Вакцина ipv-dpt

Вакцина ipv-dpt

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к комбинированной вакцине, в частности к комбинированной вакцине, содержащей инактивированный штамм Сэбин вируса полиомиелита (sIPV), и к способу ее получения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полиомиелит представляет собой инфекционное заболевание, вызываемое вирусом полиомиелита. Вирусы полиомиелита инфицируют человека пероральным путем, пролиферируют в кишечнике и проникают в центральную нервную систему через кровь. Пролиферация в крупных двигательных нейронах вирусов полиомиелита, которые проникли в центральную нервную систему, вызывает дегенерацию и некроз нейронов, способствуя развитию острого периферического паралича конечностей. Более того, когда вирус полиомиелита поражает мозговой дыхательный центр, может наступить смерть от дыхательного паралича. Вакцины от полиомиелита широко используются для подавления возникновения полиомиелита, который вызывает такие тяжелые симптомы.

Используется два типа вакцин от полиомиелита: пероральные живые вакцины от полиомиелита и инактивированные вакцины от полиомиелита. Пероральные живые вакцины от полиомиелита представляют собой вакцины, в которых используются ослабленные штаммы вируса полиомиелита (штаммы Сэбина). Ослабленные штаммы вируса полиомиелита, которые вводят перорально, вызывают нормальные инфекции. Вирусы полиомиелита из пероральных живых вакцин от полиомиелита хорошо растут в кишечнике, приводя к формированию местного иммунитета в кишечнике. Кроме того, когда вирусы полиомиелита из пероральной живой вакцины от полиомиелита попадают в кровь и вызывают виремию, это также стимулирует продукцию антител в крови. Однако из-за того, что способность ослабленных штаммов вируса полиомиелита пролиферировать в центральной нервной системе очень мала, они обычно не вызывают паралич. В организме вакцинированного вирусы полиомиелита из пероральной живой вакцины от полиомиелита размножаются и выделяются с фекалиями от 4 до 6 недель после вакцинации. Экскретируемые вирусы инфицируют людей вокруг вакцинированного, у которых имеется слабый иммунитет или нет иммунитета к полиомиелиту, давая иммунитет или оказывая потенцирующий эффект таким же образом, как у вакцинированного.

Однако в рамках повторного роста в организме вакцинированного или в рамках повторного роста в организме человека, инфицированного экскретируемыми вирусами, ослабленный штамм вируса полиомиелита из пероральной вакцины от полиомиелита иногда дает развитие мутаций в высоковирулентном направлении. В очень редких обстоятельствах такие мутанты вызывают паралич, ассоциированный с вакциной.

Инактивированная вакцина от полиомиелита представляет собой вакцину, которая утратила свою инфективность посредством инактивации вируса полиомиелита формалином. Так как инактивированная вакцина от полиомиелита никогда не размножается в организме вакцинированного и не поражает людей вокруг вакцинированного, она не вызовет паралича, ассоциированного с вакциной. Ранее для получения инактивированных вакцин от полиомиелита использовали высоковирулентные штаммы, но также в последнее время были осуществлены успехи в разработке ослабленных штаммов (штаммов Сэбина) (Biologicals 34, 151-154 (2006); Dev. Bil. Basel. Karger 105, 163-169 (2001), Clinical Virology 30, № 5, 336-343 (декабрь 2002 года)). Отчасти худший рост ослабленных штаммов (штаммов Сэбина) в отличие от высоковирулентных штаммов рассматривался как недостаток.

Вакцины, которые содержат защитный антиген Bordetella pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка, широко используются в качестве комбинированных вакцин от дифтерии-столбняка-коклюша.

Известны поливалентные вакцины, состоящие из бесклеточной вакцины от коклюша, анатоксина дифтерии, анатоксина столбняка и инактивированного вируса полиомиелита (Опубликованный перевод Японии публикации РСТ № 2000-504032).

Клетки Vero представляют собой пассированные клетки почек зеленых макак. Так как эти клетки имеют выраженную чувствительность к различным типам вирусов, они широко используются в культивировании вирусов. Способ получения вакцины энтеровируса типа 71, описанный в литературе, включает культивирование клеток Vero на микроносителе и использование культивированных клеток Vero для выращивания энтеровируса 71 (“Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development,” Suh-Chin Wu, et al.: Vaccine 22, 3858-3864 (2004)). Также были описаны общие условия культивирования клеток с использованием микроносителя (Microcarrier cell culture principles & methods: Pharmacia LKB, Biotechnology, 1988).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В указанных обстоятельствах существует потребность в способе получения комбинированной вакцины, содержащей инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита (sIPV) и также содержащей защитный антиген B. pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка (DPT), где такой способ включает стадию получения вируса полиомиелита штамма Сэбина с высоким титром.

Авторы изобретения провели обширные исследования с целью решения вышеуказанной проблемы. В результате авторы изобретения обнаружили, что высокий титр штамма Сэбина вируса полиомиелита может быть получен культивированием в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя, клеток Vero, инокулированных штаммом Сэбина вируса полиомиелита. После проведения повторных исследований на основании таких открытий авторы изобретения в конечном счете пришли к настоящему изобретению.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает:

(1) Способ получения комбинированной вакцины, содержащей

(A) инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита,

(B) защитный антиген Bordetella pertussis,

(C) анатоксин дифтерии и

(D) анатоксин столбняка,

где способ включает (a) стадию культивирования в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя клеток Vero, инокулированных штаммом Сэбина вируса полиомиелита.

(2) Способ по п.(1) выше, дополнительно включающий:

(b) стадию инфицирования клеток Vero штаммом Сэбина вируса полиомиелита;

(c) стадию, представляющую возможность вирусу полиомиелита пролифелировать;

(d) стадию восстановления вирусной жидкости, содержащей вирус полиомиелита; и

(e) стадию инактивации вируса полиомиелита.

(3) Способ по п.(1) выше, в котором микроноситель имеет концентрацию примерно 5 г/л.

(4) Способ по п.(1) выше, в котором микроносителем является декстрановый микроноситель.

(5) Способ по п.(1) выше, в котором стадию выращивания клеток Vero (стадия (a)) проводят в масштабе по меньшей мере примерно 3 литра.

(6) Способ по п.(1) выше, в котором стадию выращивания клеток Vero (стадия (a)) проводят в масштабе по меньшей мере примерно 30 литров.

(7) Способ по п.(2) выше, дополнительно включающий

(d-2) стадию очистки вирусной жидкости.

(8) Способ по п.(7) выше, в котором стадия очистки (стадия (d-2)) включает:

(i) преобразование вирусной жидкости, восстановленной на стадии (d), в осадок путем ультрацентрифугирования;

(ii) обработку ультразвуком ресуспензии осадка и

(iii) очистку колоночной хроматографией.

(9) Способ по п.(8) выше, в котором очистку колоночной хроматографией (iii) проводят только один раз.

(10) Вакцина, полученная способом по п.(1) выше.

(11) Способ по п.(1) выше, в котором стадию культивирования клеток Vero (стадия (a)) проводят в масштабе по меньшей мере примерно 3 литра.

(12) Способ по п.(1) выше, в котором стадию культивирования клеток Vero (стадия (a)) проводят в масштабе по меньшей мере примерно 30 литров.

Путем культивирования в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя клеток Vero для инокуляции штаммом Сэбина вируса полиомиелита можно получить высокий титр штамма Сэбина вируса полиомиелита. С использованием высокого титра штамма Сэбина вируса полиомиелита может быть эффективно получен инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита. Следовательно, способ получения комбинированной вакцины, который включает стадию культивирования в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя клеток Vero, которые будут инокулированы штаммом Сэбина вируса полиомиелита (способ получения по настоящему изобретению), является применимым в качестве способа для эффективного получения комбинированных вакцин, содержащих инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой график, показывающий кривые роста клеток Vero при культивировании клеток Vero путем метода микроносителя. Здесь “3L” указывает исходное количество клеток примерно 2×10⁵ клеток/мл (низкая концентрация) и 3 г/л микроносителя. “3H” указывает исходное количество клеток примерно 10×10⁵ клеток/мл (высокая концентрация) и 3 г/л микроносителя. “5L” указывает исходное количество клеток примерно 2×10⁵ клеток/мл (низкая концентрация) и 5 г/л микроносителя. “5H” указывает исходное количество клеток примерно 10×10⁵ клеток/мл (высокая концентрация) и 5 г/л микроносителя.

Фиг.2 представляет собой график, показывающий титр инфективности (титры вируса) вируса полиомиелита типа I, полученный в клетках Vero, культивируемых в различных условиях. Здесь “3L” представляет собой тип I вируса полиомиелита, полученный в клетках Vero, культивируемых из исходного количества клеток примерно 2×10⁵ клеток/мл (низкая концентрация) на 3 г/л микроносителя. “5L” указывает тип I вируса полиомиелита, полученный в клетках Vero, культивируемых из исходного количества клеток примерно 2×10⁵ клеток/мл (низкая концентрация) на 5 г/л микроносителя. “5H” указывает тип I вируса полиомиелита, полученный в клетках Vero, культивируемых из исходного количества клеток примерно 10×10⁵ клеток/мл (высокая концентрация) на 5 г/л микроносителя. “Контр.” указывает тип I вируса полиомиелита, выращенного с использованием клеток почек зеленых макак.

Настоящее изобретение обеспечивает способ получения комбинированной вакцины, содержащей инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита (sIPV) вместе с защитным антигеном B. pertussis, анатоксином дифтерии и анатоксином столбняка (DPT), где такой способ включает стадию получения высокого титра штамма Сэбина вируса полиомиелита.

Изобретение более подробно описано ниже.

1. Инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита

(1) Штамм Сэбина вируса полиомиелита

В настоящем описании “штамм Сэбина вируса полиомиелита” относится к штамму вируса полиомиелита, полученному из ослабленного штамма вируса полиомиелита, выделенного Dr. Albert B. Sabin (см., например, Sabin A.B., Boulger L.R.: “History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains,” J. Biol. Standard 1, 115-118 (1973)).

Штамм Сэбина вируса полиомиелита включает штаммы Сэбина вируса полиомиелита типа I, штаммы Сэбина вируса полиомиелита типа II и штаммы Сэбина вируса полиомиелита типа III. Примеры штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа I включают штаммы LSc и 2ab. Примеры штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа II включают штаммы P712, Ch и 2ab. Примеры штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа III включают штаммы Leon и 12a₁b.

(2) Инактивация

В настоящем описании “инактивация” вируса относится к устранению инфицирующей способности вируса. Способы инактивации включают, но не ограничиваются, физические методы (например, методы, включающие использование рентгеновского излучения, нагревания или ультразвука) и химические методы (например, методы, включающие использование формалина, ртути, спирта или хлора).

Инактивация вируса полиомиелита может быть проведена известным методом (см., например, Biologicals 34, 151-154 (2006)). Например, инактивация может быть проведена обработкой вируса полиомиелита формалином.

(3) Иммуногенность инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита

Два вирусных антигена, известных как D-антигены и C-антигены, обычно присутствуют в смеси с инактивированными штаммами Сэбина вируса полиомиелита. D-антигены представляют собой целые вирусные частицы. Антитела к D-антигенам обладают способностью нейтрализовать инфективность живых вирусов и действуют как защитные антитела. C-антигены, называемые дефектными частицами, представляют собой частицы, не имеющие РНК сердцевинной нуклеиновой кислоты и части вирусных белков целой вирусной частицы; такие частицы являются полыми в центре. Антитела к C-антигенам обладают небольшой или совсем не обладают способностью нейтрализовать инфективность живых вирусов. Следовательно, когда в качестве вакцины должен использоваться инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита, требуются D-антигены.

Существует три типа вирусов полиомиелита: тип I, тип II и тип III. Иммунитет к инфекции вирусом полиомиелита является специфичным к трем типам вирусов - типу I, типу II и типу III; тот перекрестный иммунитет, который может существовать между типами, является минимальным. D-антигены инактивированного типа I, типа II и типа III штаммов Сэбина вируса полиомиелита обладают иммуногенностью, способной к продукции нейтрализующих антител для соответственно типа I, типа II и типа III диких штаммов (высоковирулентных) вируса полиомиелита. Иммуногенность D-антигенов инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита отличается для каждого из типов I, II и III; следовательно, количество D-антигена, требуемое для получения достаточного количества антител для нейтрализации типа I, типа II и типа III диких штаммов (высоковирулентных) вируса полиомиелита, отличается в зависимости от типа вируса.

Как упомянуто выше, существует три типа вируса полиомиелита - тип I, тип II и тип III, каждый из которых вызывает один и тот же полиомиелит. Следовательно, когда инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита используется в качестве вакцины (инактивированная вакцина от полиомиелита), он должен иметь иммуногенность, способную давать достаточно антител для нейтрализации диких штаммов (высоковирулентных штаммов) вируса полиомиелита каждого из типов I, II и III. Более того, желательно для иммуногенности быть близкой к иммуногенности инактивированной вакцины от полиомиелита от высоковирулентных штаммов, которые для нее использовали. Для проявления такой иммуногенности вакцина предпочтительно содержит инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита типа I, типа II и типа III в соотношении по массе соответствующего D-антигена, предпочтительно (2-4):(80-120):(80-120) и наиболее предпочтительно (примерно 3):(примерно 100):(примерно 100). Инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита, используемые в настоящем изобретении, путем включения типов I, II и III в специфическом соотношении, как указано выше, проявляют иммуногенность, сходную с таковой инактивированных вакцин от полиомиелита из высоковирулентных штаммов (например, вакцина Соук).

2. Получение инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита

Инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита, подходящие для применения в настоящем изобретении, могут быть получены способом, описанным ниже.

Во-первых, клетки Vero культивируют в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя, посредством чего получают клетки для культивирования вируса полиомиелита. Полученные культивируемые клетки для вируса полиомиелита инокулируют посевным материалом вируса (штамм Сэбина вируса полиомиелита) и вирусы культивируют, получая штамм Сэбина вируса полиомиелита, который пролиферирует. Полученный штамм Сэбина вируса полиомиелита инактивируют для получения инактивированного штамма Сэбина вируса полиомиелита. Может быть получен инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита, который соответствует использованному посевному материалу вируса (штаммы Сэбина типа I, штаммы Сэбина типа II или штаммы Сэбина типа III). Вирусы могут быть сконцентрированы и/или очищены до или после инактивации вируса.

Как упомянуто выше, инактивированная вакцина от полиомиелита должна быть способна давать достаточно антител для нейтрализации диких штаммов (высоковирулентных штаммов) каждого из типов I, II и III. Однако D-антигены инактивированных вирусов полиомиелита штаммов Сэбина имеют иммуногенность, которая различается между типами I, II и III. Соответственно, инактивированная вакцина от полиомиелита, обладающая иммуногенностью, способной давать достаточно антител для нейтрализации диких штаммов (высоковирулентных штаммов) каждого из типов I, II и III, может быть получена путем регуляции количества содержащихся инактивированных вирусов полиомиелита типа I, типа II и типа III.

Клетки Vero

Клетки Vero представляют собой пассированные клетки почек зеленых макак (Cercopithecus aethiops) и хранятся в American Type Culture Collection (ATCC). Клетки Vero широко используются для культивирования вирусов, так как они имеют фибробластическую морфологию, обладают широкой чувствительностью к различным типам вирусов и легко поддерживаются в качестве пассированных клеток. Клетки Vero, которые известны как доступные от ATCC, включают ATCC № CCL-81 и CRL-1587.

Микроноситель

В настоящем описании “микроноситель” относится к носителю, который имеет поверхности, к которым прикрепляются клетки, и допускает проведение культивирования клеток в суспендированном состоянии в жидкой среде. Микроноситель не является предметом с каким-либо определенным ограничением в отношении материала, формы и размера при условии, что это носитель с поверхностью, к которой прикрепляются клетки, и который допускает культивирование клеток, проводимое в суспендированном состоянии в жидкой среде.

Примеры материала микроносителя включают декстран, желатин, коллаген, полистирол, полиэтилен, полиакриламид, стекло и целлюлозу. В качестве материала микроносителя предпочтительным является декстран.

Примеры формы микроносителя включают сферическую (шарики) и дисковидную формы. Микроноситель предпочтительно имеет сферическую форму.

Сферический микроноситель имеет размер, например, от примерно 0,01 до примерно 1 мм, предпочтительно от примерно 0,05 до примерно 0,5 мм и более предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 0,3 мм.

Микроноситель может быть пористым.

Примеры сферических микроносителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают Cytodex 1 (торговое наименование), Cytodex 3 (торговое наименование) и Cytopore (торговое наименование) (все продукты GE Healthcare Biosciences). Примеры дисковидных микроносителей включают Cytoline 1 (торговое наименование) и Cytoline 2 (торговое наименование) (оба продукта GE Healthcare Biosciences). Примеры пористых микроносителей включают Cytopore (торговое наименование), Cytoline 1 (торговое наименование) и Cytoline 2 (торговое наименование) (все продукты GE Healthcare Biosciences). Микроноситель, используемый в настоящем изобретении, является наиболее предпочтительно сферическим декстрановым микроносителем. Сферическим декстрановым микроносителем является предпочтительно Cytodex 1 (торговое наименование), Cytodex 3 (торговое наименование) или Cytopore (торговое наименование), более предпочтительно Cytodex 1 (торговое наименование) или Cytodex 3 (торговое наименование) и наиболее предпочтительно Cytodex 1 (торговое наименование).

Культивирование клеток Vero

В настоящем изобретении клетки Vero выращивают культивированием в присутствии от примерно 4 г/л до примерно 6 г/л микроносителя. Концентрация микроносителя составляет предпочтительно от примерно 4,5 г/л до примерно 5,5 г/л и более предпочтительно примерно 5 г/л.

Вышеописанную стадию выращивания клеток Vero проводят в масштабе в отношении жидкого объема предпочтительно по меньшей мере 3 литра, более предпочтительно по меньшей мере 30 литров и наиболее предпочтительно по меньшей мере 150 литров. Стадию выращивания клеток Vero проводят в масштабе не более 1000 литров.

Когда клетки Vero культивируют в присутствии микроносителя, используемой культуральной средой может быть, например, среда ME(Science, 122, 501 (1952)), среда DME (Virology, 8, 396 (1959)), среда RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)) или среда 199 (Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)), которые содержат от примерно 5 до примерно 20 об.% сыворотки телят или бычьей эмбриональной сыворотки. Культуральной средой предпочтительно является среда DME, более предпочтительно среда DME, содержащая сыворотку телят, и наиболее предпочтительно среда DME, содержащая примерно 5 об.% сыворотки телят. Среду можно, при необходимости, менять в течение периода культивирования клеток. pH составляет предпочтительно от примерно 6 до примерно 8, более предпочтительно от примерно 6,5 до примерно 7,5 и наиболее предпочтительно примерно 7. Культивирование обычно проводят при температуре от примерно 35ºC до примерно 40ºC в течение периода от примерно 5 до 9 дней. Если необходимо, во время культивирования могут проводиться аэрация и перемешивание. Концентрация растворенного кислорода (DO) во время культивирования клеток составляет предпочтительно от примерно 60 до примерно 90%, более предпочтительно от примерно 70 до примерно 80% и наиболее предпочтительно примерно 75%.

Количество клеток Vero в среде в начале культивирования в присутствии микроносителя (исходное количество клеток) может быть установлено, как необходимо относительно таких факторов, как тип среды, тип микроносителя, масштаб культивирования. Исходное количество клеток составляет предпочтительно от 2×10⁴ клеток/мл до 10×10⁵ клеток/мл и наиболее предпочтительно от 2×10⁵ клеток/мл до 10×10⁵ клеток/мл.

Культивирование вируса полиомиелита

Культивирование вируса полиомиелита может проводиться путем инокуляции культивированных клеток Vero штаммом Сэбина вируса полиомиелита (посевной материал вируса) и культивирования вируса полиомиелита в клетках. Культивирование инфицированных клеток может проводиться таким же образом, как вышеописанное культивирование клеток Vero. Средой, используемой для культивирования вируса полиомиелита, является предпочтительно среда 199, более предпочтительно среда 199, содержащая бикарбонат натрия, и наиболее предпочтительно среда 199, содержащая 0,3% масс./об. карбоната натрия.

Температура инкубации во время культивирования вируса составляет предпочтительно от примерно 30ºC до примерно 38ºC, более предпочтительно от примерно 32ºC до примерно 36ºC и наиболее предпочтительно от примерно 33ºC до примерно 35ºC. Период культивирования вируса составляет предпочтительно от примерно 1 до примерно 5 дней, более предпочтительно от примерно 2 до примерно 4 дней и наиболее предпочтительно примерно 3 дня. Культивирование вируса может быть закончено с использованием цитопатических эффектов вируса полиомиелита (округление клеток, инфицированных вирусом полиомиелита, и отделение клеток от микроносителя) в качестве индикатора.

Штамм Сэбина вируса полиомиелита, который культивируют с использованием первично культивированных клеток почек зеленой макаки, может быть использован в качестве посевного материала вируса.

Восстановление вирусной жидкости, содержащей вирус полиомиелита

После завершения культивирования вируса микроноситель удаляют и вирусную жидкость, содержащую вирус полиомиелита (иногда называемую в настоящем описании как “жидкость вируса полиомиелита”), восстанавливают.

Удаление микроносителя может проводиться посредством, например, тефлонового сита (например, имеющего размер пор 120 мкм). Так как вирус полиомиелита остается присутствующим (прикрепленным) на микроносителе, оставшемся на сите, такой оставшийся вирус полиомиелита может быть восстановлен путем промывки с помощью, например, среды культивирования вируса.

Полученная жидкость вируса полиомиелита может быть отфильтрована с использованием фильтровальной мембраны (например, фильтровальной мембраны 0,2 мкм) или подобного для удаления обломков клеток.

Жидкость вируса полиомиелита может быть сконцентрирована и и/или очищена до или после инактивации.

Иллюстративные примеры способа концентрирования включают ультрафильтрацию, ультрацентрифугирование и диализ. Способом концентрирования является предпочтительно ультрафильтрация или ультрацентрифугирование. Более предпочтительно проводить и ультрафильтрацию, и ультрацентрифугирование и еще более предпочтительно проводить ультрафильтрацию с последующим ультрацентрифугированием.

Мембраной, используемой в ультрафильтрации, может быть мембрана для ультрафильтрации, используемая для концентрирования вирусов. Мембрана для ультрафильтрации имеет отсечку молекулярной массы, которая составляет предпочтительно примерно 100 кДа. Мембрана для ультрафильтрации является предпочтительно сделанной из материала, такого как полиэфирсульфон.

Концентрирование вируса полиомиелита путем ультрацентрифугирования может проводиться путем подвергания жидкости вируса полиомиелита 4 часам центрифугирования при 4ºC и 100000 g для получения осадка. Осадок может быть ресуспендирован в, например, фосфатном буфере. Также возможно размолоть массу агрегированных вирусов путем обработки ресуспензии осадка ультразвуком. Обработка ультразвуком может проводиться с использованием коммерчески доступного прибора, такого как Insonator модель 200 M (Kubota). Условия обработки ультразвуком должны быть достаточными для разрушения массы агрегированных вирусов и могут быть выбраны, как необходимо для таких факторов, как сосуд, используемый при обработке ультразвуком, мощность ультразвука и концентрация ресуспензии. Условия обработки ультразвуком проиллюстрированы путем обработки при 200 Вт в течение периода от примерно 3 до 10 минут. Даже когда проводят такую обработку ультразвуком, штамм Сэбина вируса полиомиелита не теряет своей иммуногенности, что позволяет использовать его преимущественно в качестве вакцины вируса полиомиелита.

Методы очистки включают, но не ограничиваются, методы, которые используют физические характеристики очищаемого вещества, такие как размер, плотность и коэффициент осаждения, и методы, которые используют химические или физико-химические реакции (например, абсорбцию-десорбцию). Иллюстративные примеры методов очистки включают центрифугирование по градиенту плотности, фильтрацию (включая ультрафильтрацию), ионообменную колоночную хроматографию, аффинную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию и высаливание. Методом очистки является предпочтительно колоночная хроматография, более предпочтительно ионообменная колоночная хроматография и наиболее предпочтительно DEAE-ионообменная колоночная хроматография. Количество раз очистки, осуществляемой колоночной хроматографией, не является предметом какого-либо определенного ограничения. А именно, очистка колоночной хроматографией может проводиться повторно до достижения требуемой чистоты. Однако с точки зрения эффективности продукции и других вопросов предпочтительно проводить такую очистку в несколько стадий, если возможно.

Концентрирование и очистку предпочтительно проводят путем преобразования жидкости вируса полиомиелита в осадок с помощью ультрацентрифугирования, обработки ультразвуком ресуспензии полученного осадка, затем очистки колоночной хроматографией. Кроме того, с точки зрения эффективной продукции предпочтительно проводить очистку колоночной хроматографией только один раз. Путем осуществления преобразования жидкости вируса полиомиелита в осадок с помощью ультрацентрифугирования, обработки ультразвуком ресуспензии осадка и очистки колоночной хроматографией только один раз жидкость вируса полиомиелита может быть эффективно и адекватно сконцентрирована и очищена.

Инактивация вируса полиомиелита

Инактивация вируса полиомиелита может быть проведена обычно используемым методом. Специфически вирус полиомиелита может быть инактивирован путем добавления к жидкости вируса полиомиелита инактиватора, таким образом вызывая реакцию между вирусом полиомиелита и инактиватором. Инактиватором предпочтительно является формалин. Условия инактивации не являются предметом какого-либо определенного ограничения до тех пор, пока вирус полиомиелита инактивируется. Во избежание остаточного наличия недостаточно инактивированного вируса полиомиелита период инактивационной обработки составляет обычно от примерно 2 до примерно 4 раз, предпочтительно от примерно 2,5 до примерно 3,5 раз и более предпочтительно примерно 3 раза, больше продолжительности периода, в течение которого подтверждается инактивация вируса полиомиелита.

Например, когда в качестве инактиватора используют формалин, добавляемое количество составляет предпочтительно от примерно 0,001 до примерно 0,1% масс./об., более предпочтительно от примерно 0,005 до примерно 0,05% масс./об. и наиболее предпочтительно примерно 0,01% масс./об. Температура инактивации составляет наиболее предпочтительно примерно 37ºC. Период инактивации может также варьироваться в зависимости от типа инактиватора, концентрации инактиватора и температуры инактивации. Например, когда в качестве инактиватора используется примерно 0,01% масс./об. формалина и температура инактивации составляет примерно 37ºC, период инактивации составляет предпочтительно от примерно 8 до примерно 16 дней, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 14 дней и наиболее предпочтительно примерно 12 дней. Когда используют примерно 0,01% масс./об. формалина и температура инактивации составляет примерно 37ºC, штамм Сэбина вируса полиомиелита обычно инактивируется в течение 4 дней.

3. Анатоксин дифтерии, защитный антиген B. pertussis и анатоксин столбняка (DPT)

Защитный антиген B. pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка, используемые в настоящем изобретении, не являются предметом какого-либо определенного ограничения.

Защитный антиген B. pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка являются коммерчески доступными в виде комбинированных вакцин от дифтерии-коклюша-столбняка (таких, как производимые Takeda Chemical Industries, Ltd., the Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University (Biken), и the Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute (Kaketsuken)). Альтернативно, защитный антиген B. pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка могут быть получены известными способами. Специфически защитный антиген B. pertussis может быть получен путем, например, экстракции, выделения и очистки иммунной антигенной фракции из культуральной среды штаммов B. pertussis фазы I (Tohama штамм) с использованием физико-химического метода, такого как фракционирование в сульфате аммония/центрифужное фракционирование по градиенту плотности в сахарозе, затем снижение оставшейся вирулентности формалином. Анатоксин дифтерии может быть получен, например, очисткой и концентрированием токсина, продуцируемого Corynebacterium diphtheriae (штамм Park-Williams № 8) с использованием физико-химического метода, такого как колоночная хроматография, с последующей детоксикацией формалином. Анатоксин столбняка может быть получен, например, очисткой и концентрированием токсина, продуцируемого Clostridium tetani (штамм Harvard) с использованием физико-химического метода, такого как колоночная хроматография, с последующей детоксикацией формалином.

Защитный антиген B. pertussis содержит токсин коклюша (PT антиген), нитеобразный гемагглютинин (FHA антиген), белок наружной мембраны (69 кДа антиген) и фимбрии (также называемые FB антиген, агглютиноген (FGG)). Защитный антиген B. pertussis не должен обязательно содержать каждый из вышеуказанных антигенов, пока он содержит по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два и более предпочтительно по меньшей мере три из этих антигенов. Антитела для этих защитных антигенов защищают организм-хозяина от коклюша.

4. Комбинированная вакцина

Комбинированная вакцина по настоящему изобретению содержит инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита, защитный антиген B. pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка. Как упомянуто выше, защитный антиген B. pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка являются доступными коммерчески в виде комбинированной вакцины от дифтерии-столбняка-коклюша. Следовательно, комбинированная вакцина по настоящему изобретению также может быть получена путем смешивания инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита вместе с комбинированной вакциной от дифтерии-столбняка-коклюша.

Инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита могут быть получены путем смешивания инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа I, инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа II и инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типа III. Как упомянуто выше, инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита содержат тип I, тип II и тип III инактивированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита в соотношении на основании количества их соответствующих D-антигенов предпочтительно (2-4):(80-120):(80-120) и наиболее предпочтительно (примерно 3):(примерно 100):(примерно 100).

Защитный антиген B. pertussis, анатоксин дифтерии и анатоксин столбняка могут включаться в комбинированную вакцину по изобретению в любых количествах, которые эффективны для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка. Специфически такие соответствующие количества могут быть такими же, как соответствующие количества в вышеупомянутых коммерчески доступных комбинированных вакцинах от дифтерии-столбняка-коклюша. В случае когда на иммуногенность защитного антигена B. pertussis, анатоксина дифтерии и/или анатоксина столбняка влияет инактивированный штамм Сэбина вируса полиомиелита и другие ингредиенты, комбинированная вакцина, эффективная для профилактики каждой из целевых болезней, может быть получена путем подходящей регуляции соответствующего содержания.

Комбинированная вакцина по изобретению может быть получена и использована обычными средствами. Специфически производство и применение могут проводиться, как описано выше.

Комбинированная вакцина по изобретению может быть получена в виде инъекции обычным способом. Такую инъекцию получают в соответствии со способом, который сам по себе известен в области техники, таким как растворение, суспендирование или эмульгирование вышеуказанных веществ в стерильной водной или масляной жидкости, обычно используемой в инъекциях. Примеры водных жидкостей для инъекций, которые могут быть использованы, включают физиологический раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу или некоторые другие добавки. Инъекционным раствором, который получают, обычно заполняют подходящие ампулы или шприцы.

Комбинированная вакцина по изобретению также может необязательно включать фармацевтические добавки, такие как консерванты, антиоксиданты и комплексообразующие вещества. Иллюстративные примеры консервантов включают тимеросал и 2-феноксиэтанол. Иллюстративные примеры комплексообразующих веществ включают этилендиаминтетрауксусную кислоту и гликолевый эфир диаминтетрауксусной кислоты.

Комбинированная вакцина по изобретению может дополнительно содержать добавки. Иллюстративные примеры добавок включают гидроксид алюминия, фосфат алюминия и хлорид алюминия.

В добавление к инактивированному штамму Сэбина вируса полиомиелита, защитному антигену B. pertussis, анатоксину дифтерии и анатоксину столбняка, комбинированная вакцина по изобретению также может включать другие иммуногенные ингредиенты. Иллюстративные примеры таких иммуногенных ингредиентов включают иммуногенные ингредиенты для вирусов или бактерий, иных, чем вирус полиомиелита, B. pertussis, C. diphtheriae и C. tetani. Примеры таких иммуногенных ингредиентов включают анатоксины, ослабленные вирусы, инактивированные вирусы, белки, пептиды, полисахариды, липополисахариды, липопептиды и их комбинации. Примеры вирусов и бактерий, иных, чем вирус полиомиелита, B. pertussis, C. diphtheriae и C. tetani включают вирусы гриппа, вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус краснухи, вирус герпеса, вирус оспы, вирус бешенства, вирус человеческого иммунодефицита, вирус гепатита, Diplococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, бацилла брюшного тифа и Haemophilus influenzae тип b.

Комбинированная вакцина по настоящему изобретению может вводиться парентерально, например путем подкожной инъекции или внутримышечной инъекции и предпочтительно путем подкожной инъекции.

Количество разовой дозы комбинированной вакцины по изобретению может быть выбрано особым образом в соответствии с различными условиями, такими как возраст и масса тела предполагаемого вакцинируемого. Специфически разовая доза может содержать, например, по меньшей мере 4 международные единицы защитного анти