Способ культивирования, благоприятствующий продуцированию к-витамина молочнокислыми бактериями, и его применение в производстве пищевых продуктов

Способ культивирования, благоприятствующий продуцированию к-витамина молочнокислыми бактериями, и его применение в производстве пищевых продуктов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области пищевых продуктов, обогащенных нутриентами, витаминами и/или микроэлементами с целью улучшения состава и качественного и количественного баланса потребляемых нутриентов в организме человека.

Изобретение относится, в частности, к средствам обогащения пищевых продуктов витамином К.

Если говорить точнее, то настоящее изобретение относится к способу увеличения количества витамина K2, полученного культивированием, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в котором указанный штамм культивируется в условиях "покоящихся клеток" таким образом, что количество витамина K2, продуцируемое культурой покоящихся клеток, превышает на коэффициент, равный, по меньшей мере, примерно 1,2, количество витамина K2, полученное культивированием указанного штамма при стандартных условиях ферментации.

Кроме того, настоящее изобретение относится к биомассе, полученной из культуры молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин К2, описанным выше способом.

Изобретение относится также к способу продуцирования витамина K2, к способам производства пищевых продуктов, обогащенных витамином K2, в частности ферментированных продуктов и/или свежих молочных продуктов, а также к пищевым продуктам, полученным такими способами.

Витамин K - это жирорастворимый витамин, который встречается в природе в двух формах: витамин K1 (или филлохинон) и витамин K2 (или менахинон).

Витамин K1 синтезируется растениями. Он встречается, главным образом, в зеленых частях растений (листовые овощи) и соевом масле.

Витамин K1 участвует непосредственно в процессе свертывания крови.

Витамин K2 продуцируется бактериями кишечной флоры. В небольших количествах он присутствует также в некоторых пищевых продуктах, подвергаемых ферментации (сыр, типичные азиатские продукты, содержащие ферментированную сою, такие как японские мисо (ферментированная соевая паста) и натто (соевый сыр) и др.). Многие бактерии способны синтезировать витамин K2. Так, помимо бактерий кишечной флоры и особенно таких их видов, как Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacteroides spp, примерами могут служить некоторые виды или подвиды молочнокислых бактерий, такие как Lactococcus lactis spp.lactis, Lactococcus lactis spp.cremoris, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides и Propionibacterium sp. Количество витамина K2, синтезируемого этими бактериями, в большинстве случаев колеблется примерно от 29 мкг до 90 мкг/л ферментированного молока (Morishita et al., 1999). Важно подчеркнуть, что измерения продуцируемого количества витамина K2 в большинстве своем проводятся в образцах лиофилизированных культур клеток и что результаты этих измерений показывают значительный разброс уровней продуцирования в зависимости от тестируемых штаммов, среди которых некоторые штаммы способны продуцировать в три раза больше, чем другие (Morishita et al., 1999; Parker et al, 2003). В рамках биологической активности витамин К2 известен, сверх того, своим действием на отложение кальция в мягких тканях.

Впервые витамин K был описан как витамин, играющий важную роль в процессе свертывания крови. Так, значительный недостаток витамина K приводит к кровотечениям с аномальным увеличением продолжительности свертывания крови и к кровоизлияниям. Долгое время считалось, что значительный дефицит витамина K у взрослых встречается довольно редко и может быть с успехом покрыт как за счет разнообразного и сбалансированного питания, так и за счет эндогенного продуцирования витамина бактериями кишечника. В этом отношении к группе риска обычно относят:

- новорожденных, кишечник которых еще не содержит бактерий-продуцентов витамина K;

- людей с нарушениями функции печени, желчного пузыря или кишечника (как следствие гепатита, муковисцидоза, колита, дизентерии и др.) и

- индивидуумов, длительное время принимавших антибиотики.

Совсем недавно было открыто, что влияние витамина K на здоровье человека не ограничивается только его ролью в механизмах свертывания крови. Фактически с 1980-х годов было признано, что витамин K играет определенную роль и в метаболизме костной ткани (Hart et al., 1984; Hart et al,, 1985).

Этот витамин выполняет функцию кофактора в ферментативной реакции, которая обусловливает активность остеокальцина в рамках регуляции костеобразования (Hauschka P.V. et al., 1989; Ducy P. et al., 1996). Если говорить точнее, то его роль заключается в нормализации условий карбоксилирования остеокальцина - ключевого белка, регулирующего процесс костеобразования. В случае дефицита витамина К указанная реакция не происходит, в результате чего в крови увеличивается отношение декарбоксилированного остеокальцина к карбоксилированому остеокальциду (Väänänen et al., 1999).

Демографические тенденции в западных странах проявляются в прогрессирующем старении населения, последствием которого является повышение уровня распространения дегенеративных патологий, в частности остеопороза. По этой причине остеопороз сегодня рассматривается как основная проблема, угрожающая здоровью людей.

В демографических программах, разработанных в 1990-х годах, впервые прозвучал тревожный сигнал о том, что по прогнозам в последующие 50 лет будет наблюдаться значительный рост случаев указанной патологии, особенно среди людей старшего возраста. В связи с этим было срочно принято решение о необходимости и безотлагательности принятия мер по предупреждению указанной патологии, которая в те годы редко выявлялась на ранней стадии и лечение которой проводилось, как правило, в запущенной стадии.

В настоящее время повсеместно признается, что профилактика остеопороза должна начинаться еще в детском возрасте с контроля за оптимальным ростом костей и продолжаться в течение всей жизни за счет поддержания массы костной ткани. Известно, что питательные факторы играют важную роль в развитии и поддержании здоровой костной ткани. До настоящего времени стратегия питания, намеченная или предложенная для профилактики остеопороза, основывалась, главным образом, на двух ключевых факторах, а именно - на кальции и витамине D. Однако сегодня стало известно, что не менее важными могут быть и другие питательные факторы.

В литературе все чаще высказываются предположения, что витамин K благодаря своей важной роли в костеобразовании может служить многообещающим средством профилактики здоровья костей в течение всей жизни человека.

Рекомендуемая норма потребления вместе с пищей витамина K для человека (1,5 мкг/сутки/кг массы тела) была установлена с учетом только его роли в свертывании крови. Однако проведенные в последнее время исследования позволяют предположить, что указанная норма потребления занижена, поскольку в ней не учитывается активность витамина К в метаболизме костной ткани (Ronden et al., 1998).

Даже если потребность в витамине K остается недооцененной, но факт остается фактом - заниженная норма потребления связана со снижением массы костной ткани и с увеличением риска переломов у взрослых индивидуумов (Hart et ah, 1985; Knapen et al., 1989; Szulc et al., 1993; Booth et ah, 2000). Более того, интервенционные исследования среди женщин в периоде менопаузы показали, что витамин K сокращает случаи остеопороза в указанной группе населения (Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003). И, наконец, исследования на животных позволяют предположить, что витамин K может играть полезную роль в достижении пиковой массы костной ткани и что этот эффект проявляется даже в большей степени, чем ранее связываемое с витамином D синергитическое действие. Однако исследования, доказывающие четко выраженную связь витамина K с ростом костей, проводились только на животных.

Более того, недавно проведенные исследования позволили получить дополнительные аргументы в пользу влияния витамина K на метаболизм костной ткани, в частности на построение и сохранение массы костной ткани (Booth et al., 2000; Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003; Hirano and Ishi, 2002).

В отличие от действия витамина K на взрослых, мало имеется данных о полезном влиянии витамина K на метаболизм костной ткани у детей. Известно только, что крайне важно оптимизировать массу костной ткани в период роста с целью обеспечения максимально возможного костного резерва и предупреждения риска развития остеопороза во взрослом возрасте.

Но в любом случае на основании всех имеющихся на сегодня данных можно сделать вывод, что повышение содержания витамина K в пищевых продуктах является особенно важным и многообещающим средством обеспечения и поддержания у индивидуума нормального телосложения.

В рамках этого на рынке пищевых продуктов уже появились продукты промышленного производства, которые содержат повышенное количество витамина K. Достойные внимания примеры включают некоторые молочные продукты, содержащие молочнокислые бактерии, такие как "Petits Gervaix aux Fruits" (фруктовый детский йогурт/творожок), реализуемые во Франции заявителем. Тем не менее, следует заметить, что, с одной стороны, содержание витамина K в таких продуктах в большинстве случаев зависит от вида используемых заквасок, а с другой стороны, штаммы Lactococcus lactis, обычно применяемые в молочных продуктах, не продуцируют количества витамина K, достаточного для удовлетворения потребностей населения или хотя бы для некоторого покрытия возможного недостатка витамина K.

Таким образом, в существующем уровне техники отмечается потребность в пищевых продуктах, в частности в ферментированных продуктах и/или свежих молочных продуктах, которые содержат витамин K в количествах, достаточных для удовлетворения потребностей (а при необходимости и для покрытия его дефицита) детей и подростков, а также взрослых людей и людей старшего возраста.

В контексте описания термины "витамин K2" и "витамин K" употребляются как синонимы и обозначают витамин K2.

Поэтому настоящее изобретение нацелено на удовлетворение указанной потребности за счет впервые предлагаемого способа производства пищевых продуктов, таких как кисломолочные продукты и/или свежие молочные продукты, в котором закваски, способные продуцировать витамин K, используются в условиях, благоприятствующих весьма ощутимым образом продуцированию витамина K по сравнению с традиционными условиями производства.

Более того, в ходе своей работы авторами изобретения были получены новые природные варианты природных штаммов молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K в количестве, значительно превышающем его количество, продуцируемое исходными природными штаммами, из которых указанные варианты были получены (см. ниже раздел "Примеры"). Таким образом, вновь полученные варианты, которые "сверхпродуцируют" витамин K, предпочтительно могут использоваться при условиях осуществления способа изобретения, особенно благоприятных для продуцирования витамина K.

Согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к способу увеличения количества витамина K2, полученного культивированием, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в котором указанный штамм культивируется в условиях покоящихся клеток и который включает, по меньшей мере:

(а) инокуляцию пригодной для данной цели культуральной среды живыми бактериальными клетками в количестве примерно от 10⁸ КОЕ/мл до 10¹¹ КОЕ/мл, и

(б) ферментацию инокулированной, как указано выше, среды в течение примерно от 4 ч до 48 ч, предпочтительно - примерно от 8 ч до 48 ч, при температуре примерно от 4°C до 50°C, предпочтительно - при температуре примерно от 4°C до 40°C, таким образом, что в конце стадии (б) количество витамина K2, продуцированное культурой покоящихся клеток, превышает на коэффициент, равный, по меньшей мере, примерно 1,2, количество витамина K2, полученное культивированием указанного штамма при стандартных условиях ферментации.

Выражения "культура покоящихся клеток" и "культура в условиях покоящихся клеток" являются частью общепринятой терминологии в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Поэтому понятие "покоящиеся клетки" прекрасно известно квалифицированному в данной области техники специалисту. Во Франции указанные выражения на английском языке хорошо известны и в большинстве случаев не переводятся на французский язык.

"Стандартные условия ферментации" в полной мере соответствуют, как свидетельствует их название, стандарту и хорошо известны квалифицированному в данной области техники специалисту (они обозначаются также как "лабораторные условия"). Предпочтительными "стандартными условиями ферментации" в контексте настоящего изобретения являются следующие: штамм предварительно выращивается на готовой агаровой среде М17 (агар Difco™ М17) или на эквивалентной среде с добавлением 20 мкл/мл 0,5 мг/мл раствора гемина в 0,1 М растворе соды. Для последующего культивирования проводится инокуляция с использованием 1% выращенной предкультуры. Температура инкубации составляет около 30°C. Аэрация обеспечивается простым перемешиванием. Условия ферментации могут при необходимости изменяться квалифицированным в данной области техники специалистом на основе собственных знаний и, разумеется, по результатам экспериментов по уточнению методики. Однако важно следить за систематическим соблюдением следующих трех основных критериев: (i) культуральная среда - это среда, пригодная для культивирования штаммов молочнокислых бактерий, в частности, штаммов Lactococcus spp.; (ii) по меньшей мере, одно соединение, содержащее ядро гема (например, гемин, каталаза или производные хлорофилла), добавляется в среду для получения предкультуры и/или в культуральную среду (предпочтительно и в среду для получения предкультуры, и в культуральную среду); (iii) процесс приготовления предкультуры и/или процесс культивирования (предпочтительно только процесс приготовления предкультуры) осуществляется в условиях перемешивания.

Частные варианты воплощения способа изобретения включают следующее:

- на стадии (а) культуральная среда инокулируется живыми бактериальными клетками в количестве примерно от 5×10⁸ КОЕ/мл до 10¹⁰ КОЕ/мл, более предпочтительно - примерно от 2×10⁹ КОЕ/мл до 6×10⁹ КОЕ/мл;

- на стадии (б) ферментация среды проводится в стандартных условиях в течение примерно от 12 ч до 36 ч, предпочтительно - примерно от 15 ч до 24 ч;

- на стадии (б) ферментация среды проводится в стандартных условиях при температуре примерно от 15°C до 35°C, предпочтительно - примерно от 20°C до 30°C.

Предпочтительно в конце стадии (б) количество витамина K2, продуцированное культурой покоящихся клеток, превышает на коэффициент, равный, по меньшей мере, примерно 1,5, количество витамина K2, полученное при культивировании указанного штамма в стандартных условиях ферментации. Указанный коэффициент более предпочтительно равен, по меньшей мере, примерно 1,7; еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 1,8; даже более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 1,9. Наиболее предпочтительными значениями указанного коэффициента являются значения, равные примерно 2, примерно 2,2, примерно 2,4, примерно 2,5, примерно 2,7, примерно, 2,8, примерно 2,9 и примерно 3.

Предпочтительно уровень продуцирования витамина K2, достигаемый с применением средств изобретения, составляет около 30 мкг витамина K2/100 г ферментированного молока при стандартных условиях ферментации. В лучшем случае уровень продуцирования может достигать примерно 40 мкг витамина K2/100 г ферментированного молока, более предпочтительно он может достигать или даже превышать примерно 45 мкг или 50 мкг витамина K2/100 г ферментированного молока. Так, предпочтительными, в частности, являются уровни продуцирования примерно 55 мкг, примерно 60 мкг, примерно 65 мкг, примерно 70 мкг или примерно 75 мкг витамина K2/100 г ферментированного молока либо даже выше.

Согласно одному из вариантов воплощения изобретения штамм молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, который используется в способе изобретения, выбирается из рода Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus и Propionibacterium. В частности, штамм молочнокислых бактерий выбирается из видов Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium и Propionibacterium sp. Предпочтительно штамм молочнокислых бактерий выбирается из природных вариантов Lactococcus lactis subsp.cremoris-продуцента витамина K2, которые были получены авторами настоящего изобретения в ходе проведенной ими работы (см. ниже раздел "Примеры"), таких как: вариант I-3557, зарегистрированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Франция) (France's Collection Nationale de Culture des Microorganismes) (CNCM, Pasteur Institute, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) 20/01/2006; вариант I-3558, зарегистрированный в CNCM 20/01/2006, и вариант I-3626, зарегистрированный в CNCM 19/06/2006.

В контексте описания термин "вариант" охватывает:

- природные варианты, т.е. варианты, полученные спонтанно из стандартного штамма молочнокислых бактерий под воздействием давления отбора; поэтому эти природные варианты не являются продуктами генной инженерии, а получены преимущественно путем мутации и селекции из стандартного штамма, и

- мутанты, полученные одной или более мутациями в геноме, индуцированными генной инженерией, т.е. методами направленного мутагенеза, в частности, методом генетической трансформации с использованием векторов, применимых к стандартному штамму.

Во всех случаях "варианты" в контексте изобретения обозначают штаммы, способные продуцировать витамин K2. Если уровень продуцирования вариантом витамина K2 составляет, по меньшей мере, около 5,5 мкг/100 г ферментированного молока при стандартных условиях ферментации (называемые также "лабораторными условиями"), то такой вариант предпочтительно считается "сверхпродуцирующим" штаммом.

Следует заметить, что в некоторых странах (в частности, в Европе) производителям пищевой продукции предписано соблюдать меры предосторожности при разработке продуктов, предназначенных для потребления человеком и/или животным, в которые вводятся микроорганизмы, более конкретно - живые микроорганизмы, поскольку генетически модифицированные организмы (в данном случае микроорганизмы), обозначаемые как ГМО или мутанты, могут вызывать у потребителей страх и опасения.

Такое негативное представление, из-за которого в некоторых странах страдает репутация ГМО, приводит к тому, что потребители бойкотируют пищевые продукты, содержащие ГМО. Так, под давлением требований потребителей к большей прозрачности в обозначении уровней содержания и происхождения ингредиентов в предлагаемых им пищевых продуктах производители будут, вероятно, вынуждены поставлять на продажу квазиисключительно, даже эксклюзивно, такие продукты, которые не содержат ГМО. Поэтому в контексте настоящего изобретения может быть предпочтительным, чтобы выпускаемые промышленностью пищевые продукты, содержащие микроорганизмы, изготавливались исключительно с природными штаммами или природными вариантами природных штаммов.

Согласно одному из вариантов воплощения изобретения на стадии (а) пригодная для цели изобретения культуральная среда содержит жир. Она содержит предпочтительно, по меньшей мере, около 0,5% жира; более предпочтительно, по меньшей мере, около 1,5% жира; наиболее предпочтительно, по меньшей мере, около 3,5% жира. В одном из вариантов такая среда может содержать, например, молочные сливки или соевое молоко. Это может быть также обычное молоко или молоко с повышенной буферной способностью. Само собой разумеется, что могут использоваться и комбинации этих различных сред. Примеры "молока с повышенной буферной способностью" включают, в частности, молоко с добавлением β-глицерофосфата, и/или цитрата, и/или молочных белков, и/или любого другого, пригодного для данной цели пищевого ингредиента с буферной способностью.

Например, полужирное молоко обычно содержит около 1,5% жира; цельное молоко - около 3,5% жира.

В одном из предпочтительных вариантов воплощения способ изобретения включает также, по меньшей мере, одну стадию, предваряющую стадию (а) и заключающуюся в первичном выращивании штамма в условиях поддержания дыхания на подходящей для этого питательной среде, содержащей, по меньшей мере, один порфирин в конечной концентрации, по меньшей мере, около 0,5 мкг/мл. Более предпочтительные концентрации и/или диапазоны концентраций порфирина составляют, по меньшей мере, около 1 мкг/мл; предпочтительнее, по меньшей мере, около 5 мкг/мл или, по меньшей мере, около 10 мкг/мл.

Предпочтительно полученная предкультура инкубируется при температуре примерно от 4°C до 40°C, более предпочтительно - при температуре примерно от 18°C до 35°C, наиболее предпочтительно - при температуре около 30°C.

Время инкубации предкультуры может варьировать в зависимости от штамма и от других условий. Предпочтительно оно составляет, по меньшей мере, около 12 ч; более предпочтительно, по меньшей мере, около 16 ч.

Снабжение кислородом предкультуры может осуществляться перемешиванием или аэрацией.

Промежуточная стадия может проводиться также между предварительной стадией первичного культивирования с получением предкультуры и стадией (а) способа изобретения. Эта промежуточная стадия предусматривает концентрирование биомассы, полученной в конце стадии первичного культивирования, например, путем центрифугирования предкультуры с последующим извлечением бактериального осадка.

Следует заметить, что с учетом применения предмета настоящего изобретения в пищевой промышленности условия осуществления способа должны быть (i) пригодными для выполнения в промышленном масштабе (в рамках реализуемости, выхода продукции, производственных затрат, оборудования и др.) и (ii) применимыми к пищевым продуктам (в рамках физических и органолептических показателей готовых продуктов (вкус, запах, консистенция, внешний вид и др.)).

Второй аспект настоящего изобретения относится к обогащенной биомассе, полученной путем культивирования, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2 в условиях покоящихся клеток, описанным выше способом.

В третьем аспекте настоящего изобретения вышеупомянутая биомасса используется для производства пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу продуцирования витамина K2, который включает, по меньшей мере:

(а) осуществление способа увеличения количества витамина K2, получаемого культивированием, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в соответствии с предыдущим описанием и

(б) извлечение полученного таким способом витамина K2.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к способам производства пищевого продукта, обогащенного витамином K2, или к способам обогащения пищевого продукта витамином K2.

В первом варианте воплощения один такой способ включает, по меньшей мере:

(а) продуцирование витамина K2 способом согласно четвертому аспекту изобретения;

(б) добавление продуцированного таким способом витамина K2 в указанный пищевой продукт или в его полуфабрикат и

(в) получение указанного пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

Во втором варианте воплощения способ производства пищевого продукта, обогащенного витамином K2, включает, по меньшей мере:

(а) культивирование, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в условиях покоящихся клеток согласно способу увеличения количества витамина K2, полученного из культуры указанного штамма (первый аспект изобретения);

(б) добавление биомассы, полученной из культуры стадии (а), в указанный пищевой продукт или в его полуфабрикат и

(в) получение указанного пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

Альтернативно он может предусматривать одновременное проведение описанных выше стадий (а) и (б):

(а) культивирование, по меньшей мере, одного штамма молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин K2, в условиях покоящихся клеток согласно способу увеличения количества витамина K2, полученного из культуры указанного штамма (первый аспект изобретения), в указанном пищевом продукте или в его промежуточной основе и

(б) получение указанного пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

В этом случае штамм или штаммы могут использоваться исключительно в виде концентратов бактерий, первично культивированных на месте, т.е. по месту производства пищевых продуктов, или бактерий, первично культивированных поставщиком заквасок, а затем расфасованных и доставленных к месту или местам производства пищевых продуктов. Поставщики могут фасовать бактерии в жидком или замороженном состоянии; альтернативно бактерии могут подвергаться сушке или лиофилизации. Во всех случаях бактерии добавляются в молочную массу полностью традиционным способом (как любая другая известная закваска молочнокислых бактерий). На последующей стадии культивирования при условиях, благоприятных для продуцирования витамина K2, применяются режимы согласно способу изобретения.

Еще один вариант воплощения способа обогащения пищевого продукта витамином K2 включает, по меньшей мере:

(а) добавление биомассы, полученной согласно настоящему изобретению, в указанный пищевой продукт или в его промежуточную основу и

(б) получение указанного пищевого продукта, обогащенного витамином K2.

В типичных случаях биомасса используется таким же путем, что и традиционная закваска молочнокислых бактерий.

Шестой аспект настоящего изобретения касается пищевого продукта, обогащенного витамином K2, полученным вышеописанным способом.

Альтернативно пищевой продукт, обогащенный витамином K2 способом настоящего изобретения, содержит описанную выше биомассу.

Изобретение относится к пищевым продуктам, предназначенным для человека и/или животных, предпочтительно - к продуктам, предназначенным для потребления человеком. Преимущественно такой пищевой продукт, обогащенный витамином K2, повышает прочность костей у индивидуума, потребляющего этот продукт. Предпочтительно этим индивидуумом является ребенок.

Предпочтительно пищевой продукт в контексте изобретения выбирается из ферментированных продуктов, ферментированных или неферментированных свежих молочных продуктов, ферментированных или неферментированных продуктов, содержащих сок растительного происхождения (фрукты, овощи, зерновые, соя и др.), и их комбинаций. Более предпочтительно пищевой продукт в контексте изобретения является ферментированным продуктом и/или свежим молочным продуктом.

В контексте изобретения "свежие молочные продукты" обозначают, в частности, свежие и ферментированные молочные продукты, готовые для употребления человеком, т.е. свежую и ферментированную молочную пищу. Более конкретно, настоящая заявка относится к ферментированному молоку и йогурту. Указанные свежие и ферментированные молочные продукты, альтернативно, могут представлять собой сыр коттедж (домашний сыр) или "petits-suisses" (франц. продукт типа творожной массы).

"Ферментированное молоко" и "йогурт" - это стандартные названия, используемые в молочной промышленности, т.е. продукты, предназначенные для человека и получаемые подкислением молочного субстрата за счет молочнокислого брожения. Эти продукты могут содержать дополнительные ингредиенты, такие как фрукты, растения, сахар и др. Можно сослаться, например, на стандарт Франции №88-1203 (от 30 декабря 1988 г.) на ферментированное молоко и йогурт, опубликованный в Официальном журнале Французской Республики (Official Journal of the French Republic) 31 декабря 1988 г.

Можно сослаться также на "Кодекс Алиментариус" (стандарты на продовольственные товары) (составленный комиссией Кодекс Алиментариус под эгидой ФАО и ВОЗ и опубликованный отделом информации ФАО и доступный на сайте http://www.codexalimentarius.net; более конкретно см. том 12 Кодекса Алиментариуса "Codex standards for milk and milk products" (Стандарты Кодекса на молоко и молочные продукты) и стандарт "CODEX STAN A-11 (а) - 1975").

Выражение "ферментированное молоко" обозначает в настоящей заявке молочные продукты, изготавливаемые на молочном субстрате, подвергнутом обработке, эквивалентной, по меньшей мере, пастеризации, и сквашенном микроорганизмами, относящимися к видам, характерным для того или иного продукта. "Ферментированное молоко" не подвергается обработке, имеющей целью удаление какого-то составного элемента используемого молочного субстрата, в частности, не подвергается операции по удалению сыворотки из сгустка. Коагуляция "ферментированного молока" не должна проводиться никаким иным способом, кроме как за счет активности используемых микроорганизмов.

Термин "йогурт" обозначает ферментированное молоко, получаемое в результате жизнедеятельности локально и повсеместно используемых специфических термофильных молочнокислых бактерий, таких как Lactobacillus bulgaricus (болгарская палочка) и Streptococcus thermophilus (термофильный стрептококк), причем концентрация живых микроорганизмов в готовом продукте должна составлять, по меньшей мере, 10 млн бактерий в 1 г молочной части продукта.

В некоторых странах пищевым законодательством разрешается добавлять и другие молочнокислые бактерии в йогурт и преимущественно дополнительно использовать штаммы Bifidobacterium, и/или Lactobacillus acidophilus, и/или Lactobacillus casei. Эти дополнительные молочнокислые штаммы предназначаются для придания готовому продукту различных свойств, например для поддержания баланса кишечной флоры или для модуляции иммунной системы.

На практике выражение "ферментированное молоко" в большинстве случаев употребляется для обозначения ферментированных молочных продуктов, отличающихся от йогурта. В зависимости от страны это может быть, например, "кефир", "кумыс", "ласси" (индийский кисломолочный напиток), "дахи" (индийский кисломолочный продукт типа творога), "лебен" (египетский кисломолочный напиток типа кефира), "Filmjôlk" (финский кисломолочный напиток, употребляемый с кашами), "Villi" (финский кисломолочный напиток типа простокваши) или "ацидофильное молоко".

В случае ферментированного молока количество свободной молочной кислоты, содержащееся в ферментированном молочном субстрате, должно быть не ниже 0,6 г/100 г в период продажи потребителю, а содержание белка, обеспечиваемое молочной частью продукта, должно быть не ниже, чем в обычном молоке.

И, наконец, название "сыр коттедж" или "petit-suisse" (продукт типа домашнего сыра) в настоящей заявке относится к сыру, который не подвергается ни рафинированию, ни посолке и который подвергается только ферментации молочнокислыми бактериями (и никакой другой ферментации, кроме молочнокислого брожения). Количество сухих веществ в сыре коттедж может снижаться до 15 г или 10 г/100 г продукта, в соответствии с чем содержание жира в нем может превышать 20 г или большей частью равняться 20 г/100 г сыра коттедж после полного обезвоживания. Содержание сухих веществ в сыре коттедж составляет от 13% до 20%. Количество сухих веществ в "petit-suisse" составляет не ниже 23 г/100 г продукта. В большинстве случаев содержание сухих веществ в "petit-suisse" составляет от 25% до 30%. Сыры коттедж и "petit-suisse" обычно называются "свежими сырами", т.е. сырами без созревания, используемые традиционным путем в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Нижеследующие фигуры иллюстрируют настоящее изобретение, но ни в коей мере не ограничивают его цели или масштаб.

Фиг.1. Гистограмма, показывающая влияние концентрации молочного жира на продуцирование витамина K2 молочнокислыми бактериями. Штаммы 1 и 2: примеры природных штаммов Lactococcus lactis ssp. cremoris.

Фиг 2. Примеры кинетики процесса продуцирования витамина K2 в цельном молоке и кинетики процесса нарастания кислотности (вставка вверху слева) при использовании природного штамма молочнокислых бактерий (штамм no. 1).

Фиг.3. Гистограмма, показывающая продуцирование витамина K2 культурами покоящихся клеток при различных температурах. Контроль: культивирование при стандартных условиях роста.

Фиг.4. Гистограмма, показывающая влияние условий получения первичной культуры или предкультуры на продуцирование витамина K2 в зависимости от штамма.

Фиг.5. График, показывающий влияние начальной популяции бактерий природного варианта I-3558 на продуцирование витамина K2 в фазе покоя клеток, проводившееся с использованием обычного молока или молока с повышенной буферной способностью. "Без поддержания дыхания": получение предкультуры традиционным методом и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в цельном молоке. "Лабораторные условия поддержания дыхания": получение предкультуры в условиях дыхания, проводившееся в пробирке с питательной средой, и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в цельном молоке. "Лабораторные условия поддержания дыхания в молоке с повышенной буферной способностью": получение предкультуры в условиях дыхания и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в молоке с повышенной буферной способностью за счет добавления β-глицерофосфата. "Поддержание дыхания бактерий в ферментере": получение предкультуры в условиях поддержания дыхания, проводившееся в ферментере, с последующим культивированием в условиях покоящихся клеток в традиционном молоке.

Фиг.6. Гистограмма, показывающая влияние жизнеспособности бактерий природного варианта I-3558 на продуцирование витамина K2 в фазе покоя клеток. VitK STZ: получение предкультуры в условиях поддержания дыхания с обработкой стрептозотоцином и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в цельном молоке с добавлением эритромицина. VitK R+: получение предкультуры в условиях поддержания дыхания, проводившееся в пробирке с питательной средой, и последующее культивирование в условиях покоящихся клеток в цельном молоке.

Само собой разумеется, что настоящее изобретение не ограничивается только вышеприведенным описанием. Другие варианты воплощения и преимущества изобретения станут очевидными из примеров, приведенных ниже в чисто иллюстративных целях.

Примеры

Часть А. Получение природных вариантов природных штаммов молочнокислых бактерий, способных продуцировать повышенные количества витамина K

В качестве предварительного замечания следует сказать, что методики получения природных вариантов, описанные ниже, применимы к любому виду исходного штамма молочнокислых бактерий. В зависимости от исходных штаммов, используемых квалифицированным в данной области техники специалистом, может быть желательным, в первую очередь из практических соображений, изменение некоторых из экспериментальных условий, разработанных авторами изобретения. В любом случае изменения, которые квалифицированный в данной области техники специалист сочтет необходимым внести в описанные ниже методики, будут, по всей вероятности, незначительными и потребуют только простых и рутинных операций, не включающих изобретательскую стадию.

A-I- Получение и применение природных вариантов, устойчивых к бацитрацину

Хотя известно, что подвергание воздействию таких агентов, как бацитрацин или пероксид, делает возможным отбор бактериальных штаммов с повышенной устойчивостью к этим агентам, но связь между устойчивостью к бацитрацину или пероксиду и уровнями продуцирования бактериями витамина K2 до настоящего времени не освещалась в литературе.

В ходе своей работы авторам изобретения совершенно неожиданным путем удалось открыть, что бактерии способны создавать оригинальный механизм устойчивости к некоторым агентам, таким как бацитрацин или пероксид, который включает увеличение продуцирования витамина K2. Авторы изобретения попытались применить свое открытие для получения природных вариантов штаммов молочнокислых бактерий (преимущественно Lactobacillus lactis), способных к сверхпродуцированию витамина K2, используя бацитрацин или пероксид, например, в качестве агента для отбора таких вариантов.

A-I-1 Методика получения вариантов, устойчивых к бацитрацину

Приготовление предкультуры проводилось из кристалла природного штамма Lactobacillus lactis в 2 мл традиционной готовой питательной среды M17 (M17 агар, Difco™) с добавлением 5 г/л лактозы (далее по тексту - M17 Lac) и гемина (20 мкл/мл; далее по тексту - M17 Lac+гемин). Инкубация проводилась в условиях перемешивания при 30°C.

Предкультура использовалась для инокуляции 2 мл среды (Ml7 Lac+гемин) с добавлением бацитрацина (4 мкг/мл). Норма инокуляции составила 1%. Затем культура инкубировалась в течение 48 ч в условиях п