Модуляторы нейрональной регенерации

Модуляторы нейрональной регенерации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение в основном относится к развитию нервной системы и к неврологическим расстройствам. Конкретно настоящее изобретение относится к идентификации новых модуляторов ассоциированной с миелином ингибирующей системы и к различным вариантам использования идентифицированных таким образом модуляторов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Миелин и миелин-ассоциированные белки

Известно, что аксоны нейронов ЦНС взрослых млекопитающих обладают очень ограниченной способностью регенерировать после повреждения, тогда как аксоны в периферической нервной системе (ПНС) регенерируют быстро. Ограниченная способность нейронов ЦНС к регенерации является собственным свойством аксонов ЦНС, но, кроме того, определяется также особенностями среды, которая не способствует такой возможности. Миелин ЦНС, хотя он и не является единственным источником, определяющим ингибирующее воздействие на рост нейритов, содержит множество молекул ингибирующего действия, которые активно блокируют рост аксонов и, в этой связи, создают значительный барьер для регенерации. Были идентифицированы три таких миелин-ассоциированных белка (МАВ): Nogo (также известный как NogoA) является членом семейства белков Reticulon, имеющих два трансмембранных домена; миелин-ассоциированный гликопротеин (MAG) представляет собой трансмембранный белок из надсемейства Ig; и OMgp представляет собой белок с лейцин-обогащенными повторами (LRR) с гликозилфосфатидилинозитоловым (GPI) фрагментом (Chen et al., Nature 403:434-39 (2000); GrandPre et al., Nature 417:439-444 (2000); Prinjha et al., Nature 403:383-384 (2000); McKerracher et al, Neuron 13:805-11 (1994); Wang et al, Nature 417:941-4 (2002); Kottis et al J. Neurochem 82:1566-9 (2002)). Nogo66, представляющий собой часть NogoA, был описан как внеклеточный полипептид из 66 аминокислот, обнаруженный во всех трех изоформах Nogo.

Несмотря на структурные различия, все три ингибирующих белка (а также Nogo66), как было показано, связываются с одним и тем же рецептором с GPI-фрагментом, называемым Nogo-рецептором (NgR; также известным как Nogo-рецептор-1 или NgR1), и было высказано предположение, что NgR может быть необходим в качестве посредника ингибирующего действия Nogo, MAG и OMgp (Fournier et al., Nature 409:34'-346 (2001). Были также идентифицированы два NgR1 гомолога (NgR2 и NgR3) (патент США 2005/0048520 A1 (Strittmatter et al.), опубликованный 3 марта 2005 года). Ввиду того, что NgR представляет собой белок клеточной поверхности с GPI-фрагментом, маловероятно, что он может представлять собой непосредственный сигнальный трансдуктор (Zheng et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:1205-1210 (2005)). Другие авторы высказали предположение, что рецептор нейротрофина p75^NTR действует как ко-рецептор для NgR и обеспечивает сигнал-трансдуцирующий фрагмент в рецепторном комплексе (Wang et al., Nature 420:74-78 (2002); Wong et al., Nat. Neurosci. 5:1302-1308 (2002)).

Однако последние исследования рецепторного комплекса NgR/p75^NTR подняли вопрос о роли NgR в миелин-ассоциированной ингибирующей системе. Zheng et al. показали, что генетическая делеция NgR не снижает ингибирование нейрита in vitro, как и не стимулирует регенерацию пирамидного пути (CST) in vivo. (Zheng et al. (2005), выше). Аналогично по результатам другого исследования также не удалось обнаружить какой-либо повышенной регенерации CST у NgR мутантных мышей. (Kim et al, Neuron 44:439-451 (2004)). Эти наблюдения противоречат гипотезе о том, что рецепторный комплекс NgR/p75^NTR представляет собой ключевую точку в конвергенции множества ингибирующих сигналов. Неспособность к регенерации CST у NgR мутантных мышей не согласуется с данными о регенерации CST, наблюдаемой у животных дикого типа, которым вводили пептидный антагонист взаимодействия Nogo66/NgR (GrandPre et al. Nature 417:5470551 (2002) и Li и Strittmatter, Nature 23:4219-4227 (2002)). В другом исследовании было показано, что экспрессия доминант-отрицательного фрагмента NgR ведет к повышенной регенерации аксонов зрительного нерва в сочетании с соответствующим повреждением. Причем в обоих экспериментах не удалось определить непосредственно вовлечения NgR, поскольку оба антагонистических пептида обладают способностью препятствовать действию других ингибирующих лигандов/рецепторов.

Указанные несоответствия, имеющиеся в результатах проведенных экспериментов, представляют собой очень значимое указание на то, что NgR или рецепторный комплекс NgR/p75^NTR может играть лишь ограниченную роль в миелин-ассоциированном ингибировании регенерации ЦНС и что другие компоненты, такие как дополнительные рецепторы, соответствующие связывающие молекулы и другие компоненты, могут принимать участие в передаче ингибирующего сигнала.

PirB и ортологи человека

Главная система тканевой совместимости (MHC) класса I была первоначально идентифицирована как область, кодирующая семейство молекул, важных для иммунной системы. В последнее время были получены данные, подтверждающие тот факт, что молекулы MHC класса I обладают дополнительными функциями в развитии и созревании ЦНС взрослого организма. (Boulanger и Shatz, Nature Rev Neurosci. 5:521-531 (2004); патент США 2003/0170690 (Shatz and Syken), опубликованный 11 сентября 2003 года). Было показано, что многие представители MHC класса I и соответствующие им связующие молекулы экспрессируются в нейронах ЦНС. Проведенные в последнее время генетические и молекулярные исследования были сконцентрированы на изучении физиологических функций молекул MHC класса I ЦНС и первоначальные результаты позволили предположить, что молекулы MHC класса I могут вовлекаться в синаптическую пластичность, зависимую от активности, процесс, в ходе которого сила существующих синаптических соединений повышается или понижается в ответ на нейрональную активность, с последующим созданием длительных структурных изменений в системе. Более того, область, кодирующая молекулы MHC класса I, также генетически связана с широким спектром расстройств, характеризующихся неврологическими симптомами, и полагают, что аномальные функции молекул MHC класса I вносят определенный вклад в нарушение нормального развития головного мозга и его пластичности.

Одним из известных рецепторов соединений MHC класса I в иммунном наборе является PirB, мышиный полипетид, который был впервые описан Кубагавой с соавт. (Kubagawa et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:5261-6 (1997)). Мышиный PirB имеет несколько ортологов человеческого происхождения, которые являются членами надсемейства В лейкоцитарных иммоноглобулин-подобных рецепторов (LILRB), также обозначаемых как «иммуноглобулин-подобные транскрипты» (ILT). Человеческие ортологи демонстрируют выраженную гомологию с последовательностью мышиных молекул, в следующем порядке, начиная от высшей в направлении к низшей степени гомологии: LILRB3/ILT5, LILRB1/ILT2, LILRB5/ILT3, LILRB2/ILT4 и, как и PirB, все они являются ингибирующими рецепторами. LILRB3/ILT5 (NP_006855) и LILRB1/ILT2 (NP_006660) были впервые описаны Samaridis and Colonna, Eur. J. Immunol. 27(3):660-665 (1997). LILRB5/ILT3 (NP_006831) был идентифицирован Borges et al., J. Immunol. 159(11):5192-5196 (1997). LILRB2/ILT4 (также известный как MIR10) был идентифицирован Colonna et al, J. Exp. Med. 186:1809-18 (1997). PirB и его человеческие ортологи демонстрируют высокую степень структурной вариабельности. Последовательности различных форм с альтернативным сплайсингом доступны от EMBL/GenBank, включая, например, последовательности с указанными ниже номерами доступа для кДНК человека ILT4: ILT4-c11 AF009634; ILT4-c117 AF11566; ILT4-c126 AF11565. Как указывалось выше, полипептиды PirB/LILRB представляют собой ингибирующие рецепторы соединений MHC класса I (MHCI) и хорошо известны по той роли, которую они выполняют в регулировании активации иммунных клеток (Kubagawa et al., выше; Hayami et al., J. Biol. Chem. 272:7320 (1997); Takai et al., Immunology 115:433 (2005); Takai et al, Immunol. Rev. 181:215 (2001); Nakamura et al, Nat. Immunol. 5:623 (2004); Liang et al., Eur. J. Immunol. 32:2418 (2002)).

В недавнем исследовании, проведенном Сайкен с соавт. (Syken et al. (Science 313:1795-800 (2006)), было показано, что PirB экспрессируется в подмножестве нейронов по всему головному мозгу. В случае мутантных мышей, у которых отсутствует функциональный PirB, пластичность корковой зрительной доминантности (OD) значительно повышается во всех возрастных группах, указывая на возможную функцию PirB в ограничении зависимой от активности пластичности в зрительной коре.

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном выявлении того факта, что PirB/LILRB являются связывающими партнерами для Nogo (Nogo66) и MAG, и что PirB/LILRB являются антагонистами и сниженная активность PirB/LILRB эффективно разрушает миелин-ассоциированный ингибирующий путь, ускоряя тем самым нейрональную регенерацию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации антагониста PirB/LILRB, включающему контактирование исследуемого агента с рецепторным комплексом, который включает PirB/LILRB и миелин или миелин-ассоциированный белок или его фрагмент и детекцию способности исследуемого агента ингибировать взаимодействие между PirB/LILRB и миелин-ассоциированным белком или его фрагментом, где указанный исследуемый агент идентифицируют как антагонист, если взаимодействие ингибируется.

В одном варианте выявляемое взаимодействие представляет собой связывание.

В другом варианте выявляемое взаимодействие представляет собой клеточную передачу сигнала.

В еще одном варианте клеточная передача сигнала приводит к ингибированию роста аксона или нейрональной регенерации.

В еще одном варианте миелин-ассоциированный белок выбран из группы, состоящей из Nogo, MAG, OMgp и их фрагментов.

В другом варианте PirB/LILRB представляют собой белок человека LILRB, такой как LILRB1, LILRB2, LILRB3 или LILRB5.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения PirB/LILRB выбран из группы, состоящей из: LILRB2, варианта транскрипта 1 (SEQ ID NO: 2), LILRB2, варианта транскрипта 2 (SEQ ID NO: 14), LILRB1, варианта транскрипта 1 (SEQ ID NO: 10), LILRB1, варианта транскрипта 2 (SEQ ID NO: 11), LILRB1, варианта транскрипта 3 (SEQ ID NO: 12), LILRB1, варианта транскрипта 4 (SEQ ID NO: 13), L1LRB3, варианта транскрипта 1 (SEQ ID 30 NO: 15), LILRB3, варианта транскрипта 2 (SEQ ID NO: 16), LILRB5, варианта транскрипта 1 (SEQ ID NO: 17), LILRB5, варианта транскрипта 2 (SEQ ID NO: 18) и LILRB5, варианта транскрипта 3 (SEQ ID NO: 19).

В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения рецепторный комплекс дополнительно содержит NgR.

В других вариантах исследуемый агент выбран из группы, состоящей из антител, полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот, малых органических молекул, полисахаридов и полинуклеотидов и, предпочтительно, он представляет собой антитело или короткую интерферирующую РНК (киRNA). Указанное антитело предпочтительно специфически связывается с PirB/LILRB, таким как LIRB2, и включает, без ограничения, химерные, гуманизированные, антитела человека и фрагменты антител.

В конкретном варианте указанный фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из Fv, Fab, Fab' и F(ab')₂ фрагментов.

В еще одном варианте по меньшей мере один из PirB/LILRB и миелина или миелин-ассоциированного белка или его фрагмента иммобилизован.

В еще одном варианте используемый анализ представляет собой клеточный анализ.

В конкретном варианте клеточный анализ включает культивирование нейрональных клеток с миелином или миелин-ассоциированным белком, или его фрагментом, в присутствии или в отсутствие исследуемого агента, и определение наличия изменений в длине нейрита, где исследуемый агент идентифицирован как антагонист, когда длина нейрита становится больше в присутствии исследуемого агента.

В указанном выше клеточном анализе нейрональные клетки могут представлять собой первичные нейроны или, например, могут быть получены из клеток или клеточных линий, включающих стволовые клетки, например эмбриональные стволовые клетки (ES). В других вариантах указанные нейроны могут быть выбраны, например, из группы, состоящей из гранулярных нейронов мозжечка, нейронов спинномозговых узлов и корковых нейронов.

В одном варианте описанные выше способы дополнительно включают стадию использования идентифицированного антагониста с целью усиления роста нейрита и/или для стимуляции нейронального роста, восстановления и/или регенерации.

В другом варианте описанные выше способы дополнительно включают стадию введения идентифицированного антагониста субъекту, имеющему указанное заболевание или состояние, которое может быть ослаблено за счет усиления роста нейрита, стимуляции нейронального роста, восстановления или регенерации. Такое заболевание или состояние может, например, представлять собой неврологическое расстройство, которое может характеризоваться физически поврежденным нервом или может быть выбрано из группы, состоящей из повреждения периферического нерва, вызванного физическим повреждением, диабетом; физического повреждения центральной нервной системы; повреждения головного мозга, ассоциированного с инсультом, невралгии тройничного нерва, глоссофарингеальной невралгии, паралича Белла, миастении гравис, мышечной дистрофии, бокового амиотрофического склероза (ALS), прогрессирующей мышечной атрофии, прогрессирующей бульбарной наследственной мышечной атрофии, грыжи, разрыва и пролапса межпозвоночных дисков, шейного спондилеза, расстройств, затрагивающих сплетение, синдрома лестничной мышцы (сдавления плечевого сплетения и подключичной артерии), периферической нейропатии, порфирии, синдрома Гийена-Барре, болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона и болезни Паркинсона.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к агенту, идентифицированному по одному из приведенных в описании способу.

В одном варианте агент выбран из группы, состоящей из антител, полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот, малых органических молекул, полисахаридов и полинуклеотидов и, предпочтительно, он представляет собой антитело или короткую интерферирующую РНК (киRNA).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей агент, идентифицированный согласно приведенным в описании способам, для стимуляции нейрональной регенерации.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему агент, идентифицированный согласно приведенным в описании способам, и инструкции по нейрональной регенерации.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению комплекса PirB/LILRB и миелина или миелин-ассоциированного белка, или его фрагмента для идентификации антагониста PirB/LILRB.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению антагониста PirB/LILRB при получении лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, в случае которых достигается улучшение за счет ускорения роста нейрита, стимуляции нейронального роста, их восстановления или регенерации.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению антагониста PirB/LILRB при получении лекарственного средства для лечения неврологического расстройства, где указанное неврологическое расстройство может характеризоваться физически поврежденным нервом или указанное расстройство может быть выбрано, например, из группы, состоящей из повреждения периферического нерва, вызванного физическим повреждением, диабетом; физического повреждения центральной нервной системы; повреждения головного мозга, ассоциированного с инсультом, невралгии тройничного нерва, глоссофарингеальной невралгии, паралича Белла, миастении гравис, мышечной дистрофии, бокового амиотрофического склероза (ALS), прогрессирующей мышечной атрофии, прогрессирующей бульбарной наследственной мышечной атрофии, грыжи, разрыва и пролапса межпозвоночных дисков, шейного спондилеза, расстройств, затрагивающих сплетение, синдрома лестничной мышцы (сдавления плечевого сплетения и подключичной артерии), периферической нейропатии, порфирии, синдрома Гийена-Барра, болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона и болезни Паркинсона.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антагонисту PirB/LILRJB для применения при лечении заболевания или состояния, в случае которых достигается улучшение за счет ускорения роста нейрита, стимуляции нейронального роста, их восстановления или регенерации.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к антагонистам PirB/LILRB для применения при лечении неврологического расстройства, где указанное неврологическое расстройство описано выше.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фиг. 1 продемонстрирована активность щелочной фосфатазы на трансфицированных клетках COS после инкубации с AP-Nogo66. AP-Nogo66 связывается с PirB и LILRB2.

На фиг. 2 продемонстрирована иммунореактивность на трансфицированных клетках COS после инкубации с MAG-Fc. MAG связывается с PirB и LILRB2.

На фиг. 3 показаны результаты анализа по методу ОТ-ПЦР, демонстрирующие наличие экспрессии SMAGP, PAN-PirA и PirB в разных частях нервной системы.

На фиг. 4A-4C приведены иллюстрации, подтверждающие в рамках проведенной гибридизации in situ экспрессию PirB в переднем мозге взрослого организма (A), в мозжечке взрослого организма (B) и в P10 спинномозговом узле (C).

На фиг. 5 показана аминокислотная последовательность мышиного PirB (SEQ ID NO: 1) и человеческого LILRB2, аминокислотная последовательность транскрипта варианта 1 (SEQ ID NO: 2).

На фиг. 6 проиллюстрировано ингибирование под действием Nogo66 роста аксона и реверсия такого ингибирования под действием PirB ECD (и PirBFc, и PirBHis). Для теста были использованы гранулярные нейроны мозжечка.

На фиг. 7 показаны результаты совместной иммунопреципитации PirB и NgR. NgR четко осаждается вместе с PirB (левая панель). На правой панели показан суммарный белок из лизатов целых клеток после проведения иммуноблоттинга с анти-NgR. Множественные полосы (показаны стрелками) отражают NgR, подвергнутый гликозилирующему процессингу в разной степени.

На фиг. 8 показано, что ингибирование роста аксона под действием Nogo66 частично снимается анти-PirB антителами в гранулярных нейронах мозжечка.

На фиг. 9 показана аминокислотная последовательность LILRB1, вариант транскрипта 1 (SEQ ID NO: 10).

На фиг. 10 показана аминокислотная последовательность LILRB1, вариант транскрипта 2 (SEQ ID NO: 11).

На фиг. 11 показана аминокислотная последовательность LILRB1, вариант транскрипта 3 (SEQ ID NO: 12).

На фиг. 12 показана аминокислотная последовательность LILRB1, вариант транскрипта 4 (SEQ ID NO: 13).

На фиг. 13 показана аминокислотная последовательность LILRB2, вариант транскрипта 2 (SEQ ID NO: 14).

На фиг. 14 показана аминокислотная последовательность LILRB3, вариант транскрипта 1 (SEQ ID NO: 15).

На фиг. 15 показана аминокислотная последовательность LILRB3, вариант транскрипта 2 (SEQ ID NO: 16).

На фиг. 16 показана аминокислотная последовательность LILRB5, вариант транскрипта 1 (SEQ ID NO: 17).

На фиг. 17 показана аминокислотная последовательность LILRB5, вариант транскрипта 2 (SEQ ID NO: 18).

На фиг. 18 показана аминокислотная последовательность LILRB5, вариант транскрипта 3 (SEQ ID NO: 19).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

А. Определения

Термины «спаренный иммуноглобулин-подобный рецептор B» и «PirB» используются в данном описании взаимозаменяемо и относятся к нативной последовательности мышиного ингибирующего белка из 841 аминокислоты с SEQ ID NO: 1 (фиг. 5) (NP_035225) и к его гомологам с нативной последовательностью у крыс и других млекопитающих, отличных от человека, включая все природные варианты, такие как варианты транскриптов с альтернативным сплайсингом и аллельные варианты и изоформы, а также их растворимые формы.

Термины «LILRB», «ILT» и «MIR» используются в настоящем описании взаимозаменяемо и относятся ко всем членам надсемейства В на основе «лейкоцитарного иммуноглобулин-подобного рецептора» человека, включая все природные варианты, такие как варианты транскриптов с альтернативным сплайсингом и аллельные варианты и изоформы, а также их растворимые формы. Индивидуальные представители данного семейства обозначаются номерами, следующими за соответствующим буквенным обозначением, например, LILRB3/ILT5, LILRB1/ILT2, LILRB5/ILT3 и LIRB2/ILT4, где ссылка на любого отдельного представителя, если особо не указано иное, также включает ссылку на все природные варианты, такие как варианты транскриптов с альтернативным сплайцсингом и аллельные варианты и изоформы, а также их растворимые формы. Таким образом, например, термин «LILRB1» в контексте настоящего описания специфически включает варианты транскриптов 1-4 (SEQ ID NoNo. 10, 11, 12 и 13, показанные на фиг. 9-12), а также все другие природные варианты, такие как варианты транскриптов с альтернативным сплайсингом и аллельные варианты и изоформы, а также их растворимые формы. Термин «"LILRB2» в контексте настоящего описания специфически включает LILRB2, вариант транскрипта 1 (SEQ ID NO: 2, показанный на фиг. 5) и вариант транскрипта 2 (SEQ ID NO: 14, показанный на фиг. 13), а также все другие природные варианты, такие как другие варианты транскриптов с альтернативным сплайсингом, аллельные варианты и изоформы, а также их растворимые формы. Термин «LILRB3» также специфически включает в контексте настоящего описания LILRB3 вариант транскрипта 1 (SEQ ID NO: 15, показанный на фиг. 14) и вариант транскрипта 2 (SEQ ID NO: 16, показанный на фиг. 15), а также все другие природные варианты, такие как варианты транскриптов с альтернативным сплайсингом, аллельные варианты и изоформы, а также их растворимые формы. Термин «LILRB5» специфически включает варианты транскриптов 1-3 (SEQ ID NoNo: 17-19, показанные на фиг. 16-18), а также все другие природные варианты, такие как другие варианты транскриптов с альтернативным сплайсингом, аллельные варианты и изоформы, а также их растворимые формы.

Термин «PirB/LILRB» в контексте настоящего описания обозначает сокращенное обозначение, относящееся к любому индивидуальному мышиному PirB и человеческим LILRB белкам, а также к их гомологам с нативной последовательностью у других млекопитающих, отличных от человека, включая все природные варианты, такие как варианты транскриптов с альтернативным сплайсингом и аллельные варианты и изоформы, а также их растворимые формы.

Термин «миелин-ассоциированный белок» используется в широком смысле и включает все белки, присутствующие в миелиновых волокнах ЦНС, которые ингибируют регенерацию нейронов, включая Nogo, MAG и OMgp.

Термин «выделенный» применительно к описанию различных рассматриваемых в настоящем изобретении белков обозначает белок, который был идентифицирован и отделен от и/или выделен из компонентов природного окружения. Контаминирующие компоненты природного окружения представляют собой материалы, которые в типичном случае мешают диагностическому использованию белка и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный белок очищают: (1) до степени, достаточной для того, чтобы получить по меньшей мере 15 остатков на N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с вращающимся стаканом и (2) до гомогенности, по данным оценки в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях, с использованием красителя кумасси-голубого или предпочтительно, серебряного красителя, или (3) до гомогенности, по данным масс-спектрохимического анализа или по результатам пептидного картирования. Выделенный белок включает белок in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения рассматриваемого белка не присутствует. Однако обычно выделенный белок получают по меньшей мере в ходе одной стадии очистки.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой такую молекулу нуклеиновой кислоты, которая была идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной контаминирующей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике данной нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты находится в иной форме или в составе иного набора, которые характерны для ее природного состояния. В этой связи выделенные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от молекул нуклеиновой кислоты, которые существуют в клетках в их естественном окружении. Однако термин «выделенная молекула нуклеиновой кислоты» охватывает также молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержатся в клетках и которые обычно экспрессируют такую нуклеиновую кислоту, где, например, указанная молекула нуклеиновой кислоты локализована в хромосоме в месте, отличном от места, характерного для клеток в их естественном окружении.

В контексте настоящего описания термин «антагонист PirB/LILRB» используется для обозначения агента, способного блокировать, нейтрализовать, ингибировать, устранять, снижать или препятствовать активности PirB/LILRB. Конкретно антагонист PirB/LILRB мешает проявлению ингибирующей активности миелин-ассоциированных белков, что приводит к повышению роста нейрита и/или к стимуляции нейронального роста, восстановления и/или регенерации. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный антагонист PirB/LILRB ингибирует связывание PirB/LILRB с Nogo66 и/или MAG, и/или OMgp, за счет связывания с PirB/LILRB. Антагонисты PirB/LILRB включают, например, антитела против PirB/LILRB и их антиген-связывающие фрагменты, усеченные или растворимые фрагменты PirB/LILRB, Nogo 66, MAG или OMgp, которые способны ослаблять связывание между PirB/LILRB и Nogo66 или между PirB/LILRB и MAG, или между PirB/LILRB и OMgp, и малыми молекулами ингибиторов на PirB/LILRB-связанном пути ингибирования. Антагонисты PirB/LILRB также включают короткие интерферирующие молекулы РНК (киРНК), способные ингибировать или снижать экспрессию мРНК PirB/LILRB.

Термин «антитело» в контексте настоящего описания используется в самом широком смысле и конкретно охватывает интактные антитела, моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные на основе по меньшей мере двух интактных антител, а также фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

Термин «моноклональное антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, например индивидуальных антител, включающих практически идентичную популяцию, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфическими молекулами, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Характерные и полезные свойства моноклональных антител включают не только специфичность этих молекул, но также возможность синтезировать их в неконтаминированном другими антителами состоянии. Прилагательное «моноклональный», в данном сочетании, указывает на характер антител, которые получают из гомогенной, по существу, популяции антител, и этот термин не следует трактовать в контексте получения антитела по какому-либо одному конкретному методу. Так, например, моноклональные антитела, используемые согласно настоящему изобретению, могут быть получены по гибридомному методу, впервые описанному Колером с соавт. (Kohler et al, Nature, 256:495 (1975)), или могут быть получены согласно технологии рекомбинантных ДНК (см., например, патент США No. 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть также выделены из библиотеки фаговых антител с использованием методик, описанных, например, Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al, J. Mol Biol, 222:581-597 (1991).

В конкретных вариантах рассматриваемые антитела включают химерные антитела, где часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как оставшиеся одна или несколько цепей идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США No. 4816567; и Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес в настоящем контексте, включают приматизированные антитела, содержащие антиген-связывающие последовательности вариабельного домена, полученные от приматов, отличных от человека (например, от обезьян Старого Света, обезьян Ape и т. п.), и последовательности константного участка молекул человека.

«Фрагменты антител» включают часть интактного антитела, предпочтительно содержащий его антиген-связывающий или вариабельный участок. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab¹, F(ab')₂ и Fv фрагменты; димерные антитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

«Интактное антитело» представляет собой такое антитело, которое включает антиген-связывающий вариабельный участок, а также константный домен легкой цепи (C_L) и константные домены тяжелой цепи C_HI, C_H2 и C_H3. Константные домены могут представлять собой нативные последовательности константных доменов (например, константные домены нативной последовательности молекулы человека) или их варианты по аминокислотной последовательности. Предпочтительно интактное антитело характеризуется наличием одной или нескольких эффекторных функций.

«Гуманизированные» формы антител из источников, отличных от человека (например, грызунов), представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, отличного от человеческого. В основном гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельного участка реципиентной молекулы замещены остатками из гипервариабельного участка молекулы из вида, отличного от человека (донорное антитело), такого как мышь, крыса, кролик или примат, отличный от человека, который имеет желательные значения специфичности, аффинности и емкости. В некоторых случаях остатки в рамке считывания (FR) в молекуле иммуноглобулина человека замещены соответствующими остатками из молекулы, отличной от человека. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Такие модификации вводят с целью дополнительного улучшения характеристик антитела. В основном гуманизированные антитела включают по существу все или по меньшей мере один и, в типичном случае, два вариабельных домена (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv), в которых все, или по существу все, вариабельные петли соответствуют петлям, имеющимся в иммуноглобулине из источника, отличного от человека, и все или по существу все FR соответствуют тем FR, которые имеются в последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также включает по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), в типичном случае иммуноглобулина человека. Дополнительные детали приведены, например, в следующих работах: Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Термин «гипервариабельная область» в контексте настоящего описания относится к участкам вариабельного домена антитела, которые в значительной мере варьируют по последовательности и/или формируют структурно определенные петли. Указанная гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из «участка, определяющего комплементарность», или «CDR» (например, остатки 24-34, 50-56 и 89-97 в вариабельном домене легкой цепи и 31-35, 50-65 и 95-102 в вариабельном домене тяжелой цепи (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), а также остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32, 50-52 и 91-96 в вариабельном домене легкой цепи и 26-32, 53-55 и 96-101 в вариабельном домене тяжелой цепи (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). В обоих случаях остатки вариабельного домена нумеруются в соответствии с системой, введенной Kabat et al., выше, как будет более подробно описано ниже. Остатки из «рамки считывания», или «FR», представляют собой такие остатки вариабельного домена, которые отличаются от остатков в гипервариабельных участках, определенных выше.

«Родительское антитело» или антитело «дикого типа» представляет собой антитело, включающее аминокислотную последовательность, в которой отсутствует одно или несколько аминокислотных изменений, в сравнении с вариантом антитела согласно настоящему описанию. Таким образом, родительское антитело в основном содержит по меньшей мере одну гипервариабельную область, которая отличается по аминокислотной последовательности от той аминокислотной последовательности, которая соответствует гипервариабельной области в варианте антитела согласно настоящему описанию. Родительский полипептид будет включать нативную последовательность (то есть природную последовательность) антитела (включая природный аллельный вариант) или антитела с уже имеющимися аминокислотными модификациями (такими как вставки, делеции и/или другие изменения) в природной последовательности. В тексте описания такие термины: антитело «дикого типа», «WT» и «родительские» или «исходные» антитела используются взаимозаменяемо.

В контексте настоящего описания термины «вариант антитела» или «вариантное антитело» относятся к антителу, которое имеет аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности родительского антитела. Предпочтительно, вариант антитела включает вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи, содержащие аминокислотную последовательность, которая не встречается в природном состоянии. Такие варианты обязательно характеризуются наличием менее чем 100% идентичности или сходства по последовательности с родительским антителом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вариант антитела будет иметь аминокислотную последовательность с показателем идентичности или сходства по аминокислотной последовательности от примерно 75% до менее чем 100%, с аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой или легкой цепей родительского антитела, более предпочтительно от примерно 80% до менее чем 100%, более предпочтительно от примерно 85% до менее чем 100%, еще более предпочтительно от примерно 90% до менее чем 100%, и наиболее предпочтительно от примерно 95% до менее чем 100%. Вариант антитела в основном представляет собой такое антитело, которое включает одно или несколько аминокислотных изменений в одном или нескольких гипервариабельных участках или вблизи этих участков.

Термин «аминокислотное изменение» относится к изменению в аминокислотной последовательности относительно заданной аминокислотной последовательности. Примеры таких изменений включают вставки, замещения и делеции. «Аминокислотное замещение» относится к замене существующего аминокислотного остатка в заданной аминокислотной последовательности остатком другой аминокислоты.

Термин «замещение» применительно к аминокислотному остатку относится к аминокислотному остатку, который замещает или заменяет другой аминокислотный остаток в аминокислотной последовательности. Замещающий остаток может быть природным или неприродным аминокислотным остатком.

Термин «аминокислотная вставка (инсерция)» относится к встраиванию одного или нескольких аминокислотных остатков в заданную аминокислотную последовательность. Аминокислотная вставка может включать «пептидную вставку», где пептид, включающий два или более аминокислотных остатков, соединенных одной или несколькими пептидными связями, вводят в заданную аминокислотную последовательность. В том случае, когда аминокислотная вставка вовлекает встраивание пептида, указанный пептид со вставкой может быть получен путем случайного мутагенеза, так что он будет иметь аминокислотную последовательность, которая не существует в природе. Аминокислотное изменение «вблизи гипервариабельной области» относится к введению или замещению одного или нескольких аминокислотных остатков в N-концевой и/или С-концевой области гипервариабельной области, так что по меньшей мере один из встроенных или замещающих аминокислотных остатков формирует пептидную связь с N-концев