Применения антител против cd40

Применения антител против cd40

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым применениям антител против CD40, в частности к лечению разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с CD40-экспрессирующими клетками.

Уровень техники

Многие члены семейства факторов некроза опухолей (TNF), включающие лиганды и соответствующие рецепторы, регулируют рост нормальных клеток, индуцируя апоптоз или повышая выживание и пролиферацию клеток. Существует баланс между сигналами, вызывающими апоптоз, и сигналами, повышающими выживание и пролиферацию клеток, который сохраняет гомеостаз нормальных клеток. В настоящее время идентифицировано, по крайней мере, 26 рецепторов семейства TNF и 18 лигандов семейства TNF. Биологически активные формы рецепторов и лигандов представляют собой аутособранные тримеры белков. Идентифицированы трансмембранные и растворимые формы рецепторов и лигандов. Несмотря на то, что внутриклеточные домены рецепторов не имеют гомологичных последовательностей, их внеклеточные домены содержат повторы в 40 аминокислот с высоким содержанием цистеина. Их цитоплазматические концевые сегменты передают сигналы в результате взаимодействия с двумя основными группами внутриклеточных белков, которыми являются факторы, ассоциированные с рецепторами TNF (TRAF), и белки, содержащие домен гибели (DD). Взаимодействие между, по крайней мере, шестью TRAF человека и TRAF-связывающими сайтами в цитоплазматическом концевом сегменте некоторых из указанных рецепторов инициирует несколько сигнальных путей, включающих АКТ (серин/треонинкиназа, определяемая как протеинкиназа В или РКВ), ядерный фактор-κВ (NF-κВ) и митогенактивируемые протеинкиназы (МАРК). См., например, обзорную статью Younes and Kadin (2003) J. Clin. Oncol. 18:3526-3534.

Рецептор CD40 семейства TNF является антигеном клеточной поверхности длиной 50-55 кДа, который присутствует на поверхности как нормальных, так и опухолевых В-клеток, дендритных клеток, моноцитов, макрофагов, CD8⁺ Т-клеток, эндотелиальных клеток, моноцитарных и эпителиальных клеток человека и многих солидных опухолей, включающих рак легкого, молочной железы, яичника, мочевого пузыря и ободочной кишки. Связывание лиганда CD40 (CD40L) с антигеном CD40 на В-клеточной мембране вызывает образование положительного костимулирующего сигнала, который стимулирует активацию и пролиферацию В-клеток, в результате чего происходит созревание В-клетки в плазмацит, который секретирует большое количество растворимого иммуноглобулина. CD40 активирует TRAF-2, -3, -5 и -6, которые усиливают различные сигнальные пути после взаимодействия CD40 с CD40L (с мембраносвязанным CD40L или растворимым CD40L), в том числе внеклеточную регулируемую сигналом киназу (ERK), с-jun аминоконцевую киназу (JNK), митогенактивируемую протеинкиназу р38 (МАРК), АКТ и NF-κВ (см., например, публикации Younes and Carbone (1999) Int. J. Biol. Markers 14:135-143; van Kooten and Banchereau (2000) J. Leukoc. Biol. 67:2-17).

Злокачественные В-клетки из опухолей В-клеточной линии дифференцировки экспрессируют CD40 и, по-видимому, зависят от передачи сигналов CD40, определяющих выживание и пролиферацию. Трансформированные клетки, полученные у субъектов, страдающих низкодифференцированной и высокодифференцированной В-клеточной лимфомой, В-клеточным острым лимфолейкозом, множественной миеломой, хроническим лимфолейкозом, макроглобулинемией Вальденстрема и болезнью Ходжкина, экспрессируют CD40. Экспрессия CD40 обнаружена также в случае острого миелобластного лейкоза и в 50% случаев СПИД-ассоциированных лимфом.

Некоторые карциномы и саркомы также характеризуются высокими уровнями экспрессии CD40, хотя роль передачи сигналов CD40 в указанных раковых клетках менее изучена. CD40-экспрессирующие карциномы включают рак мочевого пузыря (Paulie et al. (1989) J. Immunol. 142:590-595; Braesch-Andersen et al. (1989) J. Immunol. 142:562-567), рак молочной железы (Hirano et al. (1999) Blood 93:2999-3007; Wingett et al. (1998) Breast Cancer Res. Treat. 50:27-36); рак предстательной железы (Rokhlin et al. (1997) Cancer Res. 57:1758-1768); рак почки (Kluth et al. (1997) Cancer Res. 57:891-899), недифференцированный рак носоглотки (UNPC) (Agathanggelou et al. (1995) Am. J. Pathol. 147:1152-1160), плоскоклеточный рак (SCC) (Amo et al. (2000) Eur. J. Dermatol. 10:438-442; Posner et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:2261-2270), папиллярные карциномы щитовидной железы (Smith et al. (1999) Thyroid 9:749-755), кожную злокачественную меланому (van den Oord et al. (1996) Am. J. Pathol. 149:1953-1961), рак желудка (Yamaguchi et al. (2003) Int. J. Oncol. 23(6):1697-702) и рак печени (см., например, публикацию Sugimoto et al. (1999) Hepatology 30(4): 920-26, в которой описаны печеночно-клеточные карциномы человека). Для ознакомления с CD40-экспрессирующими саркомами см., например, публикацию Lollini et al. (1998) Clin. Cancer Res. 4(8):1843-849, в которой описаны остеосаркома человека и саркома Юинга.

Передача сигналов CD40 защищает незрелые В-клетки и В-клеточные лимфомы от апоптоза, вызываемого IgM или Fas (см., например, публикацию Wang et al. (1995) J. Immunol. 155:3722-3725). Клетки лимфомы коры головного мозга экспрессируют большое количество CD40, при этом установлено, что введение экзогенного лиганда CD40 повышает выживание клеток и защищает их от апоптоза, вызываемого флударабином (Clodi et al. (1998) Brit. J. Haematol. 103:217-219). Роль передачи сигналов CD40 в выживании и пролиферации раковых В-клеток делает антиген CD40 потенциальной мишенью для противораковой терапии. Действительно, антитела против CD40 ингибируют пролиферацию и/или дифференцировку раковых В-клеток человека in vitro (см., например, публикацию заявки на патент США № 2004/0109857). При исследовании агрессивных лимфом человека в моделях с использованием мышей была продемонстрирована эффективность in vivo антител против CD40 для стимуляции выживания животных. См., например, публикации Funakoshi et al. (1994) Blood 83:2787-2794; Tutt et al. (1998) J. Immunol. 161:3176-3185; и Szocinski et al. (2002) Blood 100:217-223.

Лиганд CD40 (CD40L), известный также как CD154, является трансмембранным белком длиной 32-33 кДа, который также существует в двух биологически активных растворимых формах меньшей длины, соответственно равной 18 кДа и 31 кДа (Graf et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25:1749-1754; Mazzei et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:7025-7028; Pietravalle et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5965-5967). CD40L экспрессирован в активированных, а не находящихся в состоянии покоя, CD4+ Т-клетках-хелперах (Lane et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2573-2578; Spriggs et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1543-1550; и Roy et al. (1993) J. Immunol. 151:1-14). CD40 и CD40L были клонированы и исследованы (Stamenkovi et al. (1989) EMBO J. 8:1403-1410; Armitage et al. (1992) Nature 357:80-82; Lederman et al. (1992) J. Exp. Med. 175:1091-1101; и Hollenbaugh et al. (1992) EMBO J. 11:4313-4321). См. также патент США № 5945513, в котором описан CD40L человека. Клетки, трансфецированные геном CD40L и экспрессирующие белок CD40L на своей поверхности, могут запускать пролиферацию В-клеток и вместе с другими стимулирующими сигналами могут вызывать продуцирование антител (Armitage et al. (1992) см. выше; и патент США № 5945513). У пациентов, страдающих лимфолейкозами, аутоиммунными заболеваниями, сердечно-сосудистыми заболевания и идиопатической тромбоцитопенией, имеют место повышенные уровни растворимого CD40L (sCD40L) в сыворотке, отсутствующие у здоровых субъектов. Конститутивная экспрессия CD40L наблюдалась в подгруппе пациентов, страдающих несколькими В-клеточными лимфолейкозами, включающими лимфому клеток коры головного мозга, фолликулярную лимфому, лимфому маргинальной зоны, хронический лимфолейкоз (CLL), генерализованную В-клеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому (FL) и ВИЧ-инфицированную В-клеточную лимфому. См., например, Clodi et al. (1998) Br. J. Haematol. 103:270-275; Schattner et al. (1998) Blood 91:2689-2697; Moses et al. (1997) Nat. Med. 3:1242-1249; Trentin et al. (1997) Cancer Res. 57:4940-4947; и Pham et al. (2002) Immunity 16:37-50). CD40L может играть важную роль в зависящем от контактирования клеток взаимодействии CD40-экспрессирующих опухолевых В-клеток в опухолевых фолликулах или CD40-экспрессирующих клетках Рида-Стернберга на участках, пораженных болезнью Ходжкина (Carbone et al. (1995) Am. J. Pathol. 147:912-922). Однако механизм CD40L-опосредованной передачи сигналов CD40, вызывающих выживание раковых В-клеток вместо их гибели, полностью не изучен. Например, объяснение механизмов выживания клеток фолликулярной лимфомы предполагало уменьшение вызывающих апоптоз молекул TRAIL (APO-2L) (Ribeiro et al. (1998) British J. Haematol. 103:684-689) и сверхэкспрессию bcl-2, а в случае В-CLL уменьшение CD95 (Fas/APO-1) (Laytragoon-Lewin et al. (1998) Eur. J. Haematol 61:266-271). В отличие от этого данные, полученные при исследовании фолликулярной лимфомы, показывают, что активация CD40 вызывает увеличение TNF (Worm et al. (1994) International Immunol. 6:1883-1890) и молекул CD95 (Plumas et al. (1998) Blood 91:2875-2885).

Моноклональные антитела против CD40 человека и различные применения указанных антител описаны в публикациях совместных заявок на патент WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307 и WO 2005/044294. В указанных заявках, в частности, описано моноклональное антитело против CD40 IgG₁ человека, получившее название CHIR-12.12, которое было создано в результате иммунизации трансгенных мышей, несущих локус тяжелой цепи IgG₁ человека и локус легкой κ-цепи человека (технология XenoMouse®; Abgenix, California).

Как показал анализ методом FACS, антитело CHIR-12.12 специфически связывается с CD40 человека и может предотвращать связывание CD40 с лигандом (CD40L). CHIR-12.12 может препятствовать предварительному связыванию CD40L с CD40 на клеточной поверхности. Моноклональное антитело CHIR-12.12 является сильным антагонистом и ингибирует in vitro CD40L-опосредуемую пролиферацию нормальных и раковых В-клеток. Моноклональное антитело CHIR-12.12 непосредственно ингибирует выживание и сигнальные пути, опосредуемые CD40L в нормальных В-лимфоцитах человека. Антитело CHIR-12.12 убивает in vitro первичные раковые клетки пациентов, страдающих NHL, под воздействием антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Противоопухолевое действие в зависимости от дозы наблюдалось в модели ксенотрансплантированной лимфомы человека. В настоящее время антитело CHIR-12.12 проходит испытания первой стадии для лечения В-клеточных лейкозов.

CD20 является антигеном клеточной поверхности, экспрессируемым в начале дифференцировки В-клеток, который остается на клеточной поверхности на протяжении всего развития В-клеток. CD20 участвует в активации В-клеток, экспрессирован в очень большом количестве в опухолевых В-клетках и является клинически признанной терапевтической мишенью (см., например, публикацию Hooijberg et al. (1995) Cancer Research 55:2627). Антитела, направленно воздействующие на CD20, такие как ритуксимаб (Rituxan®), были одобрены Управлением США по продуктам и лекарственным средствам для лечения неходжкинской лимфомы (см., например, публикацию Boye et al. (2003) Ann. Oncol. 14:520). Установлено, что Rituxan® позволяет эффективно лечить низко-, средне- и высокодифференцированную неходжкинскую лимфому (NHL) и оказывает активное действие в случае других В-клеточных злокачественностей (см., например, публикации Maloney et al. (1994) Blood 84:2457-2466), McLaughlin et al. (1998) J. Clin. Oncol. 16:2825-2833, Maloney et al. (1997) Blood 90:2188-2195, Hainsworth et al. (2000) Blood 95:3052-3056, Colombat et al. (2001) Blood 97:101-106, Coiffer et al. (1998) Blood 92:1927-1932), Foran et al. (2000) J. Clin. Oncol. 18:317-324, Anderson et al. (1997) Biochem. Soc. Trans. 25:705-708, или Vose et al. (1999) Ann. Oncol. 10:58a).

Несмотря на то, что точный механизм действия не известен, имеющиеся данные показывают, что противолимфомное действие ритуксана (Rituxan®) частично возникает вследствие комплемент-опосредованной цитотоксичности (СМС), антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), ингибирования пролиферации клеток и, наконец, прямой индукции апоптоза. ADCC является основным механизмом действия многих представленных на рынке и исследуемых моноклональных антител. Однако у некоторых пациентов возникает устойчивость к лечению препаратом Rituxan® (см. публикации Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20:3262, Grillo-Lopez et al. (1998) J. Clin. Oncol. 16:2825 или Jazirehi et al. (2003) Mol. Cancer Ther. 2:1183-1193). Например, у некоторых пациентов прекращается экспрессия CD20 в раковых В-клетках после лечения антителом против CD20 (Davis et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:611). Кроме того, у 30%-50% пациентов, страдающих низкодифференцированной NHL, не возникает клинической реакции на данное моноклональное антитело (Hainsworth et al. (2000) Blood 95:3052-3056; Colombat et al. (2001) Blood 97:101-106). Было также установлено, что клиническая активность ритуксимаба при лечении NHL зависит от генотипа FcγRIIIa пациента. Пациенты с полиморфизмом V/V или V/F FcγRIIIa 158aa более восприимчивы к воздействию ритуксимаба, чем пациенты с F/F (см., например, публикацию Cartron et al. (2002) Blood 99(3):754-758 или Dall'Ozzo et al. Cancer Res. (2004) 64:4664-4669). Пациентам, у которых возникла устойчивость к данному моноклональному антителу или страдающим В-клеточной лимфомой, устойчивой к первоначальному лечению указанным антителом, необходимы альтернативные формы терапевтического лечения.

Таким образом, существует постоянная потребность в новых лекарственных средствах и новых методах лечения рака и предраковых состояний. В частности, существует потребность в новых методах лечения пациентов, гомозиготных или гетерозиготных в отношении FcγRIIIa-158F, которые не поддаются лечению антителами против CD20, такими как ритуксимаб (Rituxan®). Кроме того, антитело, способное убивать раковые клетки без необходимости использования конъюгата, позволит получить более дешевое лекарственное средство и может оказывать меньше побочных эффектов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, когда указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). Способы по настоящему изобретению включают введение пациенту-человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40. Настоящее изобретение относится также к применению терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 для приготовления лекарственного средства для лечения рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F).

Настоящее изобретение относится также к способам ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), которые включают введение указанному пациенту-человеку эффективного количества антитела против CD40. Настоящее изобретение относится также к применению эффективного количества антитела против CD40 для получения лекарственного средства для ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (V/F или F/F).

Настоящее изобретение относится к способам идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40 и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®), и к наборам для осуществления указанных способов. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные способы включают: а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®); и b) определение у указанного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F); при этом рак или предраковое состояние подлежат лечению антителом против CD40, если данный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). Настоящее изобретение может далее включать стадию введения пациенту-человеку, идентифицированному указанным способом, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40. Наборы по настоящему изобретению, с помощью которых может быть идентифицирован пациент-человек, страдающий раком или находящийся в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, включают реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158.

Настоящее изобретение относится также к способам выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®), и к наборам для осуществления указанных способов. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные способы включают: а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®); и b) определение у указанного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F); при этом, если указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), для лечения рака или предракового состояния выбирают антитело против CD40. Настоящее изобретение может включать стадию введения пациенту-человеку, идентифицированному указанным способом, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40. Наборы по настоящему изобретению, позволяющие выбрать терапию антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками, включают реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158.

Настоящее изобретение относится также к способам лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, которые включают введение указанному пациенту-человеку медленно интернализирующего антитела. В одном таком варианте осуществления изобретения терапевтически или профилактически эффективное количество антитела против CD40 вводят пациенту-человеку так, что указанное антитело против CD40 не подвергается значительной интернализации CD40-экспрессирующими клетками после введения. В другом таком варианте осуществления изобретения терапевтически или профилактически эффективное количество антитела против CD40 вводят пациенту-человеку так, что антитело против CD40 по существу равномерно распределяется по поверхности CD40-экспрессирующих клеток после введения. В другом таком варианте осуществления изобретения антитело против CD40 вводят пациенту-человеку так, что терапевтически или профилактически эффективное количество антитела против CD40 остается на поверхности CD40-экспрессирующих клеток пациента-человека после введения.

Антитела против CD40, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, специфически связывают антиген CD40. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против CD40, предназначенные для применения в способах по настоящему изобретению, в частности моноклональные антитела, обладают сильным сродством связывания с FcγRIIIa-158V человека, сильным сродством связывания с FcγRIIIa-158F человека или сильным сродством связывания с FcγRIIIa-158V и FcγRIIIa-158F человека. В некоторых указанных вариантах осуществления изобретения антитела против CD40 могут связываться с любым из двух аллотипов (V или F) аминокислоты FcγRIIIa 158 на естественных клетках-киллерах (NK) с характеристиками связывания, вызывающими сильную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). Приемлемые антитела против CD40 включают, не ограничиваясь ими, антитела против CD40, не обладающие значительной агонистической активностью, в том числе, например, антитела против CD40, которые являются антагонистами CD40-CD40L, передающими сигналы в CD40-экспрессирующие клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело против CD40 выбирают из группы, включающей: а) моноклональное антитело CHIR-12.12; b) моноклональное антитело, продуцированное линией клеток гибридомы 12.12; с) моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, показанной в SEQ ID NO:2, последовательности, показанной в SEQ ID NO:4, последовательности, показанной в SEQ ID NO:5, обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, и обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5; d) моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, последовательности, показанной в SEQ ID NO:3 и обеих последовательностей, показанных в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3; е) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, способным связывать моноклональное антитело, продуцированное линией клеток гибридомы 12.12; f) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, включающим остатки 82-87 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9; g) моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, включающим остатки 82-89 последовательности CD40 человека, показанной в SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9; h) моноклональное антитело, конкурирующее с моноклональным антителом CHIR-12.12 при выполнении конкурентно-связывающего анализа; i) моноклональное антитело по предшествующему пункту а) или моноклональное антитело по любому из предшествующих пунктов с)-h), причем указанное антитело получают рекомбинантными методами; и j) моноклональное антитело, являющееся антигенсвязывающим фрагментом моноклонального антитела по любому из предшествующих пунктов а)-i), которое сохраняет способность специфически связываться с антигеном CD40 человека.

Способы по настоящему изобретению находят применение при лечении разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с CD40-экспрессирующими клетками. Примеры указанных заболеваний включают, не ограничиваясь ими, разные типы рака В-клеточной линии дифференцировки, не-В-клеточные гематологические злокачественности, например острый миелоцитарный лейкоз, солидные опухоли, разные типы рака или предраковые состояния, ассоциированные с CD20-экспрессирующими клетками. Способы по настоящему изобретению являются особенно эффективными в отношении разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими как CD40, так и CD20. Таким образом, настоящее изобретение позволяет лечить пациентов, страдающих раком или находящихся в предраковом состоянии, не поддающемся лечению другими противоопухолевыми средствами, включающими антитела против CD20 для пациентов, гомозиготных или гетерозиготных в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F).

Краткое описание чертежей

На фигуре 1А-1F показаны результаты анализа антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) в шести линиях клеток.

На фигуре 2А-2D показаны результаты анализа антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) в клетках пациентов, страдающих CLL (n=8).

На фигуре 3 суммированы результаты анализа ADCC в клетках пациентов, страдающих CLL (n=9).

На фигуре 4 показаны результаты анализа ADCC в клетках пациентов, страдающих CLL, с использованием эффекторных NK-клеток, полученных у двух разных доноров.

На фигуре 5 показаны результаты количественного определения экспрессии CD40 и CD20 на клеточной поверхности в клетках пациентов, страдающих CLL, и нормальных В-клетках.

На фигуре 6 суммированы результаты активности ADCC для клеток с подвергнутой количественному определению экспрессией CD40 и CD20 на клеточной поверхности.

На фигуре 7 изображена столбчатая диаграмма, показывающая уровни связанного с клеточной поверхностью антитела CHIR-12.12 в линиях клеток Дауди и ARH77.

На фигуре 8 показаны результаты исследования интернализации антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба в клетках пациентов, страдающих CLL, при помощи анализа методом FACS.

На фигуре 9 показаны результаты исследования интернализации антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба в нормальных В-клетках при помощи конфокальной микроскопии меченных флуоресцином антител.

На фигуре 10 показаны результаты исследования интернализации антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба в клетках пациентов, страдающих CLL, при помощи конфокальной микроскопии Alexa488-меченных антител.

На фигуре 11 суммированы результаты взаимосвязи между активностью ADCC и интернализацией.

На фигуре 12 изображена столбчатая диаграмма, показывающая максимальное процентное значение специфического лизиса клеток Дауди антителом CHIR-12.12 или ритуксимабом под воздействием очищенных эффекторных NK-клеток, полученных у доноров с разными генотипами FcγRIIIa.

На фигуре 13 изображена столбчатая диаграмма, показывающая активность ADCC (ED₅₀) антитела CHIR-12.12 или ритуксимаба в клетках Дауди под воздействием очищенных эффекторных NK-клеток, полученых у доноров с разными генотипами FcγRIIIa.

На фигуре 14 суммированы сравнительные данные ADCC антитела CHIR-12.12 и ритуксимаба против клеток пациентов, страдающих CLL (n=9), под воздействием NK-клеток человека, полученных у нескольких генотипированных доноров.

Подробное описание изобретения

Авторы изобретения сделали удивительное открытие, состоящее в том, что антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, способны опосредовать сильную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) CD40-экспрессирующих клеток-мишеней в условиях, в которых другие ADCC-опосредующие антитела являются менее эффективными или сравнительно неэффективными. В отличие от других антител, таких как ритуксимаб (Rituxan®), антитела против CD40 по настоящему изобретению могут связываться с любым из двух аллотипов (V или F) аминокислоты FcγRIIIa 158 на естественных клетках-киллерах (NK) пациента-человека с характеристиками связывания, вызывающими сильную ADCC. Данное открытие является неожиданным и представляет собой прогресс в лечении разных типов рака и предраковых состояний у широкого круга пациентов.

Антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, могут быть использованы для лечения разных типов рака и предраковых состояний, ассоциированных с CD40-экспрессирующими клетками, у пациентов-людей, гетерозиготных или гомозиготных в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F) помимо гомозиготных субъектов в отношении FcγRIIIa-158V (генотип V/V).

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, когда указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), который включает введение указанному пациенту-человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40. Настоящее изобретение относится также к применению терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 для приготовления лекарственного средства для лечения рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F).

Как было отмечено выше, клиническая активность ритуксимаба при лечении NHL соответствует генотипу FcγRIIIa пациента. Пациенты с полиморфизмом F/F FcγRIIIa-158aa менее восприимчивы к ритуксимабу, чем пациенты с V/V или V/F (см., например, публикацию Cartron et al. (2002) Blood 99(3):754-758 или Dall'Ozzo et al. (2004) Cancer Res. 64:4664-4669). Поэтому настоящее изобретение особенно пригодно для лечения разных типов рака и предраковых состояний, не поддающихся лечению антителом против CD20, таким как ритуксимаб (Rituxan®).

Антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, могут быть использованы в способах ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F) помимо гомозиготных пациентов-людей в отношении FcγRIIIa-158V (генотип V/V).

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F), который включает введение указанному пациенту-человеку эффективного количества антитела против CD40, такого как CHIR-12.12. Настоящее изобретение относится также к применению эффективного количества антитела против CD40 для приготовления лекарственного средства для ингибирования продуцирования антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (V/F или F/F).

Для специалиста в данной области должна быть неожиданной возможность ингибировать продуцирование антител В-клетками у пациента-человека, гетерозиготного или гомозиготного в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F).

Настоящее изобретение позволяет применять схему лечения, выбираемую на основе генотипа FcγRIIIa-158 конкретного пациента-человека, которая включает введение ADCC-опосредующего антитела против CD40.

Настоящее изобретение относится к способу идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40 и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®), который включает:

а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®);

b) определение у указанного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F);

причем указанный рак или предраковое состояние подлежит лечению антителом против CD40 в том случае, если указанный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). Настоящее изобретение может далее включать стадию введения пациенту-человеку, идентифицированному с помощью указанному способа, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40.

Вышеуказанный способ идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, может быть легко выполнен специалистом в данной области при помощи соответствующего диагностического набора. Указанный набор должен содержать реагенты, необходимые для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Таким образом, настоящее изобретение относится также к набору для идентификации пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, подлежащем лечению антителом против CD40, который включает реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Соответствующие наборы более подробно рассмотрены в настоящем описании изобретения.

Настоящее изобретение относится также к способу выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®), который включает:

а) идентификацию пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками и не поддающемся лечению ритуксимабом (Rituxan®); и

b) определение у указанного пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158 (V/V, V/F или F/F);

причем антитело против CD40 выбирают для лечения указанного рака или предракового состояния в том случае, если данный пациент-человек является гетерозиготным или гомозиготным в отношении FcγRIIIa-158F (генотип V/F или F/F). В частности, антитело против CD40 может быть использовано вместо ритуксимаба (Rituxan®). Настоящее изобретение может далее включать стадию введения пациенту-человеку, идентифицированному с помощью указанного способа, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40.

Вышеуказанный способ выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, может быть легко выполнен специалистом в данной области при помощи соответствующего диагностического набора. Указанный набор должен содержать реагенты, необходимые для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158. Таким образом, настоящее изобретение относится также к набору для выбора терапии антителом для лечения пациента-человека, страдающего раком или находящегося в предраковом состоянии, ассоциированном с CD40-экспрессирующими клетками, который включает реагенты для определения у пациента-человека генотипа FcγRIIIa-158.

Авторы настоящего изобретения сделали также удивительное открытие, состоящее в том, что антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, не подвергаются значительной интернализации CD40-экспрессирующими клетками после введения. Наоборот антитела против CD40, такие как CHIR-12.12, по существу равномерно распределены по поверхности CD40-экспрессирующих клеток в течение значительного периода времени после введения. В этом состоит отличие от других антител, в частности антител против CD20, таких как ритуксимаб (Rituxan®).

Продолжительность связывания CD40 на поверхности CD40-экспрессирующих клеток и равномерное распределение антитела против CD40 по поверхности CD40-экспрессирующих клеток позволяет антителам против CD40 опосредовать сильную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) CD40-экспрессирующих клеток-мишеней благодаря связыванию с FcR, таким как FcγRIIIa, на естественных клетках-киллерах (NK).

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, который включает введение указанному пациенту-человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 без значительной интернализации антитела против CD40 CD40-экспрессирующими клетками после введения.

Настоящее изобретение относится также к способу лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, который включает введение указанному пациенту-человеку терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 с достижением равномерного распределения антитела против CD40 на поверхности CD40-экспрессирующих клеток после введения.

Настоящее изобретение относится также к способу лечения у пациента-человека рака или предракового состояния, ассоциированного с CD40-экспрессирующими клетками, который включает введение указанному пациенту-человеку антитела против CD40 с достижением на поверхности CD40-экспрессирующих клеток терапевтически или профилактически эффективного количества антитела против CD40 после введения.

Указанные аспекты по настоящему изобретению предполагают введение пациенту медленно интернализирующего антитела. Термин “медленно интернализирующее антитело” означает антитело, которое остается на клеточной поверхности в течение значительного периода времени. Как известно специалисту, данное свойство отличается от свойств, считающихся благоприятными для многих терапевтических применений, которые фактически требуют интернализации комплекса антитело-рецептор для достижения эффективного лечения. В данном контексте значительный период времени обычно превышает 3 часа, предпочтительно 6 часов, более предпочтительно 12 часов, более предпочтительно 24 часа, 36 часов, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 120 часов, 144 часа, 168 часов или более.

Предпочтительно по крайней мере 5%, по крайней мере 10%, по крайней мере 20%, по крайней мере 30%, по крайней мере 40%, по крайней мере 50%, по крайней мере 60%, по крайней мере 70%, по крайней мере 80%, по крайней мере 90% или более процентов антитела, первоначально находящегося на поверхности CD40-экспрессирующей клетки, остается на поверхности данной клетки по истечении вышеуказанного значительного периода времени.

Интернализацию антител можно определить при помощи разных анализов. Например, для оценки влияния связывания антитела-кандидата на интернализацию можно использовать такие линии клеток как линия клеток лимфомы Дауди или линия клеток ММ ARH77. Клетки инкубируют с IgG1 человека (контрольное антитело) или антителом-кандидатом на льду (с 0,1% азида натрия для блокирования интернализации) или при 37°С (без азида натрия) в течение периода времени, равного примерно 3 часам. Затем клетки промывают холодным буфером для окрашивания (например, PBS + 1% BSA + 0,1% азида натрия) и окрашивают, например, антителом козы против IgG человека, меченным флуоресцином (FITC), в течение 30 минут на льду. Затем можно определить степень окрашивания; в данном примере может быть зарегистрировано геометрическое среднее интенсивности флуоресценции (MFI) при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции Calibur. Специалистам в данной области должны быть известны другие приемлемые анализы (см., например,

http://www.abgenix.com/documents/SBS2003%20poster.pdf).

В экспериментах, описанных в примерах 4 и 5 настоящего описания изобретения, не было обнаружено разницы в MFI между клетками, инкубированными с антителом СН-12.12 на льду в присутствии азида натрия или при 37°С без азида натрия (см. фигуры 7-10). Приведенные данные показывают, что антитело СН-12.12 при связывании с CD40 не интернализируется и продолжает оставаться на клеточной поверхности в течение более продолжительного времени, чем ритуксимаб.

Ниже приведен краткий обзор стандартных методов и процедур, которые могут быть использо