последовательности (SEQ ID NO: 26) по данному описанию.

Трансмембранные полипептиды можно собирать и очищать от мембран клетки-хозяина солюбилизацией в детергенте. В одном варианте изобретения для солюбилизации трансмембранных полипептидов используют неионные или цвиттерионные детергенты, такие как н-додецилфосфохолин, DDPC. Выделенные мультитрансмембранные полипептиды, такие как CD20, растворимы в этих детергентах. Выделенные растворимые мультитрансмембранные полипептиды содержат адекватную (удовлетворительную) "нативную" структуру для распознавания антителами, которые узнают полипептиды, экспрессирующиеся на поверхности клеток, и применимы в качестве иммуногенов и лигандов для анализа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 в виде диаграммы представлен CD20, присутствующий на В клеточной мембране. Последовательность и предполагаемая общая топология CD20 представлены относительно мембраны клеточной поверхности.

На Фигуре 2 показан Вестерн-блоттинг меченного His CD20 с применением антител к His-метке. На панели показаны: а) фракции, содержащие CD20, после флотации клеточных мембран клеток Е.coli в градиенте (плотности) сахарозы. Аликвоты фракций (указанных номерами наверху) градиента сахарозы подвергают электрофорезу на SDS-PAGE геле. Наносят пятно геля и анализируют с помощью антитела к His метке. Показаны фракции от самой низкой плотности сахарозы до самой высокой. На панели b) показаны уровни His-меченного CD20 на Вестерн-блоте после экстракции Е.coli мембран различными детергентами. После экстракции различными детергентами метят супернатанты (S) и осадок (пеллеты) (Р). (WC) обозначает экстракт цельных клеток (контроль). Цифры 1-7 обозначают различные тестируемые детергенты, они представляют собой SDS (1), н-лаурилсаркозин (2), н-додецил-N,N-диметиламин-N-оксид (LADO) (3), н-додецилфосфохолин (DDPC) (4), н-додецил-β-D-мальтозид (DDM) (5), Трилон-Х 100 (6) и CHAPS (7). На панели с) показаны уровни меченного His полипептида CD20, детектированные Вестерн-блоттингом с применением антитела к метке His, для клеток Е.coli, экспрессирующих меченные His нативный человеческий CD20 и C2S мутантный CD20. Дорожки 1 и 4 изображают контрольный, холостой вектор, дорожки 2 и 5 изображают меченный His человеческий CD20, а дорожки 3 и 6 изображают C2S мутантный CD20. Образцы на дорожках 1, 2 и 3 тестируют в невосстанавливающих условиях; образцы на дорожках 4, 5 и 6 восстанавливают с помощью 100 мМ DTT. Все дорожки содержат равный объем клеток, нормализованный по оптической плотности.

На Фигуре 3 показаны дорожки с окрашенным Кумасси синим SDS гелем очищенного, меченного His человеческого CD20, C2S мутантного и мышиного CD20. Дорожки 1, 2 и 3 панели а) содержат невосстановленные белки: человеческий CD20 (дорожка 1), C2S мутантный (дорожка 2) и мышиный CD20 (дорожка 3). Дорожка 4 содержит маркеры молекулярной массы (Mark 12, Invitrogen). На дорожках 5, 6 и 7 показаны восстановленные белки: человеческий CD20 (дорожка 5), C2S мутантный (дорожка 6) и мышиный CD20 (дорожка 7). На дорожках 8 и 10 показаны невосстановленный и восстановленный очищенные мышиные CD20 соответственно. На дорожке 9 представлены маркеры молекулярной массы. Каждая дорожка содержит 2 мкг (микрограмма) белка. Молекулярные массы маркеров 200, 116, 97, 66, 55, 36, 30, 22, 14 и 6 кДа.

На Фигуре 4 изображен график, показывающий дисульфид-зависимое связывание антитела ритуксимаба с меченным His человеческим CD20 (закрашенные квадраты), восстановленным и алкилированным hCD20 (закрашенные кружки), восстановленный и снова окисленный hCD20 (незакрашенные квадраты) и PBS контроль (незакрашенные кружки).

На Фигуре 5 представлена BIAcore сенсограмма, изображающая связывание между ритуксимабом и меченным His человеческим CD20. Связывание человеческого CD20 с иммобилизованным ритуксимабом происходит при концентрациях CD20 5 мкМ, 2.5 мкМ, 1.25 мкМ, 0.63 мкМ, 0.31 мкМ, 0.16 мкМ, 0.08 мкМ и 0.04 мкМ. Концентрации первых 4 образцов помечены на сенсограмме. Расчетная теоретическая кривая для неассоциированной модели показана для каждой концентрации.

На Фигуре 6 показаны спектры кругового дихроизма белков CD20 в дальней ультрафиолетовой области. На панели (а) показаны спектры C2S мутанта человеческого CD20 в присутствии 0.1% DDPC (черная линия); в 0.1% DDPC и 10 мМ (3-меркаптоэтанола (пунктирная линия), и после термального сканирования до 95°С в присутствии 1% SDS (серая линия). На панели (b) показаны спектры мышиного CD20 в присутствии 0.1% DDPC (пунктирная линия), 0.1% додецилмальтозида (DDM) (серая линия); и в 0.1% DDM с добавлением 1% SDS и β-меркаптоэтанола и после нагревания в течение 2 минут при 95°С (черная линия). Данные выражаются в виде молярной эллиптичности.

На Фигуре 7 показаны кривые замещения ритуксимаба IgG и Fab с выделенными нормальными В клетками. Величина ЕС₅₀ для нативного CD20 в данном анализе равна 9.5 нМ. Связывание определяют конкурентной реакцией немеченого ритуксимаба IgG к ¹²⁵I-IgG за донор 1 (панель а) или немеченого ритуксимаба Fab к ¹²⁵I-Fab за донор 4 (панель b). См. в Таблице 4 величины аффинностей и число рецепторов от каждого донора.

На Фигуре 8 показана конструкция вектора экспрессии и Вестерн-блот, показывающий экспрессию полипептидов семейства MS4A в Е.coli, включая полипептиды MS4A6A, MS4A7 и MS4A4A.

На Фигуре 9 изображен Вестерн-блот, показывающий полипептид RA1c, экспрессирующийся вследствие неполного блокирования при использовании неиндуцированного phoA промотора (pEfRA1c) и мутантного промотора, phac (pEfRA1Cr), детектируемый с помощью антитела к His метке.

На Фигуре 10 показан Вестерн-блот, изображающий продолжительность экспрессии полипептида RA1c при использовании промотора phoA (pEfRA1C), индуцируемого разведением в средах, лимитированных по фосфатам.

На Фигуре 11 показан Вестерн-блот, изображающий продолжительность экспрессии полипептида RA1c при использовании промотора phac (pEfRA1Cr), индуцируемого разведением в лимитированных по фосфатам средах и добавлением IPTG.

На Фигуре 12 представлен Вестерн-блот, сравнивающий экспрессию RA1c при использовании индуцированных промоторов phoA и phac.

На Фигуре 13 представлен Вестерн-блот, показывающий EG-VEGF рецептор, полипептид GPR73, экспрессирующийся в Е.coli вследствие частичного блокирования при использовании неиндуцированного phoA промотора (средняя дорожка) и мутантного промотора, phac (правая дорожка).

На Фигуре 14 представлен Вестерн-блот, изображающий продолжительность экспрессии полипептида GPR73 при использовании промотора phoA, индуцированного разведением в средах, лимитированных по фосфатам.

На Фигуре 15 представлен Вестерн-блот, изображающий продолжительность экспрессии полипептида GPR73 при использовании промотора phac, индуцированного разведением в средах, лимитированных по фосфатам, и добавлением IPTG.

На Фигуре 16 представлен Вестерн-блот, сравнивающий максимальную экспрессию GPR73 при использовании индуцированных промоторов phoA и phac.

На Фигуре 17 представлен Вестерн-блот, изображающий полипептид MS4A4A, экспрессированный вследствие частичного блокирования при использовании промотора phoA (средняя дорожка) и мутантного промотора, tphac (правая дорожка).

На Фигуре 18 представлен Вестерн-блот, изображающий продолжительность экспрессии полипептида MS4A4A при использовании промотора phoA, индуцированного разведением в средах, лимитированных по фосфатам.

На Фигуре 19 представлен Вестерн-блот, изображающий продолжительность экспрессии полипептида MS4A4A при использовании промотора tphac, индуцированного разведением в средах, лимитированных по фосфатам, и добавлением IPTG.

На Фигуре 20 представлен Вестерн-блот, сравнивающий максимальную экспрессию MS4A4A при использовании индуцированных промоторов phoA и tphac.

На Фигуре 21 схематически представлены конструкции для экспрессии мультитрансмембранных полипептидов. Показаны типичные составляющие экспрессирующих векторов.

На Фигуре 22 показана аминокислотная последовательность лидеров trpLE и sLE.

На Фигуре 23 схематически представлена диаграмма экспрессирующего вектора для экспрессии CD20 и окрашенный Кумасси синим гель, показывающий экспрессию и продуцирование CD20 и LE.CD20 в клетках Е.coli.

На Фигуре 24 показан Вестерн-блот и окрашенный Кумасси синим гель, демонстрирующий экстракцию LE.CD20, экспрессированного в клетках Е.coli.

На Фигуре 25 схематически представлена диаграмма экспрессирующего вектора для экспрессии RA1c или GPR73 и Вестерн-блот, показывающий экспрессию LE.RA1c и LE.GPR73 по сравнению с контрольными белками.

На Фигуре 26 представлен гель, окрашенный Кумасси синим, показывающий белок LE.RA1c, экспрессированный и экстрагированный из клеточных мембран Е.coli.

На Фигуре 27 представлен Вестерн-блот, показывающий LE.GPR73, экстрагированный из клеточных мембран Е.coli cell.

На Фигуре 28 представлен график, изображающий связывание специфичного к конформации CD20 антитела, ритуксимаба, с LE.CD20 и sLECD20, экспрессированными в Е.coli и экстрагированными, как описано в Примере 10. Для образцов sLE и LE метку LE удаляют расщеплением (гидролизом) тромбином, а образцы окисляют диализом. Незакрашенные кружки; hCD20, экспрессированный с LE меткой, незакрашенные треугольники; hCD20, экспрессированный с sLE меткой, закрашенные кружки; hCD20, экспрессированный с меткой HQ (на лидере LE), и х; PBS контроль.

Таблица последовательностей
SEQ ID NO:	Название	Последовательность	Ссылка
1	человеческий CD20	Белок	NP068769 Таблица 2, стр.50
2	человеческий CD20	ДНК	NCBI BC002807
3	мышиный CD20	Белок	Таблица 2, стр.50
4	мышиный CD20	ДНК	NCBINM 007641
5	E.coli phoA промотор	ДНК	Таблица 5, стр.59
6	человеческий C2S мутант	Белок	Таблица 2, стр.594
7	MKHQHQQ	Пептид	44, 63, 67
8	Окта-His	Пептид	44, Пример 7
9	человеческий MS4A4A	ДНК	NCBI BC020648
10	человеческий MS4A4A	Белок	NCBI AAH20648
11	человеческий MS4A6A	ДНК	NCBI AF237908
12	человеческий MS4A6A	Белок	NCBI AAK37417
13	человеческий MS4A7	ДНК	NCBI AF237916
14	человеческий MS4A7	Белок	NCBI AAK37599
15	phac промотор	ДНК	Таблица 5, стр.59
16	tphac промотор	ДНК	Таблица 5, стр.59
17	Терминатор транскрипциилямбда	ДНК	Таблица 5, стр.59
18	Lac оператор	ДНК	Таблица 5, стр.59
19	"Апстрим" последовательность с терминатором транскрипции	ДНК	Таблица 5, стр.59
20	pho бокс	ДНК	Таблица 5, стр.59
21	человеческий RA1c	ДНК	NCBI BC020768
22	человеческий RA1c	Белок	NCBI AAH20768
23	человеческий GPR73	ДНК	NCBI AB084080
24	человеческий GPR73	Белок	ВАС24021
25	LE	Белок	Пример 7
26	sLE	Белок	Пример 7
27	(M)KAIFVLKGS (TIS)	Белок	Пример 7
28	(ATG) AAA CAC CAA CAC CAA CAA (TIS)	ДНК	Фигура 21
29	AA 339-408 trpE (LE спенсер)	ДНК	Пример 7
30	прерывистая последовательность из 38 аминокислот из trpE (спейсер sLE)	ДНК	Пример 7
31	LVPRGS (сайт узнавания тромбина)	Белок	Пример 7
32	DYKDDDDK (flag метка)	Белок	Пример 8
33	MGSSHHHHHH	Пептид	29
34	ATGGGCAGCAGCCATCA Т САТСАТСАТСАТ	ДНК	29
35	ATGAAAGCAATTTTCGT A CTGAAAGGTTCA	ДНК	30

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Определения

Антитело "со "зрелой" (повышенной) аффинностью" представляет собой антитело, содержащее одно или более изменений в одной или более гипервариабельных областей, которые повышают аффинность связывания антитела с целевым антигеном. Антитела со "зрелой" аффинностью могут иметь наномолярные или пикомолярные аффинности к целевому антигену. Антитела со "зрелой" аффинностью можно получать методами, известными в уровне техники, таким, например, как "перетасовка экзонов" (шаффлинг) VH и VL доменов (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10: 779-783), случайный мутагенез остатков CDR и/или каркасных остатков (Barbas et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813; Scier et al., 1995, Gene, 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154: 3310-3319; и Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226: 889-896), и метод фагового дисплея (Lowman et al., 1991, Biochemistry. 30: 10832-10838; Hawkins et al., 1992, J. Mol Biol., 226, 889-896; Патент США 6172213).

Термины "антитело" и "иммуноглобулин" применяются взаимозаменяемо в самом широком смысле и включают моноклональные антитела (полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, гуманизированные, мультивалентные антитела, полиспецифические антитела при условии, что они проявляют нужную биологическую активность, и фрагменты антитела.

"Фрагменты антитела" содержат участок интактного антитела, обычно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают, но без ограничения, Fab фрагменты, Fab′ фрагменты, Fd′ фрагмент, Fv фрагмент, Fd фрагмент, F(ab′)₂ фрагмент, dAb фрагмент, антитела без шарнирного участка, одноцепочечные антитела, искусственно созданные мини-антитела (diabodies), "одноплечие" антиген-связывающие молекулы (содержащие легкую цепь, тяжелую цепь и усеченную по N-концу константную область тяжелой цепи, достаточную для образования Fc области, способной повышать период полужизни "одноплечей" антиген-связывающей молекулы) и линейные антитела.

Термин "моноклональное антитело" по данному описанию относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, образующие популяцию, практически идентичны, за исключением вариантов, которые могут возникать в процессе продуцирования антитела.

Термин "моноклональные антитела" конкретно включает "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых участок тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или субклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах из других видов или принадлежащим к другому классу или субклассу антител, а также фрагменты таких антител при условии, что они проявляют заданную биологическую активность (патент США 4816567; Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855).

Термин "биологический образец" относится к образцу из организма любого животного, такого как млекопитающее, например человек. Биологический образец можно получать, например, от больных сосудистыми заболеваниями, диабетом, раком. Биологический образец может представлять собой, например, биологические жидкости, такие как сыворотка, плазма, стекловидная жидкость, лимфатическая жидкость, синовиальная жидкость, фолликулярная жидкость, семенная жидкость, околоплодная жидкость, молоко, цельная кровь, моча, спинномозговая жидкость, слюна, мокрота, слезы, пот, слизь и тканевая культуральная среда, а также тканевые экстракты, такие как гомогенизированная ткань, клеточные экстракты, или цельные клетки или ткани. Например, биологический образец может представлять собой сыворотку, плазму или мочу.

"Буфер" по данному описанию относится к забуференному раствору, который устойчив к изменениям рН за счет действия своих компонентов: кислоты и сопряженного основания.

Термин "CD20 мутант" или "CD20 вариант" относится к CD20 полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от эталонной CD20 аминокислотной последовательности, или кодируемую нуклеотидной последовательностью, отличающейся от эталонной CD20 нуклеотидной последовательности. CD20 мутант включает изменение аминокислотной последовательности, которое можно осуществить заменой, делепией или инсерцией одной или более аминокислот в эталонной последовательности.

Термин "реагент для "захвата"" (захватывающий реагент) относится к реагенту, способному связывать или захватывать целевую молекулу в образце. Комплекс-реагент для захвата - молекула-мишень можно отделять от остальной части образца при определенных условиях. Захватывающий реагент может быть иммобилизованным или иммобилизуемым. Например, в иммуноферментном сэндвич-анализе захватывающим реагентом может являться антитело или смесь различных антител к целевому антигену.

Термин "детергент" относится к агенту, который может содержать соли длинноцепных алифатических оснований или кислот, или гидрофобные частицы, такие как сахара, и который обладает как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами. Обладая как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами, детергент может вызывать особый эффект. Детергенты по данному описанию обладают способностью разрушать клеточные мембраны и солюбилизировать полипептиды.

Термин "детектируемое (обнаруживаемое) антитело" относится к антителу, которое можно обнаруживать с помощью метки, амплифицированной с помощью метода обнаружения, или опосредованно, например, с помощью другого, меченого антитела. Для прямого мечения антитело обычно конъюгируют с частицей, которую можно обнаружить каким-либо методом. Обычно антитело можно метить детектируемой меткой, включая, но без ограничения, флуоресцентную метку, радиоизотоп или ферментный субстрат ("ферментно-субстратная метка"). Метка может быть непрямо конъюгирована с антителом. Например, антитело может быть конъюгировано с биотином или любым из трех категорий меток, указанных выше, а любая из трех широких категорий указанных выше меток может быть конъюгирована с авидином, или наоборот. Биотин селективно связывается с авидином и таким образом метка может конъюгироваться с антителом таким непрямым способом. Или же, для осуществления непрямого конъюгирования метки с антителом антитело конъюгируют с малым гаптеном (например, дигоксином), а метка одного из различных указанных выше типов конъюгируется с антителом к гаптену (например, антителом против дигоксина).

Термин "детектирующий реагент" (реагент для обнаружения) относится к обнаружению (детектированию) метки и включает детектирующие агенты, которые амплифицируют иммобилизованную метку таким образом, что происходит захват метки на микротитрационном планшете. Способом обнаружения может включать, например, детектирующий агент, такой как авидин или стрептавидин, меченный флуоресцентной или хромофорной частицей.

Термин "метка экспрессии" относится к пептидной последовательности или метке, связанной с N- или С-концом зрелого полипептида или конъюгированной с конкретным остатков в зрелом полипептиде, которая предоставляет один способ идентификации и/или выделения экспрессированного полипептида. Метка экспрессии может кодироваться как компонент вектора или содержать часть встроенной в вектор экспрессии последовательности, кодирующей полипептид. Примеры меток экспрессии включают, но без ограничения, метки поли-His ("хвосты") (патент США 4569794), FLAG, myc, биотин, авидин и т.п. Такие метки общеизвестны и выпускаются промышленностью (см., например, Qiagen, Valencia, CA).

Термин "гетерологичный" относится к элементам, встречающимся там, где обычно они не обнаруживаются. Например, промотор может быть связан с гетерологичной нуклеотидной последовательностью, например с последовательностью, которая обычно не встречается как функционально связанная с промотором. В данном описании в применении к промоторному элементу гетерологичный означает промоторный элемент, который отличается от промоторного элемента, обычно связанного функционально с нативным промотором, либо последовательностью, либо видом, либо числом. Например, гетерологичный контрольный элемент в промоторной последовательности может являться контрольным/регуляторным элементом другого (отличного) промотора, добавленного для усиления контроля промотора, или дополнительным контрольным элементом того же самого промотора.

Выражение "индуцировать экспрессию" по данному описанию означает количественно повысить транскрипцию и/или трансляцию при использовании специфических генов экспозицией клеток, содержащих такие гены, с эффектором или индуктором, которыми могут быть реагент или условие.

"Индуктор" ("индуцирующий фактор") представляет собой химический или физический агент, который, в случае применения его к популяции клеток, количественно повышает транскрипцию при использовании специфических генов. Индукторы обычно представляют собой малые молекулы, чье действие является специфическим в отношении конкретных оперонов или групп генов, и могут включать сахара, фосфат, спирт, ионы металлов, гормоны, тепло, холод и т.п. Например, изопропил (бета)-D-тиогалактопиранозид (IPTG) и лактоза являются индукторами промотора tacII, a L-арабиноза является подходящим индуктором промотора арабинозы. Промотор гена pho, такой как phoA (Chang et al., 1987, Gene, 55: 189-196) и pho5, индуцируется при низкой концентрации фосфата в среде.

Реагент может "иммобилизоваться" на или в подложке за счет образования ковалентной связи между функциональной группой реагента и реактивной (реакционно-способной) группой на поверхности твердой фазы. В другом варианте изобретения реагент "иммобилизуется" на твердой фазе за счет адсорбции и ионного связывания и может улавливаться в твердой фазе, например, в клетках или латексных полимерах или микрокапсулах (см. Holenberg et al., в Enzymes as Drugs, John Wiley & Sons NY (1981), pages 396-411). Реагент практически сохраняет свою способность связываться с нужным полипептидом и/или модифицировать нужный полипептид, иммобилизованный на твердой фазе.

Термин "выделенный" (изолированный) при описании различных полипептидов, раскрываемых в данном описании, означает полипептид, который был идентифицирован и отделен от и/или регенерирован из его естественного окружения. Выделенный полипептид не ассоциирован, по меньшей мере, ни с одним компонентом, с которым он ассоциирован в естественном состоянии. Загрязняющие примеси из окружающей среды представляют собой материалы, которые обычно мешают при применении полипептида в диагностике или терапии и могут включать ферменты и другие белковые и небелковые растворы. Выделенный полипептид включает полипептид in situ в рекомбинантных клетках. Однако обычно выделенный полипептид получают, по меньшей мере, одной стадией очистки.

"Выделенный CD20" по данному описанию относится к белку CD20, не содержащему клетки или мембраны, и может быть, например, в растворимом виде в растворе детергента.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты или "выделенный" полинуклеотид представляет собой нуклеотидную молекулу, которая идентифицирована и отделена, по меньшей мере, от одной загрязняющей нуклеотидной молекулы, которая обычно ассоциирована с природным источником. Выделенная нуклеиновая кислота может, например, не ассоциироваться ни с какими компонентами, с которыми она ассоциирована в естественном окружении. Выделенная нуклеотидная молекула имеет либо другую форму, либо другие параметры, чем те, которые она имеет в природе.

"IPTG" представляет собой соединение "изопропил (бета)-D-тиогалактопиранозид" и применяется в данном описании в качестве индуктора оперона lac. IPTG связывается с lac-репрессором, вызывая конформационные переходы в lac-репрессоре, которые приводят к диссоциации и отделению lac-репрессора от lac-оператора. Будучи несвязанным с lac-оператором, функционально связанный промотор активируется и транскрибируются гены "даунстрим".

Термин "lac-оператор" относится к нуклеотидной последовательности, которая может быть связана lac-репрессором, lacI, как описано, например, в Jacob et al., 1961, J. Mol. Biol., 3: 318-356. Промотор не активируется, когда lac-репрессор связан с lac-оператором. Когда lac-репрессор индуцируется и диссоциирует от оператора, промотор активируется.

Термин "лидерная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, расположенной "апстрим" (выше) нужной кодирующей последовательности. Лидерные последовательности по данному описанию содержат специфические последовательности, известные как эффективно связывающиеся с рибосомами, тем самым сообщающие большую эффективность инициации трансляции некоторых полинуклеотидов. Как указывается в данном описании, лидерная последовательность содержит последовательность инициации трансляции и спейсерную последовательность, чтобы способствовать элонгации трансляции по данному описанию.

Термин "среда с низким содержанием фосфата" ("низкофосфатная среда") или "среда с ограниченным содержанием фосфата" ("фосфат-лимитирующая среда") по данному описанию относится к средам, содержащим низкую концентрацию фосфата в растворе. Например, промотор phoA включается, при концентрация фосфата в среде от нескольких капель, примерно, до 4 мкМ (микромолей) или менее. Однако создают среды с ограниченным содержанием фосфата, содержащие более 4 мкМ (микромолей) фосфата, которые дают клеткам возможность расти до включения промотора. Примеры сред с ограниченным содержанием фосфата включают, но без ограничения, C.R.A.P. среды, описанные в Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (имеющие начальную концентрацию фосфата, примерно, 1.9 М за счет следовых примесей из дрожжевого экстракта и из других источников), и среды, описанные в Chang et al., 1987, Gene 55: 189-196.

Термин "млекопитающее" по данному описанию относится к любому животному классифицированному как млекопитающее, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных и животных в зоопарке, спортивных животных или комнатных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д.

Термин "MS4A полипептид"относится к полипептиду, кодированному генами подсемейства А (MS4A) семейства трансмембранного белка с 4 доменами. См., например, Ishibashi et al., 2001, Gene, 264: 87-93. Полипептид MS4A может быть природным полипептидом MS4A или вариантом природного полипептида MS4A. Члены семейства MS4A гена представляют собой структурно сходные полипептиды. Каждый пронизывают клеточную мембрану четыре раза, как N-конец, так и С-конец локализован на стороне цитоплазмы клеточной мембраны, и оба содержат внеклеточную петлю протяженностью, примерно, 50 аминокислот. Полипептиды MS4A включают CD20, β цепь высокоаффинного рецептора IgE, HTm4, MS4A4A, MS4A7, и т.п. Термин также включает варианты и изоформы полипептидов, кодирующихся генами MS4A genes. Это семейство генов является консервативным у млекопитающих, и "MS4A полипептид" включает человеческий, мышиный, крысиный и т.п. полипептиды полипептида MS4A.

"Вариант" MS4A полипептида относится к MS4A полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от эталонной последовательности, или кодируется нуклеотидной последовательностью, отличающейся от эталонной последовательности. Эталонная (стандартная) последовательность может представлять собой полноразмерную нативную MS4A полипептидную последовательность, внеклеточный домен MS4A полипептида, или любой другой фрагмент полноразмерной последовательности MS4A полипептида. В некоторых вариантах изобретения эталонная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность природного CD20, например, такую как SEQ ID NO: 1 (аминокислотная последовательность) или SEQ ID NO: 2 (нуклеотидная последовательность). Аминокислотная последовательность варианта MS4A полипептида обычно, по меньшей мере, на 80% идентична эталонной последовательности.

Варианты MS4A полипептида включают "природные" варианты, в том числе аллельные варианты, а также варианты, полученные изменением одного или более нуклеотидов или одной или более аминокислот. Вариантный полипептид можно получать модификацией нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности MS4A полипептида. Например, вариант можно получать добавлением, заменой и/или делецией нуклеотидов или аминокислот. Вариантный MS4A полипептид, применимый в способах по изобретению, может иметь идентичность последовательностей, например, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, около 85%, по меньшей мере, около 90%, по меньшей мере, около 91%, по меньшей мере, около 92%, по меньшей мере, около 93%, по меньшей мере, около 94%, по меньшей мере, около 95%, по меньшей мере, около 96%, по меньшей мере, около 97%, по меньшей мере, около 98%, по меньшей мере, около 99% с эталонной последовательностью MS4A, например с эталонной последовательностью человеческого CD20, такой как SEQ ID NO: 1.