Гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые средства тритерпеновой природы

Гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противоопухолевые средства тритерпеновой природы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к новому ряду химических соединений, а именно к гидрированной бетулоновой кислоте формулы (1) и ее амидам формулы (2-8):

которые могут быть использованы в медицине в качестве лекарственных средств, обладающих противоопухолевым действием.

Современные схемы лечения различного типа злокачественных опухолей используют хирургические методы в комплексе в высокодозной агрессивной терапией, серьезным недостатком которой является высокая токсичность современных противоопухолевых препаратов в отношении жизненно-важных органов и систем организма. Сопутствующие побочные эффекты снижают эффективность, а в ряде случаев ограничивают применение противоопухолевых средств. Другой проблемой в лечении онкологических заболеваний является проблема остаточного опухолевого клона. Опухолевые клетки, пережившие химиотерапию, обычно проявляют лекарственную устойчивость к широкому кругу препаратов и вызывают рецидив заболевания в более тяжелой форме. В связи с этим актуальной задачей является поиск новых противоопухолевых препаратов, обеспечивающих высокую избирательность и эффективность лечения.

Важным направлением медицинской химии, позволяющим получать новые, эффективные противоопухолевые препараты, является использование синтетических трансформаций растительных метаболитов. Наиболее приемлемым считается исследование растительных метаболитов, о биологической активности которых имеются достоверные сведения и которые являются доступными в настоящее время или станут доступными в ближайшем будущем по мере формирования сырьевой базы. К данному классу соединений относятся тритерпеновые кислоты, широкий спектр биологической активности которых (противовоспалительная, противовирусная, противоопухолевая, иммуностимулирующая и т.д.) приковывает к ним пристальный интерес исследователей.

Задачей изобретения является создание новых эффективных, низкотоксичных лекарственных средств, обладающих противоопухолевым действием и получаемых из доступного растительного сырья.

Поставленная задача решается новыми соединениями тритерпеновой природы, а именно гидрированной бетулоновой кислотой формулы (1) и ее амидами формулы (2-8), которые могут использоваться в качестве противоопухолевых средств.

Из литературных источников известно, что производные тритерпенов, в частности, лупанового ряда перспективны как противовирусные и противоопухолевые препараты [Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. // Биоорган. химия, 2006, 32, 291-307]. На примере производных бетулиновой кислоты показана связь структуры и противоопухолевой активности в отношении широкого спектра раковых клеток (IС₅₀ 10^-6-10^-9 М) [Mukherjee R., Kumar V., Srivastava S.K, Agarwal S.K., Burman A.C. // Anti-cancer agents in Medicinal Chemistry, 2006, V.6, P.271-279]. В этой же работе есть примеры того, что гидрированные аналоги зачастую показывают большую активность по сравнению с обычными производными бетулиновой кислоты. Анти-ВИЧ активность 3-O-глутарилдигидробетулина увеличивается минимум на три порядка при переходе от обычного производного бетулина [Kashiwada Y., Sekiya M., Ikeshiro Y., Fujioka Т., Kilgore N.R., Wild C.T., Allaway G.P., Lee K.-H. // Bioorgan. Med. Chem. Lett., 2004, 14, P.5851-5853]. Производные бетулоновой кислоты, содержащие фрагменты ω-аминокислот, являются активными индукторами апоптоза в лейкозных клетках и клетках гепатокарциномы in vitro [Шинтяпина А.Б., Шульц Э.Э., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Толстиков Г.А., Пронкина Н.В., Кожевников B.C., Покровский А.Г. // Биоорган. химия, 2007, 33, 624]. Важной чертой амидов бетулоновой кислоты является то, что амид, например, содержащий фрагмент β-аланина, проявляет антиоксидантную активность и обладает способностью снижать органотоксическое действие противоопухолевых препаратов [Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. // Докл. АН, 2004, 399, с.274]. Обстоятельством, повышающим привлекательность тритерпенов, является их широкое распространение в природе и во многих случаях относительная простота технологии получения из многотоннажного растительного сырья.

Одним из соединений тритерпеновой природы с ярко выраженными физиологическими свойствами является дигидробетулоновая кислота формулы (1), которая получается окислением дигидробетулина формулы (9). Дигидробетулин формулы (9) получается гидрированием бетулина формулы (10) - широкодоступным сырьем, выделяемым из внешней коры березы семейства Betula [Krasutsky P.A. // Nat. prod. rep., 2006, 23, Р.919-942].

Для достижения поставленной цели мы провели ряд химических модификаций, представленных на схеме 1, Фиг.22. В качестве исходного соединения был взят бетулин (10), полученный экстракцией коры березы бензолом. Гидрирование бетулина (10) водородом в автоклаве над Ni-Ренея давал дигидробетулин (9), который окисляли раствором Физера. Следующим этапом было получение хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (1), который далее использовался без промедления. Взаимодействие хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (1) с двойным избытком соответствующего амина легко приводило к целевым соединениям формулы (2-8) с противоопухолевой активностью.

ИК-спектры записывали на приборе "VECTOR 22" в KBr. Удельное вращение определяли на спектрометре polAAr 3005, концентрации растворов приведены в г/100 мл. Точки плавления определяли на приборе Termosystem FP 900 фирмы Mettler Toledo и на столике Кофлера S 30 A/G (Германия).

Элементный состав полученных веществ определяли из элементного анализа и из масс-спектров высокого разрешения, записанных на приборе DFS (Double Focusing Sector) фирмы Thermo Electron Corporation.

Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С регистрировали на спектрометрах AV-400 (рабочие частоты 400.13 MHz для 1Н и 100.61 MHz для ¹³С) и DRX-500 (500.13 MHz и 125.76 MHz соответственно) фирмы Bruker для растворов веществ в СDСl₃. В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы растворителя (δ_H 7.24 и δ_C 76.9 м.д). Строение полученных соединений устанавливали на основании анализа спектров ЯМР ¹Н с привлечением спектров двойного резонанса ¹Н-¹Н, а также анализа спектров ЯМР ¹³С с использованием стандартных методик записи спектров в режиме J-модуляции (JMOD), с внерезонансным и селективным подавлением протонов, двумерных спектров гетероядерной ¹³C-¹H корреляции на прямых константах спин-спинового взаимодействия (С-Н COSY, ¹J_C,H 135 Гц) и двумерных и одномерных спектров гетероядерной ¹³С-¹Н корреляции на дальних константах спин-спинового взаимодействия (COLOC, LRJMD, ^2,3J_C,H 10 Гц).

Было исследовано влияние заявляемой гидрированной бетулоновой кислоты формулы (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность клеток карциномных линий человека. Значения CCID гидрированной бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) для различных карциномных линий клеток человека приведены в таблице 1. В качестве препаратов сравнения использовали бетулоновую кислоту (БА) и ее соответствующие амиды (БА1-БА7) (Фиг.23, схема 2 Бетулоновая кислота (БА) и ее производные (БА1-БА7)).

В результате было показано, что заявляемые соединения (1-8) проявляют высокую противоопухолевую активность по отношению ко всем использованным опухолевым клеточным культурам, а именно СЕМ-13, U-937, МТ-4. Показано, что значения ССID₅₀ для соединений (1-8) имеют сходный порядок величины для всех опухолевых клеток и лежат в диапазоне 2.9-69.5 µM. Полученные данные по противоопухолевой активности соединений (1-8) позволяют рассматривать их как перспективные лекарственные агенты. Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение луп-20(29)-ен-3β,28-диола (бетулина, 10)

Измельченную кору березы (344 г) кипятят в бензоле (1.6 л) с обратным холодильником 8 ч, далее горячий раствор декантирют. В оставшуюся кору добавляют еще 1 л бензола, кипятят 1 ч, горячий раствор снова декантирют. Выпавший из бензола осадок отфильтровывают, высушивают и получают 52 г бетулина-сырца. После перекристаллизации в изопропаноле получают 38 г бетулина с т.пл. 260-262°С (лит. т.пл. 258-260°C [Hayek // Phytochem. 1989, 28, P.22.]). Выход бетулина на исходную кору составляет 11%.

Пример 2. Получение лупан-3β,28-диола (дигидробетулина, 9)

Гидрирование бетулина (10) проводят аналогично известной методике [Ruzicka L., Brener М., Rey Е. // Helv. Chim. Acta, 1941, 24, P.515-529]. В 5 л автоклав с мешалкой помещают 132 г бетулина (10), 13.2 г Ni-Ренея и 2.5 л этанола, далее все перемешивают в атмосфере водорода (100 атм) при 180°С в течение 14 ч. Освобождаются от катализатора горячим фильтрованием в диоксане, после отгонки растворителя получают 124 г дигидробетулина (9) (выход - 93%). Т.пл. 282-284°С (из спирта). Лит. т.пл. 278-280°С [Ruzicka L., Brener М., Rey Е. // Helv. Chim. Acta, 1941, 24, Р.515-529].

Пример 3. Получение 3-оксо-лупан-28-овой кислоты (дигидробетулоновой кислоты, 1)

Суспензию 10 г (22.5 ммоля) дигидробетулина (9) в 165 мл ледяной уксусной кислоте и 110 мл ацетона охлаждают при 0°С и в течение 1 ч при перемешивании прибавляют свежеприготовленный раствор Физера (11 г, 0.11 моля хромового ангидрида в 12 мл ледяной уксусной кислоты и 15 мл Н₂О). Выдерживают при комнатной температуре 3 ч. По окончании реакции добавляют 50 мл метанола, прибавляют 300 мл бензола и 300 мл 10% раствора NaCl. Бензольный слой отделяют, а водный экстрагируют 2×150 мл бензола. Объединенные экстракты промывают 3×200 мл 10% раствором NaCl, сушат MgSO₄, осушитель отфильтровывают, бензол отгоняют приблизительно до 100 мл и выливают в 200 мл 5% раствора KОН. Осадок калиевой соли дигидробетулоновой кислоты (1) отфильтровывают и высушивают. Сухую соль растворяют в 50 мл этанола, не растворившуюся часть отфильтровывают, фильтрат выливают в 250 мл 5% раствор НСl. Выделившуюся кислоту (1) отфильтровывают, промывают H₂O, высушивают. В итоге получают 5.5 г (54% от теории) дигидробетулоновой кислоты (1). Точка плавления и спектры ЯМР ¹Н и ¹³С соответствуют литературным [Wahab A., Ottosen M., Bachelor F.W. // Can.J.Chem., 1991, 69, P.570-577].

Пример 4. Получение 3-оксо-лупано-28-ил хлорида (хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты, 1)

К раствору 5.7 г (12.48 ммоля) дигидробетулоновой кислоты (1) в 70 мл безводного СН₂Сl₂ добавляют 2.3 мл (26.36 ммоля) оксалилхлорида и выдерживают при комнатной температуре 4 ч. После отгонки растворителя к остатку прибавляют столько же СН₂Сl₂ и повторно упаривают. Остаток обрабатывают безводным эфиром, осадок отфильтровывают, промывают эфиром, получают 4.6 г хлорангидрида ДГБК с т.пл. 225-232°С (выход - 91%). Хлорангидрид сразу же вводят в дальнейшую реакцию.

Пример 5. Получение амидов гидрированной бетулоновой кислоты (2-8). Общая методика

К раствору 0.5 г (1.05 ммоля) хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (1) в 40 мл сухого CH₂Cl₂ при перемешивании прибавляют 2.2 ммоля соответствующего амина. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре 18-20 ч, затем разбавляют CH₂Cl₂ до 100 мл, промывают 3×20 мл Н₂О, высушивают MgSO₄, осушитель отфильтровывают, растворитель отгоняют. Остаток перекристаллизовывают либо делят колоночной хроматографией на силикагеле фракции 60-200 мкм фирмы Merk. Элюенты приведены для каждого продукта. Данные спектров ЯМР ¹³С для синтезированных амидов дигидробетулоиовой кислоты (2-8) в СDСl₃ (δ, м.д.) приведены в таблице 2.

Примечания: а) для атомов С(2′,6′) наблюдается широкий сигнал при 46.2 м.д., ХС сигнала С(4′) 24.62 м.д.; b) для атомов С(2′,6′) наблюдается широкий сигнал при 45.6 м.д.; с) для атомов С(2′,6′) соединений (4-6) наблюдаются очень широкие сигналы около 45 м.д.; d) для атомов С(2′,6′) соединения (7) и атомов С(2′,7′) соединения (8) сигналы наблюдать не удается; для соединения (7) ХС дублетных сигналов ароматической части следующие: 128.43 С(10′) и 126.94 С(11′) м.д.

Пример 6. Влияние гидрированиой бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность опухолевых клеток Т-клеточного лейкоза человека МТ-4

Клетки линии МТ-4 (клетки Т-клеточного лейкоза человека) культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина), в атмосфере 5%-ного СО₂ при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединениями (1-8) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (100 мкл клеток с концентрацией 500 тыс. клеток/мл). Затем к клеткам добавляли раствор соединений (1-8) в ДМСО до конечной концентрации в среде от 0.1 до 100 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали бетулоновую кислоту (БА) и ее соответствующие амиды (БА1-БА7). Клетки инкубировали в присутствии соединений еще в течение 3-х суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А₅₇₀ - поглощение формазана, а А₆₃₀ - фон клеток.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в отсутствие соединения, но в присутствии растворителя ДМСО.

Данные по обработке лейкозных клеток МТ-4 соединениями (1-8) приведены на Фиг 1-7.

На Фиг.1 показана жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (2) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (2). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА1)

На Фиг.2 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (3) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (3). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА2).

На Фиг.3 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (4) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (4). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА3).

На Фиг.4 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (5) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (5). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА4).

На Фиг.5 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (6) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (6). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА5).

На Фиг.6 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (7) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (7). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА6).

На Фиг.7 - жизнеспособность клеток линии МТ-4 после инкубации с соединением (8) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (8). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА7).

Из данных, приведенных на Фиг.1-7, видно, что обработка лейкозных клеток МТ-4 соединениями (1-8) вызывает их эффективную гибель уже при концентрации соединений 10^-6 М. Значения CCID₅₀ - концентрация соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток, а также CCID₈₀ и CCID₉₀ (концентрации, при которых наблюдается гибель 80 и 90% клеток, соответственно) приведены в таблице 1.

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что соединения (1-8) обладают таким же или более выраженным противоопухолевым эффектом по сравнению с ранее описанными аналогичными производными бетулоновой кислоты (БА1-БА7), за исключением соединения (4), противоопухолевый эффект которого на клетках МТ-4 менее выражен по сравнению с аналогичным производным бетулоновой кислоты.

Пример 7. Влияние гидрированной бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность опухолевых клеток Т-клеточного лейкоза человека СЕМ-13

Клетки линии СЕМ-13 (линия клеток Т-клеточного лейкоза человека) культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина), в атмосфере 5%-ного СО₂ при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединениями (1-8) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (100 мкл клеток с концентрацией 500 тыс. клеток/мл). Затем к клеткам добавляли раствор соединения (1) в ДМСО до конечной концентрации в среде от 0.1 до 100 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали аналогичные производные бетулоновой кислоты (2). Клетки инкубировали в присутствии исследуемых соединений еще в течение 3-х суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А₅₇₀ - поглощение формазана, а А₆₃₀ - фон клеток.

Подсчет значений CCID проводили как описано в примере 5. Значения CCID₅₀ - концентрация соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток, а также CCID₈₀ и CCID₉₀ (концентрации, при которых наблюдается гибель 80 и 90% клеток, соответственно) приведены в таблице 1. Все исследованные соединения (1-8) обладают таким же или более выраженным противоопухолевым эффектом по сравнению с ранее описанными аналогичными производными бетулоновой кислоты (БА1-БА7), за исключением соединения (4), противоопухолевый эффект которого на клетках СЕМ-13 менее выражен по сравнению с аналогичным производным бетулоновой кислоты.

Жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединениями (2-8) иллюстрируется Фиг.8-14.

Фиг.8 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (2) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (2). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА1)

Фиг.9 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (3) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (3). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА2).

Фиг.10 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (4) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (4). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА3).

Фиг.11 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (5) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (5). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА4).

Фиг.12 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (6) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (6). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА5).

Фиг.13 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (7) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (7). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА6).

Фиг.14 - жизнеспособность клеток линии СЕМ-13 после инкубации с соединением (8) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (8). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА7).

Пример 8. Влияние гидрированной бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность опухолевых клеток человека U-937

Клетки линии U-937 (опухолевая линия моноцитов человека) культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина), в атмосфере 5%-ного СО₂ при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединениями (1-8) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (100 мкл клеток с концентрацией 400 тыс. клеток/мл). Затем к клеткам добавляли раствор исследуемых соединений в ДМСО до конечной концентрации в среде от 0.1 до 100 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали бетулоновую кислоту (2). Клетки инкубировали в присутствии соединений еще в течение 3-х суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А₅₇₀ - поглощение формазана, а А₆₃₀ - фон клеток.

Подсчет значений CCID проводили как описано в примере 5. Значения CCID₅₀ - концентрация соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток, а также CCID₈₀ и CCID₉₀ (концентрации, при которых наблюдается гибель 80 и 90% клеток, соответственно) приведены на Фиг.15-22.

Фиг.15 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (2) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (2). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА1).

Фиг.16 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (3) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (3). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА2).

Фиг.17 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (4) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (4). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА3).

Фиг.18 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (5) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (5). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА4).

Фиг.19 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (6) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (6). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА5).

Фиг.20 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (7) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (7). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА6).

Фиг.21 - жизнеспособность клеток линии U-937 после инкубации с соединением (8) в течение 72 ч. Количество живых клеток оценивали с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток, инкубированных в присутствии ДМСО, но без соединения (8). В качестве препарата сравнения использовано аналогичное производное БК (БА7).

Таким образом, соединения (1-8) обладают более выраженным противоопухолевым эффектом в отношении исследованных опухолевых клеток U-937 по сравнению с бетулоновой кислотой и ее аналогичными производными (БА1-БА8), для которой ранее было показано наличие выраженной противоопухолевой активности.

Пример 9. Влияние гидрированной бетулоновой кислоты (1) и ее амидов (2-8) на жизнеспособность опухолевых линий клеток человека

Значения CCID - концентрация соединений (1-8), при которой наблюдается гибель карциномных клеток, - приведены в таблице 1. CCID₅₀ - концентрация соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток, а также CCID₈₀ и CCID₉₀ (концентрации, при которых наблюдается гибель 80 и 90% клеток, соответственно). Таким образом, соединения (1-8) обладают таким же или более выраженным противоопухолевым эффектом в отношении исследованных опухолевых клеток МТ-4, СЕМ-13 и U-937 по сравнению с бетулоновой кислотой и ее аналогичными производными (БА1-БА8), для которой ранее было показано наличие выраженной противоопухолевой активности.

Таблица 1
Гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противопухолевые средства тритерпеновой природы
		CCID50, µМ
Кислота и ее амиды	СЕМ-13	U-937	MT-4
(1)	4.4	3.8	3.5
(2)	17.2	6.0	8.2
(3)	14.3	22.8	2.9	3.8	26.6
(4)	13.0	7.8	33.4
(5)	6.9	6.0	7.2
(6)	12.4	23.5	5.9	7.7	16.8
(7)	26.0	36.2	69.5	10.9	26.0
(8)	10.6	11.9	11.9
		CCID80, µМ
(1)	186.1	87.6	100.7
(2)	101.2	>190	61.1
(3)	121.7	190.2	123.6
(4)	>185.6	>185.6	157.7
(5)	77.8	>180.9	48.8
(6)	>167.7	21.8	115.7
(7)	>144.7	>144.7	118.7
(8)	>185.9	>185.9	66.9
		CCID90, µM
(1)	>219	>219	>219
(2)	175.5	>190	118.4
(3)	>190	>190	>190
(4)	>185.6	>185.6	>185.6
(5)	180.9	>180.9	110.3
(6)	>167.7	>167.7	>167.7
(7)	>144.7	>144.7	>144.7
(8)	>185.9	>185.9	117.1

Таблица 2
Гидрированная бетулоновая кислота и ее амиды как противопухолевые средства тритерпеновой природы
С-атом	амид (2)a	амид (3)b	амид (4)c	амид (5)c	амид (6)c	амид (7)d	амид (8)d
С-1	39.48 т	39.48 т	39.48 т	39.46 т	39.45 т	39.50 т	39.50 т
С-2	33.97 т	33.97 т	33.98 т	33.95 т	33.94 т	34.00 т	33.98 т
С-3	217.92 с	217.83 с	217.91 с	217.85 с	217.82 с	217.97 с	217.91 с
С-4	47.14 с	47.15 с	47.15 с	47.12 с	47.12 с	47.18 с	47.15 с
С-5	54.90 д	54.90 д	54.90 д	54.88 д	54.86 д	54.93 д	54.90 д
С-6	19.49 т	19.48 т	19.49 т	19.47 т	19.45 т	19.52 т	19.51 т
С-7	33.63 т	33.64 т	33.62 т	33.60 т	33.60 т	33.67 т	33.65 т
С-8	40.45 с	40.47 с	40.47 с	40.45 с	40.44 с	40.49 с	40.52 с
С-9	49.83 д	49.78 д	49.80 д	49.79 д	49.76 д	49.83 д	49.88 д
С-10	36.74 с	36.74 с	36.75 с	36.73 с	36.72 с	36.77 с	36.76 с
С-11	21.57 т	21.53 т	21.54 т	21.53 т	21.51 т	21.56 т	21.59 т
С-12	27.02 т	26.99 т	27.01 т	26.99 т	26.95 т	27.03 т	27.04 т
С-13	36.57 д	36.55 д	36.54 д	36.51 д	36.55 д	36.56 д	36.51 д
С-14	41.88 с	41.89 с	41.88 с	41.86 с	41.88 с	41.90 с	41.98 с
С-15	29.73 т	29.65 т	29.65 т	29.61 т	29.63 т	29.65 т	29.80 т
С-16	32.17 т	32.08 т	32.15 т	32.13 т	32.20 т	32.13 т	31.92 т
С-17	54.89 с	54.74 с	54.79 с	54.75 с	54.87 с	54.80 с	55.21 с
С-18	52.21 д	52.02 д	52.06 д	52.04 д	52.06 д	52.07 д	52.50 д
С-19	42.67 д	42.59д	42.60 д	42.59 д	42.58 д	42.66 д	42.76 д
С-20	29.66 д	29.61 д	29.63 д	29.61 д	29.60 д	29.65 д	29.73 д
С-21	23.39 т	23.34 т	23.35 т	23.33 т	23.32 т	23.37 т	23.43 т
С-22	35.98 т	35.91 т	35.97 т	35.95 т	35.99 т	35.96 т	36.23 т
С-23	26.44 к	26.44 к	26.44 к	26.43 к	26.41 к	26.47 к	26.46 к
С-24	20.85 к	20.86 к	20.86 к	20.84 к	20.84 к	20.90 к	20.84 к
С-25	15.77 к	15.77 к	15.78 к	15.76 к	15.75 к	15.80 к	15.80 к
С-26	15.77 к	15.77 к	15.77 к	15.76 к	15.74 к	15.80 к	15.74 к
С-27	14.27 к	14.26 к	14.26 к	14.24 к	14.25 к	14.28 к	14.34 к
С-28	173.27 с	173.69 с	173.50 с	173.41 с	173.85 с	173.47 с	173.88 с
С-29	14.52 к	14.50 к	14,51 к	14.49 к	14.47 к	14.52 к	14.56 к
С-30	22.77 к	22.76 к	22.77 к	22.75 к	22.73 к	22.79 к	22.82 к
С-3′,5′	26.06 т	66.82 т	55.06 т	52.90 т	43.64 т	52.16 т
С-7′			45.76 к	52.08 к	155.34 c	76.12 д
С-8′				11.73 к	61.38 т	142.26 с
С-9′					14.45 к	126.66 д

Гидрированная бетулоновая кислота формулы (1) и ее амиды формулы (2-8) NR₁R₂= обладающие противоопухолевой активностью.