Антитело против глипикана-3 с улучшенными кинетическими показателями в плазме

Антитело против глипикана-3 с улучшенными кинетическими показателями в плазме

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет японской патентной заявки No. 2007-256063, поданной 28 сентября 2007, содержание которой включено в описание с помощью ссылки.

Область изобретения

Изобретение относится к способу улучшения кинетических показателей антител против глипикана-3 в плазме (крови), к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента антитело против глипикана-3, которое обладает улучшенными кинетическими показателями в плазме, и к способу его получения.

Уровень техники

Антитела стабильны в плазме и проявляют незначительные побочные эффекты, поэтому их использование в качестве лекарственных средств привлекает внимание исследователей. Среди нескольких изотипов антител в продаже имеется большое количество терапевтических антител изотипа IgG, и в настоящее время в разработке находится также большое количество терапевтических антител (Janice M. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura B. Faden and Matthew C. Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology (2005) 23, 1073-8; Pavlou A.K. and Belsey M.J., The therapeutic antibodies market to 2008, Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59(3), 389-96; and Janice M. Reichert and Viia E. Valge-Archer, Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics, Nat. Rev. Drug Disc. (2007) 6, 349-356). Известно, что антитела против глипикана-3 проявляют противоопухолевую активность, оказывая цитотоксическое действие, например, на опухолевые клетки печени и опухолевые клетки легкого (WO 2003/000883). Известно, что конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие антитело против глипикана-3, связанное с цитотоксическим веществом, также проявляют противоопухолевую активность по отношению к опухоли печени, опухоли яичника, меланоме и т.п. (Albina Nesterova, Paul J. Carter and Leia M. Smith, Glypican 3 as a Novel Target for an Antibody-Drug Conjugate, AACR Abstract No. 656 (2007), Los Angeles, CA, April, 4-18).

Кроме того, для получения терапевтических антител второго поколения разрабатываются способы, которые направлены на усиление эффекторных функций. Например, известно, что антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) усиливаются при аминокислотной замене, когда аминокислоты, составляющие Fc-фрагмент антител изотипа IgG (называемых IgG-антителами), заменяют различными аминокислотами (Kim S.J., Park Y. and Hong H.J., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies, Mol. Cells (2005) 20(1), 17-29). При получении антитела против глипикана-3 в клетках СНО, лишенных транспортера фукозы, фукоза не присоединяется к разветвленным цепям сахара, соединенным с антителом против глипикана-3. Такое антитело против глипикана-3 обладает значительно более высокой ADCC-активностью, чем антитело против глипикана-3, содержащее фукозу в разветвленной цепи сахара, и существует предположение, что в качестве терапевтического антитела оно имеет большую противоопухолевую активность (WO 2006/067913).

Кроме указанных выше способов, направленных на усиление эффекторных функций, также известны и другие способы, с помощью которых увеличивают или уменьшают время полужизни антитела в плазме крови благодаря аминокислотной замене в аминокислотах, составляющих Fc-фрагмент антитела (Hinton P.R., Xiong J.M., Johlfs M.G., Tang M.T., Keller S. and Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life, J. Immunol. (2006) 176(1), 346-56; and Ghetie V., Popov S., Borvak J., Radu C., Matesoi D., Medesan C., Ober R.J. and Ward E.S., Increasing the serum persistence of a IgG fragment by random mutagenesis, Nat. Biotechnol. (1997) 15(7), 637-40). В случае использования способов, которые увеличивают время полужизни антител в плазме крови, для терапевтических антител следует ожидать уменьшения дозы вводимого терапевтического антитела и увеличения интервала между введениями, что позволит обеспечить менее дорогостоящие терапевтические антитела, более удобные в применении.

Говоря научным языком, время полужизни в плазме может быть увеличено путем замены аминокислоты Fc-фрагмента IgG-антитела другой аминокислотой, что приводит к улучшению сродства IgG-антитела в отношении неонатального Fc-рецептора, который, как известно, является рецептором спасения IgG-антител. Кроме того, известно, что время полужизни в плазме крови увеличивается при “перетасовке” отдельных доменов (СН1, СН2, СН3), составляющих константную область антитела (Zuckier L.S., Chang C.J., Scharff M.D. and Morrison S.L., Chimeric human-mouse IgG antibodies with shuffled constant region exons demonstrate that multiple domains contribute to in vivo half-life, Cancer Res. (1998) 58(17), 3905-8). Однако поскольку аминокислотная последовательность константной области IgG-антитела человека является консервативной, то антитело с искусственной аминокислотной заменой, как описано выше, в аминокислотах, составляющих константную область, может вызывать побочные эффекты в результате иммуногенности в организме человека. Поэтому предпочтительна замена только небольшого количества аминокислот.

Известные на сегодняшний день методы аминокислотной замены в вариабельной области (также называемой V-областью) IgG-антител включают методы создания гуманизированных антител (Tsurushita N., Hinton P.R. and Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax, Methods (2005) 36(1), 69-83), “созревания” аффинности, где для усиления связывающей активности проводят аминокислотную замену в гипервариабельном участке (CDR) (Rajpal A., Beyaz N., Haber L., Cappuccilli G., Yee H., Bhatt R.R., Takeuchi T., Lerner R.A. and Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2005) 102(24), 8466-71), и аминокислотной замены в аминокислотах, составляющих каркасный участок (FR), для улучшения физико-химической стабильности (Ewert S., Honegger A. and Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering, Methods (2004) 34(2), 184-99). В отличие от аминокислотной замены в константной области (также называемой С-областью), аминокислотную замену в вариабельном участке обычно используют для улучшения характеристик (например, стабильности) и усиления функции (например, антигенсвязывающей активности) антител. Поскольку аминокислотную последовательность, составляющую CDR гуманизированных антител, получают из аминокислотной последовательности отличных от человека животных, то предполагается, что риск появления иммуногенности в результате осуществления искусственной аминокислотной замены в этой последовательности будет меньше, чем в случае аминокислотной замены в других областях. Кроме того, что касается искусственной аминокислотной замены в аминокислотной последовательности, составляющей FR-участок гуманизированных антител, предполагается, что такая замена вызовет незначительный риск появления иммуногенности, если аминокислотная последовательность FR, полученная в результате замены, будет такой же, как любая из множества аминокислотных последовательностей FR антител человека, которые опубликованы, например, в базе данных Кабата (http://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/), базе данных IMGT (http://imgt.cines.fr/) и т.п. Кроме того, иммуногенность можно уменьшить путем повторного отбора последовательности антитела человека, которая в значительной степени аналогична аминокислотной последовательности FR, полученной в результате замены, из множества аминокислотных последовательностей FR антител человека, которые опубликованы в базе данных Кабата, базе данных IMGT и т.п. (WO 1999/018212).

В отличие от этого, единственными известными способами, позволяющими увеличить время полужизни IgG-антител в плазме, являются, как описано выше, аминокислотные замены аминокислот, составляющих Fc-фрагмент, который является частью константной области, и до настоящего времени не описан ни один способ, который приводил бы к увеличению времени полужизни IgG-антител в плазме крови благодаря аминокислотной замене аминокислот, составляющих вариабельную область, что, предполагается, связано с незначительным риском появления иммуногенности. Предполагается, что причиной этого отчасти является то, что время полужизни IgG-антител в плазме в значительной степени зависит от антигензависимой элиминации и связывания с неонатальным Fc-рецептором, рецептором “спасения” IgG-антител (Lobo E.D., Hansen R.J. and Balthasar J.P., Antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics, J. Pharm. Sci. (2004) 93(11), 2645-68) и что функции и свойства вариабельной области не могут оказывать значительного влияния на время полужизни в плазме.

Также было описано, что изоэлектрическая точка (pI) IgG-антитела снижается при анионизации IgG-антитела путем сукцинилирования (Yamasaki Y., Sumimoto K., Nishikawa M., Yamashita F., Yamaoka K., Hashida M. and Takakura Y., Pharmacokinetic analysis of in vivo disposition of succinylated proteins targeted to liver nonparenchymal cells via scavenger receptors: importance of molecular size and negative charge density for in vivo recognition by receptors, Pharmacol. Exp. Ther. (2002) 301(2), 467-77) и что pI IgG-антитела повышается при катионизации IgG-антитела путем модификации с использованием полиамина (Poduslo J.F. and Curran G.L., Polyamine modification increases the permeability of proteins at the blood-nerve and blood-brain barriers, Neurochem. (1996) 66(4), 1599-609). Однако в обоих случаях не происходило повышения времени полужизни модифицированного IgG-антитела в плазме, при этом время полужизни скорее снижалось. Таким образом, повышение времени полужизни IgG-антител в плазме не может быть достигнуто путем модификации pI IgG-антитела в случае использования вышеописанной химической модификации IgG-антитела.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение было выполнено с учетом приведенных выше данных. Целью настоящего изобретения является способ модуляции времени полужизни антитела против глипикана-3 в плазме (крови), антитела против глипикана-3 с модулированным временем полужизни в плазме и фармацевтической композиции, содержащей антитело в качестве активного ингредиента, а также способа получения антитела против глипикана-3 и фармацевтической композиции. Другой целью настоящего изобретения является способ модуляции цитотоксичности антитела путем модуляции времени полужизни проявляющего цитотоксичность антитела в плазме, антитела с модулированной цитотоксичностью и фармацевтической композиции, содержащей это антитело, а также способа получения такого антитела и фармацевтической композиции.

Авторы настоящего изобретения провели целенаправленные исследования способов модуляции времени полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме. В результате, авторы настоящего изобретения обнаружили, что время полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме можно модулировать путем модификации - наряду с аминокислотными остатками, составляющими вариабельную область и константную область антитела (например, антитела против глипикана-3), - аминокислотных остатков, находящихся на поверхности молекулы антитела, и, таким образом, путем контроля поверхностного заряда молекулы антитела. А именно, наряду с аминокислотными остатками в аминокислотной последовательности, составляющей вариабельную и константную область антитела (например, антитела против глипикана-3), были идентифицированы конкретные аминокислотные остатки, которые могут изменять время полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме благодаря модификации поверхностного заряда молекулы антитела, при этом не влияя на структуру или функцию этого антитела, например на антигенсвязывающую активность. Авторы настоящего изобретения также подтвердили, что антитело (например, антитело против глипикана-3), имеющее модулированное таким образом время полужизни, действительно сохраняет свою антигенсвязывающую активность. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что модуляция времени полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме повышает проявляемую цитотоксическими антителами (такими как антитело против глипикана-3) активность ингибирования пролиферации опухолевых клеток на примере раковых клеток.

Настоящее изобретение относится к способу модуляции времени полужизни антитела (например, антитела против глипикана-3) в плазме путем модификации находящегося на поверхности антитела аминокислотного остатка; антителу (например, антителу против глипикана-3), которое имеет модулированное время полужизни в плазме в результате модификации аминокислотного остатка; к фармацевтической композиции, содержащей антитело в качестве активного ингредиента; и к способу получения такой фармацевтической композиции. Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующим объектам:

1. Способ получения антитела против глипикана-3 с модулированными кинетическими показателями в плазме, который включает следующие стадии:

(а) культивирование клетки-хозяина, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против глипикана-3, в условиях, при которых возможна экспрессия нуклеиновой кислоты, причем антитело против глипикана-3 имеет аминокислотную последовательность, которая изменена так, что модифицирован заряд по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела; и

(b) выделения антитела против глипикана-3 из культуры клеток-хозяев;

2. Способ по п.1, где модуляция кинетических показателей в плазме представляет собой увеличение или уменьшение параметра, выбранного из: времени полужизни в плазме, среднего времени пребывания в плазме и плазменного клиренса.

3. Способ по п.1, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем аминокислотной замены.

4. Способ по п.1, где аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности антитела против глипикана-3, расположен на участке антитела против глипикана-3, который не является FcRn-связывающим фрагментом.

5. Способ по п.4, где FcRn-связывающий фрагмент содержит Fc-фрагмент.

6. Способ по п.4, где FcRn-связывающий фрагмент содержит аминокислотные остатки с EU-номерами 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 436 согласно нумерации Кабата.

7. Способ по п.1, где антитело против глипикана-3 представляет собой IgG-антитело.

8. Способ по п.п.1-7, где аминокислотный остаток, заряд которого модифицирован, представляет собой аминокислотный остаток, расположенный в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи.

9. Способ по п.8, где антитело против глипикана-3 содержит гипервариабельный участок (CDR), происходящий от отличного от человека животного, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, и где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела в CDR или FR антитела, на аминокислотный остаток, имеющий заряд, отличающийся от заряда указанного аминокислотного остатка.

10. Способ по п.9, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем:

(1) по меньшей мере одной замены в вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, выбранной из:

(а) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на K,

(b) замены D, который является 52-м аминокислотным остатком, на N и

(с) замены Q, который является 107-м аминокислотным остатком, на R;

и/или

(2) по меньшей мере одной замены в вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:7, выбранной из:

(d) замены Е, который является 17-м аминокислотным остатком, на Q,

(e) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на R и

(f) замены Q, который является 105-м аминокислотным остатком, на R;

11. Способ по п.9, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем:

(1) по меньшей мере одной замены в вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, выбранной из:

(а) замены K, который является 19-м аминокислотным остатком, на Т,

(b) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на Е,

(с) замены Q, который является 62-м аминокислотным остатком, на Е,

(d) замены K, который является 63-м аминокислотным остатком, на S,

(e) замены K, который является 65-м аминокислотным остатком, на Q и

(f) замены G, который является 66-м аминокислотным остатком, на D;

и/или

(2) по меньшей мере одной замены в вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:7, выбранной из:

(g) замены R, который является 24-м аминокислотным остатком, на Q;

(h) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на E;

(i) замены K, который является 79-м аминокислотным остатком, на T,

(j) замены R, который является 82-м аминокислотным остатком, на S и

(k) замены K, который является 112-м аминокислотным остатком, на E;

12. Способ по п.11, дополнительно включающий по меньшей мере одну модификацию в константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранную из:

(а) замены Н, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на E,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

13. Способ по любому из п.п.9-12, где антитело против глипикана-3 имеет пониженное содержание фукозы, соединенной с Fc-фрагментом антитела;

14. Антитело против глипикана-3, полученное способом по любому из п.п.1-13.

15. Способ получения антитела с модулированными кинетическими показателями в плазме, который включает следующие стадии:

(а) культивирование клетки-хозяина, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в условиях, при которых возможна экспрессия нуклеиновой кислоты, причем антитело имеет аминокислотную последовательность, которая изменена так, что модифицируется заряд по меньшей мере одного аминокислотного остатка в константной области антитела, которая не является FcRn-связывающим фрагментом; и

(b) выделения антитела из культуры клеток-хозяев;

16. Способ по п.15, где модуляция кинетических показателей в плазме представляет собой увеличение или уменьшение параметра, выбранного из: времени полужизни в плазме, среднего времени пребывания в плазме и плазменного клиренса.

17. Способ по п.15, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем аминокислотной замены.

18. Способ по п.17, где антитело представляет собой IgG-антитело.

19. Способ по п.18, где антитело представляет собой IgG1-антитело.

20. Способ по п.17, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка IgG1-антитела на соответствующий аминокислотный остаток IgG4-антитела.

21. Способ по любому из п.п.15-20, где FcRn-связывающий фрагмент содержит аминокислотные остатки c EU-номерами 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435 и 436 согласно нумерации Кабата.

22. Способ по п.20, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем по меньшей мере одной замены в константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранной из:

(а) замены H, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на E,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

23. Способ по любому из п.п.15-22, где антитело представляет собой антитело против глипикана-3.

24. Способ стабилизации антитела против глипикана-3, которое содержит гипервариабельный участок (CDR), происходящий от отличного от человека животного, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, который включает следующие стадии:

(а) культивирование клетки-хозяина, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против глипикана-3, в условиях, при которых возможна экспрессия нуклеиновой кислоты, причем антитело против глипикана-3 имеет аминокислотную последовательность, которая изменена для увеличения значения T_m антитела путем модификации по меньшей мере одного аминокислотного остатка; и

(b) выделения антитела из культуры клеток-хозяев;

25. Способ по п.24, где аминокислотный остаток расположен в FR1-участке и/или FR2-участке тяжелой цепи или легкой цепи.

26. Способ по п.25, где аминокислотный остаток в FR2-участке тяжелой цепи заменен на аминокислотный остаток FR2-участка подкласса VH4.

27. Способ по п.25, где аминокислотный остаток в FR2-участке легкой цепи заменен на аминокислотный остаток FR2-участка подкласса VK3.

28. Способ по любому из п.п.24-27, где замена аминокислотного остатка происходит путем:

(1) по меньшей мере одной замены в вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, выбранной из:

(а) замены V, который является 37-м аминокислотным остатком, на I,

(b) замены A, который является 40-м аминокислотным остатком, на P,

(с) замены M, который является 48-м аминокислотным остатком, на I и

(d) замены L, который является 51-м аминокислотным остатком, на I;

и/или

(2) по меньшей мере одной замены в вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:7, выбранной из:

(e) замены L, который является 42-м аминокислотным остатком, на Q,

(f) замены S, который является 48-м аминокислотным остатком, на A и

(g) замены Q, который является 50-м аминокислотным остатком, на R;

29. Способ получения антитела с модулированной цитотоксичностью, включающий следующие стадии:

(а) культивирование клетки-хозяина, несущей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в условиях, при которых возможна экспрессия нуклеиновой кислоты, где антитело имеет аминокислотную последовательность, которая изменена так, что модифицируется заряд по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности цитотоксического антитела; и

(b) выделение антитела из культуры клеток-хозяев;

30. Способ по п.29, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем аминокислотной замены.

31. Способ по п.29, где аминокислотный остаток, который может находиться на поверхности антитела, расположен на участке антитела, который не является FcRn-связывающим фрагментом.

32. Способ по п.31, где FcRn-связывающий фрагмент содержит Fc-фрагмент.

33. Способ по п.31, где FcRn-связывающий фрагмент содержит аминокислотные остатки c EU-номерами 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 436 согласно нумерации Кабата.

34. Способ по п.29, где антитело представляет собой IgG-антитело.

35. Способ по любому из п.п.29-34, где аминокислотным остатком, заряд которого модифицирован, является аминокислотный остаток, находящийся в константной области антитела.

36. Способ по любому из п.п.29-34, где аминокислотным остатком, заряд которого модифицирован, является аминокислотный остаток, находящийся в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела.

37. Способ по п.36, где антитело представляет собой антитело, которое содержит гипервариабельный участок (CDR), происходящий от отличного от человека животного, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, и где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела в CDR или FR антитела, на аминокислотный остаток, который имеет заряд, отличающийся от заряда указанного аминокислотного остатка.

38. Способ по п.37, где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем:

(1) по меньшей мере одной замены в вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:1, выбранной из:

(а) замены K, который является 19-м аминокислотным остатком, на Т,

(b) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на Е,

(с) замены Q, который является 62-м аминокислотным остатком, на E,

(d) замены K, который является 63-м аминокислотным остатком, на S,

(e) замены K, который является 65-м аминокислотным остатком, на Q и

(f) замены G, который является 66-м аминокислотным остатком, на D;

и/или

(2) по меньшей мере одной замены в вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:7, выбранной из:

(g) замены R, который является 24-м аминокислотным остатком, на Q,

(h) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на Е,

(i) замены K, который является 79-м аминокислотным остатком, на T,

(j) замены R, который является 82-м аминокислотным остатком, на S и

(k) замены K, который является 112-м аминокислотным остатком, на E;

39. Способ по п.38, дополнительно включающий по меньшей мере одну замену в константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранной из:

(а) замены Н, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на E,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

40. Способ по п.36, где антитело содержит гипервариабельный участок (CDR), происходящий от отличного от человека животного, каркасный участок (FR), происходящий от человека, и константную область, происходящую от человека, и где модификация заряда аминокислотного остатка происходит путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, который может находиться на поверхности антитела в константной области антитела, на аминокислотный остаток, который имеет заряд, отличающийся от заряда указанного аминокислотного остатка.

41. Способ по п.40, где заменой является по меньшей мере одна замена в константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранной из:

(а) замены Н, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на E,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

42. Способ по любому из п.п.37-41, где антитело имеет пониженное содержание фукозы, связанной с Fc-фрагментом антитела.

43. Антитело, полученное способом по любому из п.п.29-42.

44. Антитело по п.43, где антитело представляет собой антитело против глипикана-3.

45. Антитело, содержащее:

(1) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:1, в которой аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из:

(а) замены K, который является 19-м аминокислотным остатком, на Т,

(b) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на E,

(с) замены Q, который является 62-м аминокислотным остатком, на E,

(d) замены K, который является 63-м аминокислотным остатком, на S,

(e) замены K, который является 65-м аминокислотным остатком, на Q и

(f) замены G, который является 66-м аминокислотным остатком, на D;

и/или

(2) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:7, в которой аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из:

(g) замены R, который является 24-м аминокислотным остатком, на Q,

(h) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на Е,

(i) замены K, который является 79-м аминокислотным остатком, на T,

(j) замены R, который является 82-м аминокислотным остатком, на S и

(k) замены K, который является 112-м аминокислотным остатком, на E;

46. Антитело по п.45, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO:3 и легкую цепь SEQ ID NO:9.

47. Антитело по п.45, содержащее тяжелую цепь SEQ ID NO:5 и легкую цепь SEQ ID NO:11.

48. Антитело по п.45, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:27 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:28.

49. Антитело по п.45, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:27 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:29.

50. Антитело по любому из п.п.45-49, содержащее константную область антитела человека.

51. Антитело по п.50, где константная область содержит последовательность SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:33.

52. Антитело, содержащее:

(1) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:1, в которой аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из:

(а) замены Q, который является 43-м аминокислотным остатком, на K,

(b) замены D, который является 52-м аминокислотным остатком, на N,

(с) замены Q, который является 107-м аминокислотным остатком, на R;

и

(2) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:7, в которой аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из:

(d) замены Е, который является 17-м аминокислотным остатком, на Q,

(e) замены Q, который является 27-м аминокислотным остатком, на R и

(f) замены Q, который является 105-м аминокислотным остатком, на R;

53. Антитело по п.52, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:4 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:10.

54. Антитело по п.52, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:6 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:12.

55. Антитело по любому из п.п.52-54, содержащее константную область антитела человека.

56. Антитело, содержащее по меньшей мере одну замену в аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи SEQ ID NO:31, выбранную из:

(а) замены Н, который является 151-м аминокислотным остатком, на Q,

(b) замены K, который является 157-м аминокислотным остатком, на Q,

(с) замены R, который является 238-м аминокислотным остатком, на Q,

(d) замены D, который является 239-м аминокислотным остатком, на Е,

(e) замены L, который является 241-м аминокислотным остатком, на M и

(f) замены Q, который является 302-м аминокислотным остатком, на E;

57. Антитело, содержащее константную область тяжелой цепи SEQ ID NO:33.

58. Антитело по любому из п.п.45-57, где антитело имеет пониженное содержание фукозы, соединенной с Fc-фрагментом указанного антитела.

59. Композиция, содержащая антитело по любому из п.п.45-58 и фармацевтически приемлемый носитель.

60. Средство против рака, содержащее в качестве активного ингредиента антитело по любому из п.п.45-58.

61. Средство против рака по п.60, где рак представляет собой рак печени.

62. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид антитела по любому из п.п.45-58.

63. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.62.

64. Клетка-хозяин по п.63, где клетка-хозяин представляет собой клетку животного, лишенную транспортера фукозы, клетку животного с удаленной фукозилтрансферазой или клетку животного с модифицированной сложной разветвленной цепью сахара.

65. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.63 или п.64 и выделение полипептида из клеточной культуры.

Краткое описание рисунков

На Фиг.1 представлен график, полученный в результате измерения с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2).

На Фиг.2 представлена электрофореграмма антитела H0L0 и антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2), полученная в результате изоэлектрического фокусирования в области высоких значений pI, где дорожки 1 и 4 соответствуют маркерам pI, дорожка 2 соответствует антителу H0L0 и дорожка 3 соответствует антителу Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2), где цифровые значения соответствуют значениям pI-маркерных молекул и стрелки указывают на электрофоретические подвижности соответствующих pI-маркерных молекул.

На Фиг.3 представлена электрофореграмма антитела H0L0 и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), полученная в результате изоэлектрического фокусирования в области низких значений pI, где дорожки 1 и 4 соответствуют маркерам pI, дорожка 2 соответствует антителу H0L0 и дорожка 3 соответствует антителу Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), где цифровые значения соответствуют значениям pI-маркерных молекул и стрелки указывают на электрофоретические подвижности соответствующих pI-маркерных молекул.

Фиг.4 представляет собой диаграмму, демонстрирующую степень сродства к связыванию антитела H15L4 и антитела H0L0 с антигеном против глипикана-3 в конкурентном методе ELISA, где черный ромб обозначает сродство к связыванию антитела H0L0, а серый квадрат обозначает сродство к связыванию антитела H15L4.

Фиг.5 представляет собой диаграмму, демонстрирующую степень сродства к связыванию антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела H0L0 с антигеном против глипикана-3 в конкурентном методе ELISA, где черный ромб означает сродство к связыванию антитела H0L0, а серый квадрат означает сродство к связыванию антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2).

Фиг.6 представляет собой диаграмму, демонстрирующую степень сродства к связыванию антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) и антитела H0L0 с антигеном против глипикана-3 в конкурентном методе ELISA, где черный ромб означает сродство к связыванию антитела H0L0, а серый квадрат означает сродство к связыванию антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6).

На Фиг.7 показана противоопухолевая активность в мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6).

На Фиг.7А показана противоопухолевая активность в мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), причем каждое тестируемое антитело вводили модели дозой 5 мг/кг, где черный ромб означает активность при введении носителя, черный треугольник означает активность при введении антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает активность при введении антитела Hspu2.2Lspu2.2 и черный квадрат означает активность при введении антитела H0L0.

На Фиг.7В показана противоопухолевая активность антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) в мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека, причем каждое тестируемое антитело вводили модели дозой 1 мг/кг, где черный ромб означает активность при введении носителя, черный треугольник означает активность при введения антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает активность при введении антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и черный квадрат означает активность при введении антитела H0L0.

На Фиг.8 на мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека показана концентрация антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) в плазме.

На Фиг.8А на мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека показаны концентрации в плазме антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), которые вводили, причем каждое тестируемое антитело вводили модели при дозе 5 мг/кг, где черный треугольник означает концентрацию в плазме антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает концентрацию в плазме антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и черный квадрат означает концентрацию в плазме антитела H0L0.

На Фигуре 8В на мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека показаны концентрации в плазме антитела H0L0, антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), которые вводили, причем каждое тестируемое антитело вводили модели при дозе 1 мг/кг, где черный треугольник означает концентрацию в плазме антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает концентрацию в плазме антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и черный квадрат означает концентрацию в плазме антитела H0L0.

На Фиг.9 показана ADCC-активность тестируемых антител против клеток HepG2, линии опухолевых клеток печени человека, где черный треугольник означает ADCC-активность антитела Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6), белый кружок означает ADCC-активность антитела Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) и черный квадрат означает ADCC-активность антитела H0L0.

На Фиг.10 показано измеренное с помощью конкурентного метода ELISA сродство к связыванию с антигеном против глипикана-3 антитела H0L0, антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16, где черный кружок означает связывающую активность антитела H0L0, белый кружок означает связывающую активность антитела Hd1.8Ld1.6, черный квадрат означает связывающую активность антитела pH7pL14, а белый квадрат означает связывающую активность антитела pH7pL16.

На Фиг.11 показана противоопухолевая активность антитела H0L0, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16 в мышиной модели с трансплантированной опухолью печени человека, где * означает противоопухолевую активность антитела H0L0, белый кружок означает противоопухолевую активность антитела Hd1.8Ld1.6, черный квадрат означает противоопухолевую активность антитела pH7pL14, а белый квадрат означает противоопухолевую активность антитела pH7pL16.

На Фиг.12 показана концентрация в плазме мыши антитела H0L0, антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14, антитела pH7pL16 и pH7M85pL16, где * означает концентрацию в плазме антитела H0L0, белый кружок означает концентрацию в плазме антитела Hd1.8Ld1.6, черный квадрат означает концентрацию в плазме антитела pH7pL14, белый квадрат означает концентрацию в плазме антитела pH7pL16, черный треугольник означает концентрацию в плазме мыши pH7M85pL16.

На Фиг.13 показана ADCC-активность антитела H0L0, антитела Hd1.8Ld1.6, антитела pH7pL14 и антитела pH7pL16 против клеток HepG2, клеточной линии опухоли печени человека, где черный кружок означает ADCC-активность антитела H0L0, белый кружок означает ADCC-активность антитела Hd1.8Ld1.6, черный квадрат означает ADCC-активность антитела pH7pL14 и белый квадрат означает ADCC-активность антитела pH7pL16.

На Фиг.14 показано и