Полипептиды из neisseria meningitidis

Полипептиды из neisseria meningitidis

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Все цитируемые в настоящем описании документы полностью включены в него посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Это изобретение относится к области исследований Neisseria meningitidis.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Neisseria meningitidis (менингококк) является неподвижным грамотрицательным диплококком, патогенным для людей. Эти бактерии колонизируют зев и вызывают менингит (и, иногда, септицемию в отсутствие менингита).

Все патогенные менингококки имеют полисахаридную капсулу. Эти полисахариды лежат в основе имеющихся вакцин против серогрупп менингококка - A, C, W135 и Y, но эти вакцины не подходят для применения против серогруппы В. Поэтому важной задачей исследователей является идентификация альтернативных антигенов для иммунизации против менингококков серогруппы В. Такими альтернативными антигенами являются белки, липополисахариды и везикулы внешней мембраны.

В ссылках 1-7 раскрыты различные полипептиды, полученные из последовательности генома менингококка серогруппы В, и в этих ссылках выбраны определенные последовательности для использования в вакцинах. Последовательность генома для штамма серогруппы А раскрыта в ссылке 8.

Задачей изобретения является предоставление дополнительных полипептидов для применения в разработке вакцин для профилактики и/или лечения менингококковых инфекций. В частности, задачей изобретения является предоставление полипептидов для применения в усовершенствованных вакцинах для профилактики и/или лечения менингококкового менингита. Пептиды также можно применять в диагностике и использовать в качестве мишеней действия антибиотиков.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полипептиды

Изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотные последовательности менингококка, раскрытые в примерах. Эти аминокислотные последовательности в списке последовательностей имеют четные номера, начиная с SEQ ID NO 2 и до SEQ ID NO 78. Следовательно, всего приведено 39 аминокислотных последовательностей, названных B269_nn, в которых nn является числом от 01 до 50 (одиннадцать номеров B269_nn не имеет последовательности: 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 12 и 40). Две последовательности (В269_32 и B269_37) являются предпочтительными.

Изобретение также относится к полипептидам, содержащим аминокислотные последовательности, которые идентичны по последовательности с аминокислотными последовательностями менингококка, раскрытыми в примерах. В зависимости от конкретной последовательности, степень идентичности по последовательности, предпочтительно, составляет больше 50% (например, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше). Эти полипептиды включают гомологи, ортологи, аллельные варианты и функциональные мутанты. Обычно считается, что на функциональное сходство белков указывает идентичность 50% или больше между двумя полипептидными последовательностями. Для каждой конкретной последовательности (SEQ ID) степень идентичности по последовательности, предпочтительно, выше значений как в колонке (В), так и в колонке (А), в таблице II настоящего описания, и, более предпочтительно, выше всех значений в колонках (С), (В) и (А) для этой последовательности.

По сравнению с менингококковыми последовательностями из примеров эти полипептиды могут включать одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) консервативных аминокислотных замен, т.е. замен одной аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет родственную боковую цепь. В общем, кодируемые в геноме аминокислоты разделяют на четыре семейства: (1) кислые, а именно аспартат, глутамат; (2) основные, а именно лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные, а именно аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные, а именно глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Иногда в классификации фенилаланин, триптофан и тирозин объединяют как ароматические аминокислоты. Обычно замена одиночных аминокислот на другие внутри этих семейств существенно не влияет на биологическую активность. У этих полипептидов также могут присутствовать одна или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) одиночных аминокислотных делеций относительно менингококковых последовательностей из примеров. Полипептиды также могут включать одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) вставок (например, каждая вставка из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) относительно менингококковых последовательностей из примеров.

Кроме того, изобретение относится к полипептидам, содержащим фрагменты менингококковых аминокислотных последовательностей, раскрытых в примерах. Фрагменты должны включать, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из последовательностей, и, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или больше).

Фрагмент может содержать, по меньшей мере, один Т-клеточный или, предпочтительно, В-клеточный эпитоп из последовательности. Т- и В-клеточные эпитопы могут быть идентифицированы эмпирически (например, с использованием PEPSCAN [9,10] или аналогичных способов) или их можно предсказать (например, с использованием антигенного индекса Джеймсона-Вулфа [11], подходов на основе матриц [12], TEPITOPE [13], нейронных сетей [14], OptiMer & EpiMer [15, 16], ADEPT [17], Tsites [18], гидрофильности [19], антигенного индекса [20] или способов, которые раскрыты в ссылке 21, и т.д.). Другими предпочтительными фрагментами являются (а) N-концевые сигнальные пептиды менингококковых полипептидов по изобретению, (б) менингококковые полипептиды, но без N-концевых сигнальных пептидов, (с) менингококковые полипептиды, но без их N-концевого аминокислотного остатка.

Полипептиды по изобретению можно получить многими способами, например химическим синтезом (полностью или частично), расщеплением более длинных пептидов протеазами, трансляцией с РНК, очисткой из клеточной культуры (например, из рекомбинантной экспрессирующей культуры), из самого организма (например, после бактериальной культуры или напрямую из организма пациентов) и т.д. Предпочтительный способ получения пептидов меньше 40 аминокислот в длину включает химический синтез in vitro [22, 23]. Особенно предпочтительным является твердофазный пептидный синтез, например, методики которого основаны на применении реакций с использованием tBoc или Fmoc [24]. Также можно использовать ферментативный синтез [25], частично или полностью. В качестве альтернативы химическому синтезу можно использовать биологический синтез, например полипептиды можно получить трансляцией. Трансляцию можно проводить in vitro или in vivo. Биологические способы обычно ограничены продукцией полипетидов, состоящих из L-аминокислот, но можно использовать манипуляции с механизмом трансляции (например, аминоацил-тРНК молекулами), для того чтобы включать D-аминокислоты (или другие неприродные аминокислоты, такие как йодотирозин или метилфенилаланин, азидогомоаланин и т.д.) [26]. Однако для включения D-аминокислот предпочтительно использовать химический синтез. Полипептиды по изобретению могут иметь ковалентные модификации на С-конце и/или N-конце.

Полипептиды по изобретению могут принимать различные формы (например, белок может быть нативным, слитым, гликозилированным, негликозилированным, модифицированным липидами, немодифицированным липидами, фосфорилированным, нефосфорилированным, миристоилированным, немиристоилированным, мономерным, мультимерным, дисперсным, денатурированным и т.д.).

Предпочтительно, чтобы полипептиды по изобретению были предоставлены в очищенной или по существу очищенной форме, т.е. по существу свободные от других полипептидов (например, свободные от природных полипептидов), в частности от других менингококковых полипептидов или полипептидов клетки-хозяина; и чистота которых, в общем, была, по меньшей мере, примерно 50% (по весу), и обычно, по меньшей мере, примерно 90%, т.е. меньше примерно 50% и, более предпочтительно, меньше примерно 10% (например, 5%) композиции составляли другие экспрессированные полипептиды. Предпочтительными полипептидами по изобретению являются менингококковые полипептиды. Предпочтительно, чтобы полипептиды по изобретению имели функцию, которая указана в таблице I для соответствующей последовательности.

Полипептиды по изобретению можно прикрепить к твердой подложке. Полипептиды по изобретению могут включать в себя детектируемую метку (например, радиоактивную или флуоресцентную метку, или биотиновую метку).

Термин «полипептид» относится к аминокислотным полимерам любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, а в его пептидной последовательности могут быть вставки соединений, не являющихся аминокислотами. Термин также охватывает аминокислотный полимер, модифицированный в природе или по изобретению; например, в результате образования дисульфидной связи, гликозилирования, присоединения липидов, ацетилирования, фосфорилирования или другой манипуляции или модификации, таких как конъюгирование с несущим метку компонентом. Также в определение включены, например, полипептиды, которые содержат один или несколько аминокислотных аналогов (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Полипептиды могут присутствовать в виде одиночных цепей или в виде ассоциированных цепей. Полипептиды по изобретению могут быть природно гликозилированными или искусственным образом гликозилированными (т.е. в полипептиде расположение участков гликозилирования отличается от расположения участков гликозилирования в соответствующем природном полипептиде).

Изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательность -X-Y- или -Y-X-, в которой -X- представляет собой аминокислотную последовательность, определенную выше, а -Y- не является определенной выше последовательностью, т.е. изобретение относится к слитым белкам. Если в кодирующей полипептид последовательности N-концевым кодоном не является ATG, тогда этот кодон будет транслироваться как стандартная аминокислота этого кодона вместо Met, если этот кодон будет стартовым кодоном.

Изобретение относится к способу получения полипептидов по изобретению, включающему в себя стадию культивирования клеток-хозяев по изобретению при условиях, индуцирующих экспрессию полипептида.

Изобретение относится к способу получения полипептида по изобретению, в котором синтез полипептида частично или полностью осуществляется химическими методами.

Изобретение относится к композиции, включающей в себя два или несколько полипептидов по изобретению.

Изобретение также относится к гибридному полипептиду, представленному формулой NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH, в которой X представляет собой полипептид, определенный выше, L является необязательной линкерной аминокислотной последовательностью, А является необязательной N-концевой аминокислотной последовательностью, В является необязательной С-концевой аминокислотной последовательностью, а n является целым числом больше единицы. Значение n находится между 2 и x, а значение x обычно равно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Предпочтительно, n равно 2, 3 или 4; более предпочтительно - 2 или 3; наиболее предпочтительно, n-2. Для каждого n-звена последовательность -X- может быть одинаковой или разной. Для каждого n-звена [-X-L-] линкерная аминокислотная последовательность -L- может присутствовать или отсутствовать. Например, когда n=2 гибрид может представлять собой NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH и т.д. Линкерная аминокислотная последовательность (линкерные аминокислотные последовательности) -L- обычно будут короткими (например, 20 или меньше аминокислот, а именно 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование, полиглициновые линкеры (т.е. Gly_n, где n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше) и гистидиновые таги (т.е. His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше). Другие подходящие линкерные аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области. -A- и -B- являются необязательными последовательностями, которые обычно будут короткими (например, 40 или меньше аминокислот, а именно 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности, которые направляют трафик полипептидов, или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, гистидиновые таги, а именно His_n, где n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше). Другие подходящие N-концевые и С-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области.

Для оценки иммуногенности полипептидов по изобретению in vivo можно применять различные тесты. Например, можно получить рекомбинантные полипептиды с помощью экспрессии и использовать их для скрининга сыворотки пациентов с помощью иммуноблоттинга. Положительная реакция сыворотки пациента и полипептида указывает на то, что у пациента ранее выработался иммунный ответ на тестируемый белок, т.е. белок является иммуногеном. Этот способ также можно использовать для идентификации иммунодоминатных белков.

Антитела

Изобретение относится к антителам, которые связывают полипептиды по изобретению. Они могут быть поликлональными или моноклональными, и их можно получать любыми соответствующими средствами (т.е. рекомбинантной экспрессией). Для увеличения совместимости с иммунной системой человека антитела могут быть химерными или гуманизированными (смотри, например, ссылки 27 и 28) или можно использовать антитела человека. Антитела могут включать детектируемую метку (например, антитела для способов диагностики). Антитела по изобретению можно прикрепить к твердой подложке. Предпочтительными антителами по изобретению являются нейтрализующие антитела.

В частности, моноклональные антитела пригодны для идентификации и очистки индивидуальных полипептидов, против которых они направлены. Моноклональные антитела по изобретению можно использовать в качестве реагентов в иммунных методах анализа, радиоиммунных методах анализа (RIA) или твердофазном иммуноферментном методе анализа (ELISA) и т.д. В этих приложениях антитела можно пометить аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентная молекула или фермент. Моноклональные антитела, полученные вышеуказанным способом, также можно применять для молекулярной идентификации и характеристики (эпитопного картирования) полипептидов по изобретению.

Предпочтительно, чтобы антитела по изобретению были очищенными или по существу очищенными. Обычно, антитело будет присутствовать в композиции, которая будет по существу свободна от других полипептидов, например, когда менее 90% (по весу), обычно, менее 60% или, наиболее часто, менее 50% композиции состоит из других полипептидов.

Антитела по изобретению могут принадлежать к любому изотипу (например, IgA, IgG, IgM, т.е. тяжелые цепи α, γ или µ), но, как правило, являются IgG. В рамках изотипа IgG антитела могут быть подклассов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Антитела по изобретению могут иметь легкую цепь κ или λ.

Но обычно будут являться IgG. В изотипе IgG антитела могут принадлежать к IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 подклассам. Антитела по изобретению.

Антитела по изобретению могут иметь различную форму, включая целые антитела, фрагменты антител, такие как F(ab')2- и F(ab)-фрагменты, Fv-фрагменты (нековалентные гетеродимеры), одноцепочечные антитела, такие как одноцепочечные Fv-молекулы (scFv), миниантитела, олигоантитела и т.д. Термин «антитело» не подразумевает конкретного источника происхождения и включает антитела, полученные нестандартными способами, такими как фаговый дисплей.

Изобретение относится к способу детекции полипептидов по изобретению, включающему в себя стадии: (а) стадию контактирования антитела по изобретению с биологическим образом при условиях, подходящих для образования комплексов антиген-антитело; и (б) стадию детекции указанных комплексов.

Изобретение относится к способу детекции полипептидов по изобретению, включающему в себя стадии: (а) стадию контактирования антитела по изобретению с биологическим образом (например, образцом крови или сыворотки) при условиях, подходящих для образования комплексов антиген-антитело; и (б) стадию детекции указанных комплексов.

Нуклеиновые кислоты

Изобретение относится к нуклеиновой кислоте, включающей нуклеотидные последовательности менингококка, раскрытые в примерах. Эти нуклеотидные последовательности являются SEQ ID NO с нечетными номерами от 1 до 77.

Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидные последовательности, гомологичные менингококковым нуклеотидным последовательностям, раскрытым в примерах.

Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, раскрытой в примерах. Гибридизацию можно проводить при условиях с различной степенью «жесткости». Увеличивающие жесткость гибридизации условия широко известны и опубликованы в литературе [например, смотри стр. 7.52 в ссылке 29]. Примеры соответствующих условий включают (в порядке усиления жесткости): температуры инкубации 25°C, 37°C, 50°C, 55°C и 68°C; концентрации буфера 10 × SSC, 6 × SSC, 1 × SSC, 0,1 × SSC (где SSC представляет собой 0,15 M NaCl и 15 мМ цитратный буфер) и их эквиваленты при использовании других буферных систем; концентрации формамида 0%, 25%, 50% и 75%; время инкубации от 5 минут до 24 часов; 1, 2 или более стадий отмывки; и отмывающие растворы 6 × SSC, 1 × SSC, 0,1 × SSC или деионизированная вода. Методики гибридизации и их оптимизация хорошо известны в данной области [например, смотри ссылки 29-32 и т.д.].

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота по изобретению гибридизуется с мишенью по изобретению при мягких условиях гибридизации; в других вариантах осуществления изобретения она гибридизуется при средних условиях гибридизации; в предпочтительных вариантах осуществления изобретения она гибридизуется при жестких условиях. Примером мягких условий гибридизации являются 50°С и 10 × SSC. Примером средних условий гибридизации являются 55°С и 1 × SSC. Примером жестких условий гибридизации являются 68°С и 0,1 × SSC.

Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей фрагменты этих последовательностей. Они должны содержать, по меньшей мере, n последовательных нуклеотидов из менингококковых последовательностей и, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 10 или больше (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 или больше).

Изобретение относится к нуклеиновой кислоте с формулой 5'-X-Y-Z-3', в которой -X- является нуклеотидной последовательностью, состоящей из x нуклеотидов; -Z- является нуклеотидной последовательностью, состоящей из z нуклеотидов; -Y- является нуклеотидной последовательностью, состоящей из: или (a) фрагмента одной из SEQ ID NO с нечетным номером от 1 до 77, или (б) последовательности, комплементарной (а); причем указанная нуклеиновая кислота 5'-X-Y-Z-3' не является ни (i) фрагментом одной из SEQ ID NO с нечетным номером от 1 до 77, ни (ii) последовательностью, комплементарной (i). Элементы -X- и/или -Z- могут включать в себя промоторную последовательность (или комплементарную ей последовательность).

Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептиды и фрагменты полипептидов по изобретению.

Изобретение включает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательности, комплементарные последовательностям, раскрытым в списке последовательностей (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве проб, или для использования в качестве праймеров), а также последовательности, в фактически приведенной ориентации.

Нуклеиновые кислоты по изобретению можно использовать в реакциях гибридизации (например, в методиках Нозерн и Саузерн блоттинга, или в микроматрицах нуклеиновых кислот, или «генных чипах») и в реакциях амплификации (например, ПЦР (полимеразная цепная реакция), SDA (амплификация замещением цепей), SSSR (самоподдерживающаяся амплификация последовательности), LCR (лигазная цепная реакция), TMA (транскрипционная амплификация), NASBA (амплификация на основе нуклеотидной последовательности) и т.д.) и в других методиках нуклеиновых кислот.

Нуклеиновая кислота по изобретению может находится в любой форме (например, одноцепочечной, двухцепочечной, в виде вектора, праймеров, проб, меченной форме и т.д.). Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть кольцевыми или разветвленными, но, обычно, бывают линейными. Если не указано или не требуется иное, в любом варианте осуществления изобретения, в котором используется нуклеиновая кислота, ее можно использовать как в двухцепочечной форме, так и каждую из комплементарных одноцепочечных форм, которые образуют двухцепочечную форму. Обычно праймеры и пробы являются одноцепочечными, поскольку они являются антисмысловыми нуклеиновыми кислотами.

Предпочтительно, чтобы нуклеиновые кислоты по изобретению были предоставлены в очищенной или по существу очищенной форме, т.е. по существу свободные от других нуклеиновых кислот (например, свободные от других природных нуклеиновых кислот), в частности от других нуклеиновых кислот Haemophilus или клеток-хозяев, в общем чистота нуклеиновых кислот по изобретению составляет, по меньшей мере, примерно 50% (по весу), а обычно, по меньшей мере, примерно 90%. Предпочтительными нуклеиновыми кислотами по изобретению являются нуклеиновые кислоты H. meningitidis.

Нуклеиновые кислоты по изобретению можно получить множеством способов, например химическим синтезом (например, фосфороамидитным синтезом ДНК) полностью или частично, расщеплением более длинных нуклеиновых кислот с использованием нуклеаз (например, ферментов рестрикции), соединением более коротких нуклеиновых кислот или нуклеотидов (например, с использованием лигаз или полимераз), из геномных или кДНК-библиотек и т.д.

Можно прикрепить нуклеиновую кислоту по изобретению к твердой подложке (например, шарику, пластине, фильтру, пленке, слайду, подложке, используемой в методике микроматриц, смоле и т.д.). Можно пометить нуклеиновую кислоту по изобретению, например, радиоактивной или флуоресцентной меткой, или биотиновой меткой. Мечение особенно полезно, когда нуклеиновую кислоту нужно использовать в методиках детекции, например если нуклеиновая кислота представляет собой праймер или пробу.

Термин «нуклеиновая кислота» в общем обозначает полимерную форму нуклеотидов любой длины, которые включают в себя дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или их аналоги. Он включает ДНК, РНК и гибриды ДНК/РНК. Этот термин также включает аналоги ДНК или РНК, такие как те, что содержат модифицированный каркас (например, пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) или фосфоротиоаты) или модифицированные основания. Следовательно, изобретение включает мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, ДНК, кДНК, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, разветвленные нуклеиновые кислоты, плазмиды, векторы, пробы, праймеры и т.д. Если нуклеиновая кислота по изобретению представляет собой РНК, она может быть кэпирована на 5'-конце или нет.

Нуклеиновые кислоты по изобретению содержат менингококковые последовательности, определенные выше, но они могут также содержать неменингококковые последовательности (например, в нуклеиновых кислотах с формулой 5'-X-Y-Z-3', описанной выше). В частности, это применимо для праймеров, которые, поэтому, могут содержать первую последовательность, комплементарную нуклеиновой кислоте-мишени Neisseria, и вторую последовательность, которая не комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени. Предпочтительно, чтобы любые такие некомплементарные последовательности в праймере были расположены в 5'-области от комплементарных последовательностей. Типичные некомплементарные последовательности содержат сайты рестрикции или промоторные последовательности.

Нуклеиновые кислоты по изобретению можно получить множеством способов, например химическим синтезом (по меньшей мере, частично), расщеплением более длинных нуклеиновых кислот с использованием нуклеаз (например, ферментов рестрикции), соединением более коротких нуклеиновых кислот (например, с использованием лигаз или полимераз), из геномных или кДНК-библиотек и т.д.

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть частью вектора, т.е. частью нуклеотидной конструкции, созданной для трансдукции/трансфекции одного или нескольких типов клеток. Векторы могут быть, например, «векторами для клонирования», созданными для выделения, амплификации и репликации встроенных нуклеотидов, «экспрессионными векторами», созданными для экспрессии нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине, «вирусными векторами», созданными для получения рекомбинантных вирусов или вирусоподобных частиц, или «шаттл-векторами», которые включают в себя признаки более чем одного типа вектора. Предпочтительными векторами являются плазмиды. «Клетка-хозяин» включает отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть или является реципиентом экзогенной нуклеиновой кислоты. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство не должно быть полностью идентично (морфологически или полностью совпадать по ДНК) с исходной родительской клеткой вследствие природной, случайной или специальной мутации и/или изменения. Клетки-хозяева включают клетки, трансфецированные или инфицированные in vivo или in vitro нуклеиновой кислотой по изобретению.

Если нуклеиновая кислота - это ДНК, то очевидно, что «U» в последовательности РНК будет заменен на «Т» в ДНК. Аналогичным образом, если нуклеиновой кислотой является РНК, очевидно, что «Т» в ДНК-последовательности будет заменен на «U» в РНК.

Термины «комплементарность» и «комплементарный» в отношении нуклеиновых кислот относится к образованию пар оснований по Уотсону-Крику. Поэтому основанием, комплементарным С, является G, основанием, комплементарным G, является С, основанием, комплементарным А, является Т (или U), а основанием, комплементарным Т (или U), является А. Также возможно использование оснований, таких как I (пуриновое основание инозин), например, для комплементарного связывания с пиримидинами (С или Т). Термины также подразумевают направление: последовательностью, комплементарной 5'-ACAGT-3', является 5'-ACTGT-3', а не 5'-TGTCA-3'.

Нуклеиновые кислоты по изобретению можно использовать, например, для получения полипептидов; в качестве гибридизационных проб для детекции нуклеиновых кислот в биологических образцах; для создания дополнительных копий нуклеиновых кислот; для создания рибозимов или антисмысловых олигонуклеотидов; в качестве одноцепочечных ДНК-праймеров или проб; или в качестве олигонуклеотидов, образующих тройные цепи.

Изобретение относится к способу получения нуклеиновой кислоты по изобретению, в котором нуклеиновую кислоту синтезируют частично или полностью химическими методами.

Изобретение относится к векторам, содержащим нуклеотидные последовательности по изобретению (например, векторы для клонирования или экспрессии), и к клетке-хозяину, трансформированной такими векторами.

Изобретение также относится к набору, содержащему праймеры (например, ПЦР-праймеры) для амплификации матричной последовательности, которую включает в себя менингококковая нуклеотидная последовательность, причем набор содержит первый праймер и второй праймер, в котором первый праймер по существу комплементарен указанной матричной последовательности, а второй праймер по существу комплементарен цепи, комплементарной указанной матричной последовательности, где части указанных праймеров, по существу комплементарные матрице, ограничивают концы амплифицируемой матричной последовательности. Первый праймер и/или второй праймер могут включать детектируемую метку (например, флуоресцентную метку).

Изобретение также относится к набору, включающему в себя первый и второй одноцепочечные олигонуклеотиды, которые позволяют амплифицировать матричную нуклеотидную последовательность менингококка, которая содержится в одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоте (или их смеси), в котором: (а) первый олигонуклеотид содержит последовательность праймера, который по существу комплементарен указанной матричной нуклеотидной последовательности; (б) второй олигонуклеотид содержит последовательность праймера, который по существу комплементарен последовательности, комплементарной указанной матричной нуклеотидной последовательности; (в) первый олигонуклеотид и/или второй олигонуклеотид содержат последовательность, которая некомплементарна указанной матричной нуклеиновой кислоте; и (г) указанные праймерные последовательности ограничивают концы амплифицируемой матричной последовательности. Предпочтительно, чтобы некомплементарная последовательность (некомплементарные последовательности) из признака (в) располагались выше (т.е. в 5'-области от) праймерных последовательностей. Одна или обе из этих (в) последовательностей могут содержать сайт рестрикции [например, как в ссылке 33] или промоторную последовательность [например, как в ссылке 34]. Первый олигонуклеотид и/или второй олигонуклеотид могут включать детектируемую метку (например, флуоресцентную метку).

Матричная последовательность может быть любой частью геномной последовательности.

Изобретение относится к способу детекции нуклеиновой кислоты по изобретению, включающему в себя стадии: (а) контактирования нуклеиновой пробы по изобретению с биологическим образом при условиях гибридизации для образования дуплексов; и (б) детекции указанных дуплексов.

Изобретение относится к способу детекции менингококка в биологическом образце (например, крови), включающему в себя стадию контактирования нуклеиновой кислоты по изобретению с биологическим образцом при условиях, подходящих для гибридизации. Процесс может включать амплификацию нуклеиновой кислоты (например, ПЦР, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA и т.д.) или гибридизацию (например, микроматриц, блотов, гибридизацию с пробой в растворе и т.д.).

Изобретение относится к способу получения фрагмента последовательности-мишени, в котором фрагмент получают удлинением нуклеотидного праймера. Последовательность-мишень и/или праймерная последовательность являются нуклеиновыми кислотами по изобретению. Реакция удлинения праймера может включать амплификацию нуклеиновой кислоты (например, ПЦР, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA и т.д.).

Амплификация нуклеиновой кислоты по изобретению может быть количественной и/или проходить в реальном времени.

Для некоторых вариантов осуществления изобретения предпочтительная длина нуклеиновых кислот, по меньшей мере, составляет 7 нуклеотидов (например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 нуклеотидов или больше).

Для некоторых вариантов осуществления изобретения предпочтительная длина нуклеиновых кислот, самое большее, составляет 500 нуклеотидов (например, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 нуклеотидов или меньше).

Предпочтительно, чтобы длина праймеров и проб по изобретению и других нуклеиновых кислот, используемых в гибридизации, находилась между 10 и 30 нуклеотидами (например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов).

Фармацевтические композиции

Изобретение относится к композициям, которые содержат (а) полипептид, антитело и/или нуклеиновую кислоту по изобретению и (б) фармацевтически приемлемый носитель. Например, эти композиции подходят для использования в качестве иммуногенных композиций, или в качестве диагностических реактивов, или в качестве вакцин. По изобретению вакцины могут быть или профилактическими (т.е. предотвращать инфекцию), или терапевтическими (т.е. лечить инфекцию), но вакцины, обычно, будут профилактическими.

Термин «фармацевтически приемлемые носители» включает любой носитель, который сам по себе не вызывает продукцию антител, вредных для индивидуума, который получает композицию. Подходящие носители обычно представляют собой большие, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, сахароза, трегалоза, лактоза и агрегаты липидов (такие как масляные капли или липосомы). Среднему специалисту в данной области хорошо известны такие носители. Вакцины также могут содержать разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин и т.д. Дополнительно могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, вещества, поддерживающие рН, и т.п. Типичным носителем является апирогенный, фосфатный физиологический раствор. Подробное описание фармацевтически приемлемых наполнителей приведено в ссылке 141.

Композиции по изобретению могут включать противомикробное соединение, в частности, если композиции находятся в многодозовой упаковке.

Композиции по изобретению могут содержать детергент, например Tween (полисорбат), такой как Tween 80. Обычно, содержание присутствующих детергентов низкое, например < 0,01%.

Композиции по изобретению могут включать соли натрия (например, хлорид натрия), что обуславливает тоничность раствора. Типичная концентрация NaCl составляет 10±2 мг/мл.

Обычно, композиции по изобретению будут включать буферный раствор. Типичным буферным раствором является фосфатный буферный раствор.

Композиции по изобретению могут содержат сахарный спирт (например, маннит) или дисахарид (например, сахарозу или трегалозу), например, в концентрации примерно 15-30 мг/мл (например, 25 мг/мл), в частности, в том случае, когда композиции должны быть в лиофилизированном виде, или когда композиции включают материал, который был восстановлен из лиофилизированного материала. Для лиофилизации рН композиции можно подвести до примерно 6,1 до лиофилизации.

Полипептиды по изобретению можно вводить вместе с другими иммунорегуляторными агентами. В частности, композиции обычно будут включать адъювант. Адъюванты, которые можно использовать в композициях по изобретению, включают, но не ограничены этим, следующее.

А. Минеральные композиции

Минеральные композиции, подходящие для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают минеральные соли, такие как соли алюминия и кальция. Изобретение включает минеральные соли, такие как гидроксиды (например, оксигидроксиды), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [например, смотри главы 8 и 9 из ссылки 35], или смеси различных минеральных соединений; причем форма соединения может быть любой (например, гелевой, кристаллической, аморфной и т.д.); а также предпочтительно, чтобы соединение обладало адсорбирующими свойствами. Содержащие минералы композиции могут также представлять собой состав из частиц солей металлов [36].

Особенно предпочтительными соединениями являются фосфаты алюминия, в частности в композициях, которые включают сахарный антиген H.influenzae, а типичным адъювантом является аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным соотношением PO₄/Al от 0,84 до 0,92, включенный в концентрации 0,6mg Al³⁺/мл. Можно использовать адсорбцию с низкой дозой фосфата алюминия, например 50-100 мкг Al³⁺ на дозу конъюгата. Если в композиции присутствует более одного конъюгата, то не все конъюгаты должны быть адсорбированы.

Б. Масляные эмульсии

Композиции масляных эмульсий для использования в качестве адъювантов в изобретении включают эмульсии скваленов в воде, такие как MF59 [смотри главу 10 из ссылки 35; смотри, также ссылку 37] (5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85 в виде субмикронных частиц, полученных с использованием гомогенизатора Microfluidizer). Также можно использовать полный и неполные адъюванты Фрейнда (CFA и IFA, соответственно).

В. Составы на основе сапонина [глава 2