Синтез инсулинотропных пептидов

Синтез инсулинотропных пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам получения инсулинотропных пептидов, прежде всего глюкагонподобного пептида-1 (GLP-1) и его аналогов, с помощью методов твердофазного и жидкофазного синтеза. Настоящее изобретение относится также к пептидным фрагментам, представляющим собой промежуточные продукты, которые можно применять в указанных способах.

В литературе описаны многочисленные методы пептидного синтеза (см., например, US 6015881; Mergler и др., Tetrahedron Letters 29, 1988, cc.4005-4008; Mergler и др., Tetrahedron Letters 29, 1988, cc.4009-4012; Peptides, Chemistry and Biology, под ред. Kamber и др., изд-во ESCOM, Leiden, 1992, cc.525-526; Riniker и др., Tetrahedron Letters 49, 1993, cc.9307-9320; Lloyd-Williams и др., Tetrahedron Letters 49, 1993, cc.11065-11133, и Andersson и др., Biopolymers 55, 2000, cc.227-250). Различные методы синтеза отличаются физическим состоянием фазы, в которой протекает синтез, а именно тем, представляет ли она собой жидкую фазу или твердую фазу.

При твердофазном пептидном синтезе (SPPS) аминокислоту или пептидную группу связывают с твердой подложкой, представляющей собой смолу. Затем к связанному с подложкой пептиду присоединяют следующие аминокислоты или пептидные группы до получения представляющего интерес пептидного продукта. После этого связанный с подложкой пептид, как правило, отщепляют от подложки и подвергают дополнительному процессированию и/или очистке. В некоторых случаях твердофазный синтез позволяет получать зрелый пептидный продукт; в других случаях пептид, отщепленный от подложки (т.е. пептидный фрагмент, представляющий собой промежуточный продукт («пептидный промежуточный фрагмент»)) применяют для получения более крупного зрелого пептидного продукта.

Пептидные промежуточные фрагменты, полученные в результате твердофазных процессов, можно соединять друг с другом методом твердофазного синтеза или синтеза в растворе (далее в контексте настоящего описания обозначен как «жидкофазный синтез»). Жидкофазный синтез наиболее целесообразно применять в случаях, когда синтез требуемого зрелого пептида на твердой фазе либо невозможен, либо его трудно осуществить на практике. Например, при твердофазном синтезе более длинные пептиды могут случайно принимать неправильную конформацию, оставаясь при этом связанными с твердой подложкой, что затрудняет присоединение дополнительных аминокислот или пептидного продукта к удлиняющейся цепи. По мере удлинения пептидой цепи на смоле, представляющей собой подложку, эффективность стадий процесса, таких как сочетание и удаление защитных групп, может снижаться. Это в свою очередь может приводить помимо возрастающей потери исходных продуктов, таких как способные к активации аминокислоты, кореагенты и растворители, к удлинению времени процессирования для компенсации указанных проблем. Указанные проблемы могут возрастать по мере удлинения пептида.

Таким образом, довольно трудно найти зрелые пептиды, состоящие более чем из 30 аминокислот, синтезированные в виде одного фрагмента с использованием только метода твердофазного синтеза. Вместо этого на твердой фазе можно синтезировать по отдельности индивидуальные фрагменты, а затем осуществлять их сочетание с помощью твердофазного и/или жидкофазного синтеза с получением требуемого пептидного продукта. При использовании этого подхода требуется тщательный выбор фрагментов-кандидатов. Хотя при выборе фрагментов можно пользоваться некоторыми общими принципами, довольно часто требуется эмпирическая оценка фрагментов-кандидатов. Стратегии выбора фрагментов, которые работают в одних условиях, могут не работать в других. Даже когда выявлены приемлемые фрагменты-кандидаты, могут еще потребоваться инновации процесса для выбора стратегии синтеза, которая может работать в приемлемых с позиций стоимости условиях. Таким образом, пептидный синтез, основанный на использовании гибридных схем, часто вызывает вопросы и во многих случаях трудно предсказать, какие проблемы связаны с конкретной схемой синтеза, до фактического осуществления синтеза.

При сочетании в жидкой фазе два пептидных промежуточных фрагмента или пептидный промежуточных фрагмент и реактивную аминокислоту связывают в соответствующем растворителе, как правило, в присутствии дополнительных реагентов, которые повышают эффективность и качество реакции сочетания. Пептидные промежуточные фрагменты в процессе реакции располагаются таким образом, что N-конец одного фрагмента оказывается связанным с C-концом другого фрагмента или наоборот. Кроме того, защитные группы боковых цепей, которые присутствуют при твердофазном синтезе, как правило, сохраняют на фрагментах при сочетании в жидкой фазе для гарантии специфической реактивности концов фрагментов. Эти защитные группы боковых цепей, как правило, не удаляют до поучения зрелого пептида.

Небольшие усовершенствования одной или нескольких стадий в общей схеме синтеза могут приводить к существенным улучшениям получения зрелого пептида. Такие улучшения могут приводить к существенному общему снижению времени получения и потребления реагентов, а также могут существенно повышать чистоту и выход конечного продукта.

Хотя обсуждение важности усовершенствований гибридного синтеза можно проводить для любого типа пептида, получаемого с помощью указанных процедур, это особенно важно в контексте пептидов, которые находят терапевтическое применение и которые производятся в количестве, пригодном для коммерческого применения в медицине. Синтез более крупных биомолекулярных фармацевтических агентов, таких как терапевтические пептиды, может быть очень дорогостоящим. Вследствие значительной стоимости реагентов, продолжительности синтеза, наличия большого количества стадий синтеза, а также других факторов очень незначительные усовершенствования процесса синтеза этих крупных биомолекулярных фармацевтических агентов могут оказать существенное влияние даже на то, будет ли экономически возможно производить такое фармацевтическое средство. Указанные усовершенствования необходимы из-за высокой стоимости производства более крупных биомолекулярных фармацевтических агентов, потребность в которых подтверждается тем фактом, что во многих случаях существует немного, если они вообще существуют, приемлемых терапевтических альтернатив указанным типам более крупных биомолекулярных фармацевтических агентов.

Это, очевидно, имеет место в случае глюкагонподобного пептида-1 (GLP-1) и его аналогов. Указанные пептиды предложены в качестве возможных терапевтических агентов для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета типа 2, а также родственных метаболических нарушений, таких как ожирение (Gutniak М.K. и др., Diabetes Care, 17, 1994, cc.1039-1044).

Lopez с соавторами и установили, что нативный GLP-1 состоит из 37 аминокислотных остатков (Lopez L.С. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1983, cc.5485-5489). Эти данные были подтверждены исследованиями Uttenthal L.O. и др., J. Clin. Endocrinal. Metabol., 61, 1985, cc.472-479. Нативный GLP-1 можно обозначать как GLP-1(1-37). Это обозначение указывает на то, что в пептид входят все аминокислоты, начиная с 1 (N-конец) до 37 (С-конец). Нативный GLP-1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO.1:

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG.

Установлено, что нативный GLP-1 (1-37), как правило, не может опосредовать биосинтез инсулина, но биологически важные фрагменты этого пептида обладают инсулинотропными свойствами. Например, нативный состоящий из 31 аминокислоты пептид GLP-1(7-37), последовательность которого представлена в SEQ ID NO.2:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG,

является инсулинотропным и состоит из аминокислот, начиная с положения 7 (N-конец) до положения 37 (C-конец) нативного GLP-1. GLP-1(7-37) имеет концевой остаток глицина. Когда этот остаток глицина отсутствует, то образовавшийся пептид все еще обладает инсулинотропной активностью, и его обозначают как GLP-1(7-36), его последовательность представлена в SEQ ID NO.3:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR.

В GLP-1 (7-36) часто C-концевой остаток аргинина находится в амидированной форме, и эту форму можно обозначать как GLP-1(7-36)-NH₂.

GLP-1(1-37), как правило, превращается in vivo в свой обладающий инсулинотропной активностью аналог. Например, GLP-1(1-3 7) в естественных условиях превращается в GLP-1(7-37) in vivo. Этот пептид в свою очередь может также подвергаться дополнительному процессингу в результате протеолитического удаления C-концевого остатка глицина с образованием GLP-1(7-36), который часто существует в амидированной форме, т.е. GLP-1(7-36)-NH₂. Таким образом, терапевтические применения могут включать введение GLP-1(1-37) или его аналога с расчетом на то, что обладающее инсулинотропной активностью производное образуется in vivo. Однако более часто в проходящих исследование терапевтических применениях используют введение самих обладающих инсулинотропной активностью фрагментов GLP-1.

Согласно US 6887849 инсулинотропная активность GLP-1(7-37), GLP-1(7-36) и GLP-1(7-36)-NH₂, вероятно, является специфической в отношении панкреатических бета-клеток, в который эти пептиды, по-видимому, индуцируют биосинтез инсулина. Это делает указанные пептиды и их фармацевтически приемлемые аналоги пригодными для изучения патогенеза начинающегося во взрослом возрасте сахарного диабета, т.е. состояния, которое характеризуется гипергликемией, при которой динамика секреции инсулина является аномальной. Кроме того, указанные глюкагонподобные пептиды можно применять для терапии и лечения этого заболевания и для терапии и лечения гипергликемии. Согласно ЕР 1137667 В1 указанные пептиды или их фармацевтически приемлемые аналоги можно применять для лечения других типов диабета, ожирения, глюкагоном, секреторных нарушений дыхательных путей, метаболического нарушения, артрита, остеопороза, заболевания центральной нервной системы, рестеноза, нейродегенеративного заболевания, почечной недостаточности, застойной сердечной недостаточности, нефротического синдрома, цирроза, отека легких, гипертензии и/или нарушений, при которых желательно снижение потребления пищи.

Нативный GLP-1(1-37) и его нативные обладающие инсулинотропной активностью аналоги, последовательности которых представлены в SEQ ID NO.1-3, являются метаболически нестабильными, имеют время полужизни в плазме, составляющее только 1-2 мин in vivo. Экзогенно введенный GLP-1 также быстро расщепляется. Эта метаболическая нестабильность ограничивает терапевтический потенциал нативного GLP-1 и его нативных фрагментов.

Созданы синтетические аналоги GLP-1-пептидов с улучшенной стабильностью. Например, в ЕР 1137667 В1 описан пептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO.4:

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR.

Этот пептид является аналогом нативного GLP-1(7-36), за исключением того, что ахиральный остаток альфа-аминоизомасляной кислоты (сокращенно обозначен на схеме как Aib) присутствует в положениях 8 и 35 вместо соответствующих встречающихся в естественных условиях аминокислот в указанных положениях. Ахиральная альфа-аминоизомасляная кислота известна также под названием метилаланин. Указанный пептид можно обозначать формулой (Aib^8,35)GLP-1(7-36)-NH₂.

В ЕР 1137667 указано, что пептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO.4, и его аналоги можно получать в виде индивидуального фрагмента с помощью твердофазного синтеза. Предложенный в ЕР 1137667 подход, предусматривающий синтез индивидуального фрагмента, является проблематичным. С одной стороны, этот подход может приводить к высоким уровням эпимеризации при сочетании конечной аминокислоты, например гистидина, в случае, например, (Aib^8,35) GLP-1(7-36). Кроме того, может оказаться сложным удалять примеси в процессе хроматографической очистки, и выход может иметь тенденцию к значительному снижению. Следовательно, существует потребность в усовершенствованных стратегиях синтеза пептидов, последовательность которых представлена в SEQ ID NO.4, с целью получения возможности осуществлять производство этого пептида и его аналогов с приемлемыми с коммерческой точки зрения выходом, чистотой и в приемлемом количестве.

Помимо этих соображений большое влияние на возможность применения конкретной схемы синтеза пептидов могут оказывать показатели, связанные с выходом продукта и чистотой продукта при крупномасштабном производстве пептидов, а также с обработкой реагентов, хранением и распределением. Таким образом, продолжает сохраняться потребность в методах пептидного синтеза, обеспечивающих эффективное получение пептидных продуктов, представляющих коммерческий интерес, в виде крупных партий с повышенным выходом.

Настоящее изобретение относится к получению инсулинотропных пептидов, которые синтезируют с использованием подхода, основанного на применении твердофазного и жидкофазного («гибридного») синтеза. В целом, указанный подход предусматривает синтез трех различных пептидных промежуточных фрагментов с помощью твердофазной химии. Затем используют жидкофазную химию для добавления дополнительного аминокислотного продукта к одному из фрагментов. После этого осуществляют сочетание фрагментов друг с другом с использованием твердой и жидкой фаз. Применение псевдопролина в одном из фрагментов облегчает твердофазный синтез этого фрагмента и облегчает также последующее сочетание этого фрагмента с другими фрагментами в жидкой фазе.

Настоящее изобретение можно применять, прежде всего, для получения инсулинотропных пептидов, таких как GLP-1, GLP-1(7-36) и их встречающиеся в естественных условиях и не встречающиеся в естественных условиях аналогов, в частности GLP-1(7-36) и его встречающихся в естественных условиях и не встречающихся в естественных условиях аналогов.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения инсулинотропного пептида, заключающийся в том, что:

а) получают пептидный фрагмент, который включает аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰ (SEQ ID NO. 6), в которой X⁸ и X¹⁰ каждый обозначает остатки ахиральной аминокислоты, или фрагмент, являющийся его аналогом, который включает остатки Х⁸ и Х¹⁰, где Н, Е, Х⁸ и Х¹⁰ каждый необязательно несет защитную группу боковой цепи, и

б) встраивают пептидный фрагмент в инсулинотропный пептид.

X⁸ обозначает аминокислотный остаток, предпочтительно соответствующий метилаланину (Aib). X¹⁰ обозначает аминокислотный остаток, предпочтительно соответствующий глицину.

Следующим объектом изобретения является пептидный фрагмент, который имеет аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰ (SEQ ID NO.6), в которой X⁸ и X¹⁰ каждый обозначает остаток ахиральной аминокислоты, H, Е, X⁸ и X¹⁰ каждый необязательно несет защитную группу боковой цепи. Предпочтительно X⁸ обозначает аминокислотный остаток, соответствующий Aib, a X¹⁰ обозначает аминокислотный остаток, соответствующий глицину.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения инсулинотропного пептида, заключающийся в том, что:

а) получают пептидный фрагмент или его аналог, включающие аминокислотную последовательность TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ. ID No.8), в которой остаток, обозначенный символом X^17-18, представляет собой остаток псевдопролина, и

б) встраивают пептидный фрагмент в инсулинотропный пептид.

Еще одним объектом настоящего изобретения является пептид или его аналог, включающие аминокислотную последовательность TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ. ID No. 8), в которой остаток, обозначенный символом X^17-18, представляет собой остаток псевдопролина, где указанные аминокислотные остатки необязательно несут защитную группу боковой цепи.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения инсулинотропного пептида по п.1 формулы изобретения, заключающийся в том, что:

а) осуществляют сочетание первого пептидного фрагмента, включающего аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰ (SEQ ID NO.6), в которой X⁸ и X¹⁰ каждый обозначает остатки ахиральной аминокислоты, Н и Е каждый необязательно несет защитную группу боковой цепи, со вторым пептидным фрагментом, включающим аминокислотную последовательность TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ ID NO.8), в которой остаток, обозначенный символом X^17-18, представляет собой дипептидный остаток псевдопролина, где указанные остатки аминокислотной последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи, с получением третьего пептидного фрагмента, включающего аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰ TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ ID NO.11), где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи, и

б) встраивают пептидный фрагмент в инсулинотропный пептид.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения инсулинотропного пептида, заключающийся в том, что:

а) получают пептидный фрагмент или его аналог, включающие аминокислотную последовательность QAAKEFIAWLVKX³⁵ (SEQ ID NO.9), в которой X³⁵ обозначает остаток ахиральной аминокислоты, где указанные остатки аминокислотной последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи, и

б) встраивают пептидный фрагмент в инсулинотропный пептид.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения инсулинотропного пептида, заключающийся в том, что осуществляют одну или несколько стадий, на которых:

а) получают первый пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰ (SEQ ID NO. 6), в которой X⁸ и X¹⁰ каждый обозначает остатки ахиральной аминокислоты, Н и Е каждый необязательно несет защитную группу боковой цепи;

б) получают второй пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ ID NO. 8), в которой остаток, обозначенный символом X^17-18, представляет собой дипептидный остаток псевдопролина, где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи;

в) осуществляют сочетание первого фрагмента и второго фрагмента с получением третьего пептидного фрагмента, включающего аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ ID NO.11), где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи;

г) получают четвертый пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность QAAKEFIAWLVKX³⁵ (SEQ ID NO.9), в которой X³⁵ обозначает остаток ахиральной аминокислоты, где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи;

д) осуществляют сочетание четвертого пептидного фрагмента с аргинином с получением пятого пептидного фрагмента, включающего аминокислотную последовательность QAAKEFIAWLVK X³⁵R (SEQ ID NO.12), где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи, и

е) осуществляют сочетание пятого фрагмента с третьим фрагментом с получением инсулинотропного пептида, включающего аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVK X³⁵R (SEQ ID NO.13), где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи.

Предпочтительно настоящее изобретение относится к способу получения инсулинотропного пептида, заключающегося в том, что:

а) получают первый пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰ (SEQ ID NO.6), в которой X⁸ и X¹⁰ каждый обозначает остатки ахиральной аминокислоты, Н и Е каждый необязательно несет защитную группу боковой цепи;

б) получают второй пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ ID NO.8), в которой остаток, обозначенный символом Х^17-18, представляет собой дипептидный остаток псевдопролина, указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи;

в) осуществляют сочетание первого фрагмента и второго фрагмента с получением третьего пептидного фрагмента, включающего аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ ID NO.11), где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи;

г) получают четвертый пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность QAAKEFIAWLVKX³⁵ (SEQ ID NO.9), в которой X³⁵ обозначает остаток ахиральной аминокислоты, где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи;

д) осуществляют сочетание четвертого пептидного фрагмента с аргинином с получением пятого пептидного фрагмента, включающего аминокислотную последовательность QAAKEFIAWLVK X³⁵R (SEQ ID NO.12), где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи, и

е) осуществляют сочетание пятого фрагмента с третьим фрагментом с получением инсулинотропного пептида, включающего аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVK X³⁵R (SEQ ID NO.13), где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи.

Следующим объектом настоящего изобретения является описанный выше способ, заключающийся в том, что осуществляют следующую дополнительную стадию, на которой:

ж) удаляют защитные группы боковых цепей с получением инсулинотропного пептида, включающего аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R (SEQ ID NO.5), и его аналогов, в которых каждый из символов Х в положениях 8, 10 и 35 независимо друг от друга обозначает ахиральный, необязательно имеющий стерическую помеху аминокислотный остаток.

Удаление защитных групп боковых цепей предпочтительно осуществляют с помощью раствора для удаления защитных групп, который содержит по меньшей мере один ацидолитический агент и по меньшей мере один акцептор катионов. Ацидолитические реагенты для полного удаления защитных групп предпочтительно выбирают из группы, включающей трифторуксусную кислоту (ТФК), HCl, кислоты Льюиса, такие как BF₃Et₂O или Me₃SiBr, жидкую плавиковую кислоту (HF), бромистый водород (HBr), трифторметансульфоновую кислоту и их комбинации. Приемлемые акцепторы катионов предпочтительно выбирают из динитротреитола (ДТТ), анизола, пара-крезола, этандитиола и диметилсульфида. Раствор для удаления защитных групп может также включать воду.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения инсулинотропного пептида, заключающийся в том, что:

а) получают первый пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰ (SEQ ID NO.6), в которой X⁸ и X¹⁰ каждый обозначает остатки ахиральной аминокислоты, Н и Е каждый необязательно несет защитную группу боковой цепи;

б) получают второй пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ ID NO.8), в которой остаток, обозначенный символом X^17-18, представляет собой дипептидный остаток псевдопролина, где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи;

в) осуществляют сочетание первого фрагмента и второго фрагмента с получением третьего пептидного фрагмента, включающего аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEG (SEQ ID NO.11), где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи;

г) получают четвертый пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность QAAKEFIAWLVKX³⁵ (SEQ ID NO.9), в которой X³⁵ обозначает остаток ахиральной аминокислоты, где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи;

д) осуществляют сочетание четвертого пептидного фрагмента с аргинином с получением пятого пептидного фрагмента, включающего аминокислотную последовательность QAAKEFIAWLVK X³⁵R (SEQ ID NO.12), где указанные аминокислотные остатки последовательности необязательно несут защитную группу боковой цепи, и

е) осуществляют сочетание пятого фрагмента с третьим фрагментом с получением инсулинотропного пептида формулы (SEQ. ID NO.5) HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R и его аналогов, в которых каждый из символов Х в положениях 8, 10 и 35 независимо друг от друга обозначает ахиральный, необязательно имеющий стерическую помеху аминокислотный остаток и в которых один или несколько аминокислотных остатков необязательно несут защитную группу боковой цепи.

На чертеже показана схематическая диаграмма схемы синтеза, предложенной в настоящем изобретении.

Фрагмент 12 представляет собой пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность HX⁸EX¹⁰ (SEQ ID NO.6). Фрагмент 14 представляет собой пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность T¹¹FTSD¹⁵VX^17-18YL²⁰EG (SEQ ID NO.8). Фрагмент 16 представляет собой пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵ (SEQ ID NO.9). Промежуточный фрагмент 18 представляет собой пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность H⁷X⁸EX¹⁰TFTSD¹⁵VX^17-18YL²⁰EG (SEQ ID NO.11). Промежуточный фрагмент 20 представляет собой пептидный фрагмент, включающий аминокислотную последовательность Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵R (SEQ ID NO.12). Продукт 11 представляет собой требуемый защищенный пептид H⁷X⁸EX¹⁰TFTSD¹⁵VX^17-18YL²⁰EG QAA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵R (SEQ ID NO.13), в котором Ser-Ser в положениях 17 и 18 еще находятся в форме защищенного псевдопролина. Ниже диаграмма будет описана более подробно.

Приведенные ниже варианты осуществления настоящего изобретения в виде конкретных форм, подробно описанным ниже, не являются исчерпывающими и не направлены на ограничение изобретения. Скорее варианты осуществления изобретения выбраны и описаны таким образом, чтобы другие специалисты в данной области смогли оценить и понять принципы и варианты воплощения на практике настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к способам синтеза для получения пептидов, таких как глюкагонподобный пептид-1 (GLP-1) и его встречающиеся в естественных условиях и не встречающиеся в естественных условиях обладающие инсулинотропной активностью аналоги, с использованием методов твердофазного и/или жидкофазного синтеза. Пептидные молекулы, предлагаемые в изобретении, могут быть защищенными, незащищенными или частично защищенными. Защита может представлять собой N-концевую защиту, защиту боковой цепи и/или C-концевую защиту. Хотя изобретение относится прежде всего к синтезу глюкагонподобных пептидов, их аналогов, фрагментов и их аналогов и слитых продуктов и их аналогов, предложенные в изобретении способы можно применять также для синтеза других пептидов, в частности пептидов, которые синтезируют с использованием комбинации твердофазных и жидкофазных подходов. Настоящее изобретение относится также к синтезу пептидных промежуточных фрагментов, ассоциированных с примесями, прежде всего пироглутаматными примесями. Предпочтительные молекулы GLP-1, которые можно применять при воплощении на практике настоящего изобретения, представляют собой встречающиеся в естественных условиях и не встречающиеся в естественных условиях GLP-1(7-36) и их аналоги.

В контексте настоящего описания понятие «включающий аминокислотную последовательность» предпочтительно обозначает «имеющий аминокислотную последовательность».

В контексте настоящего описания понятие «аналог» относится к встречающимся в естественных условиях и не встречающимся в естественных условиях аналогам, производным, слитым соединениям, солям или т.п. пептида. В контексте настоящего описания понятие «пептидный аналог», как правило, относится к пептиду, имеющему модифицированную аминокислотную последовательность, например, в результате одной или нескольких аминокислотных замен, делеций, инверсий и/или добавлений относительно другого пептида или пептидного аналога. Замены могут включать одну или несколько встречающихся в естественных условиях и не встречающихся в естественных условиях аминокислот. Замены предпочтительно могут быть консервативными или высококонсервативными. Понятие «консервативная замена» относится к замене аминокислоты на другую аминокислоту, которая имеет в целом такой же чистый электронный заряд и в целом такой же размер и форму. Например, аминокислоты с алифатическими боковыми цепями или аминокислоты с замещенными алифатическими боковыми цепями имеют приблизительно одинаковый размер, когда общее количество атомов углерода и гетероатомов в их боковых цепях отличается не более чем примерно на четыре. Они имеют приблизительно одинаковую форму, когда количество ветвей в их боковых цепях отличается не более чем примерно на одну или две. Считается, что аминокислоты с фенильными или замещенными фенильными группами в их боковых цепях имеют примерно одинаковый размер и форму. Ниже перечислено пять групп аминокислот. Замена аминокислоты в соединении на другую аминокислоту из этой же группы, как правило, приводит к консервативной замене.

Группа I: глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, цистеин, метионин и не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты с С₁-С₄алифатическими или с замещенными гидроксилом С₁-С₄алифатическими боковыми цепями (прямоцепочечные или одноразветвленные).

Группа II: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота и не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты с замещенными карбоновой кислотой С₁-С₄алифатическими боковыми цепями (неразветвленные или имеющие одну точку разветвления).

Группа III: лизин, орнитин, аргинин и не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты с замещенными амином или гуанидиногруппой С₁-С₄алифатическими боковыми цепями (неразветвленные или имеющие одну точку разветвления).

Группа IV: глутамин, аспаргин и не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты с замещенными амидом С₁-С₄алифатическими боковыми цепями (неразветвленные или имеющие одну точку разветвления).

Группа V: фенилаланин, фенилглицин, тирозин и триптофан.

В контексте настоящего описания понятие «аналог» более предпочтительно относится к солям пептидов или к их производным, амидированным на С-конце.

«Высококонсервативная замена» представляет собой замену аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет такую же функциональную группу в боковой цепи и приблизительно такой же размер и форму. Аминокислоты с алифатическими или аминокислоты с замещенными алифатическими боковыми цепями имеют приблизительно одинаковый размер, когда общее количество атомов углерода и гетероатомов в их боковых цепях отличается не более чем примерно на два. Они имеют приблизительно одинаковую форму, когда они имеют одинаковое количество ветвей в их боковых цепях. Примерами высококонсервативных замен являются замены валина на лейцин, треонина на серии, аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту и фенилглицина на фенилаланин.

Понятие «пептидное производное», как правило, относится к пептиду, пептидному аналогу или другой пептидной копии, которые имеют химическую модификацию в одной или нескольких их боковых группах, альфа-атомах углерода, концевой аминогруппе и/или концевой карбоксильной группе. Например, химическая модификация включает (но, не ограничивается только ими) добавление химических остатков, создание новых связей и/или удаление химических остатков. Модификации боковых групп аминокислот включают (но, не ограничиваются только ими) ацилирование ε-аминогрупп лизина, N-алкилирование аргинина, гистидина или лизина, алкилирование карбоксильных групп глутаминовой или аспарагиновой кислоты и деамидирование глутамина или аспарагина. Модификации концевых аминогрупп включают (но, не ограничиваются только ими) модификации дез-амино-типа, с использованием N-(низш.)алкила, N-ди(низш.)алкила и N-ацила (например, -СО-(низш.)алкила). Модификации концевой карбоксильной группы включают (но, не ограничиваются только ими) модификации с использованием амида, (низш.)алкиламида, диалкиламида и (низш.)алкилового сложного эфира. Предпочтительными производными являются производные, амидированные на концевой карбоксильной группе, например амид, (низш.)алкиламид или диалкиламид пептида. Таким образом, частично или полностью защищенные пептиды относятся к пептидным производным.

При воплощении настоящего изобретения на практике считается, что соединение обладает «инсулинотропной» активностью, если оно может стимулировать или способствовать стимуляции синтеза или экспрессии гормона инсулина. В предпочтительных вариантах воплощения на практике инсулинотропную активность можно продемонстрировать с помощью анализов, описанных в US 6887849 и 6703365.

Предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются пути синтеза синтетических (X⁸, X¹⁰, X³⁵) GLP-1(7-36)-пептидов, имеющих следующую формулу (SEQ. ID NO.5):

HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R,

и их аналогов, в которых каждый из символов Х в положениях 8, 10 и 35 независимо друг от друга обозначает ахиральный, необязательно имеющий стерическую помеху аминокислотный остаток. Любой из остатков X⁸, X¹⁰ и/или X³⁵ необязательно может нести защитную(ые) группу(ы) боковых цепей. Пептиды, имеющие указанную формулу, отличаются от нативного GLP-1(7-36) по меньшей мере тем, что нативные аминокислотные остатки в положениях 8 и 35 заменены на хиральные, необязательно имеющие стерическую помеху аминокислотные остатки X⁸ и X³⁵. Остаток X¹⁰ может являться производным нативной ахиральной аминокислоты глицина или другой ахиральной аминокислоты. Применение ахиральных аминокислот в положениях X⁸, X¹⁰ и Х³⁵ не только способствует стабилизации образовавшегося пептида, но так же, как установлено при создании настоящего изобретения, применение указанных аминокислот в качестве конструктивных элементов облегчает также предлагаемый в настоящем изобретении путь синтеза, который представлен на чертеже и дополнительно описан ниже.

Наиболее предпочтительным вариантом (X⁸, X¹⁰, X³⁵) GLP-11(7-36)-пептида, который можно синтезировать согласно принципам, предлагаемым в настоящем изобретении, является пептид формулы (SEQ ID NO. 4):

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR

и его аналоги, предпочтительно амидированные на С-конце. В этом пептиде применяют ахиральный остаток альфа-аминоизомасляной кислоты (или метилаланин, сокращенно обозначен на схеме как Aib) в качестве как Х⁸, так и X³⁵, он предпочтительно содержит амид на С-конце, остаток нативного G в положении 10, и он может быть обозначен формулой (Aib^8,35)GLP-1(7-36)-NH₂. Это условное изображение означает, что аминокислотный остаток, соответствующий аминокислоте «Aib», присутствует в положениях 8 и 35 вместо нативного аланина. Ахиральную альфа-аминоизомасляную кислоту называют также метилаланином. Пептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO. 4, описан в ЕР 1137667 В1. Присутствие остатков Aib в положениях 8 и 35 замедляет метаболическое расщепление в организме, делая этот пептид более стабильным в организме по сравнению с нативным пептидом GLP-1(7-36).

Настоящее изобретение относится к усовершенствованной методологии получения пептидов GLP-1(7-36), таких как (Aib^8,35)GLP-1 (7-36)-NH₂. Например, на чертеже схематически проиллюстрирована одна схема 10 синтеза пептидов GLP-1(7-36) и их аналогов. Схему 10, представленную на чертеже, по-видимому, наиболее целесообразно применять для крупномасштабного синтеза пептидов GLP-1(7-36). Крупномасштабные процессы, как правило, осуществляют для получения пептида в количестве, которое можно применять для продажи. Например, количество пептида при крупномасштабном процессе может составлять 500 г или 1 кг на партию и более часто от десятков до сотен килограммов на партию или более. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения способы, предлагаемые в изобретении, могут обеспечивать усовершенствования, которые приводят к снижению времени процессинга (синтеза), повышению выхода продуктов, улучшению чистоты продукта и/или снижению количества требуемых реагентов и исходных продуктов.

Схема синтеза 10, представленная на чертеже, основана на сочетании твердофазных и ж