Средства для лечения кардиопатии

Средства для лечения кардиопатии

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к средствам для лечения инфаркта миокарда, содержащим ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента, и к применению таких средств. Кроме того, настоящее изобретение относится к средствам, подавляющим ремоделирование левого желудочка сердца после инфаркта миокарда, которые содержат ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента, и к применению таких средств.

Уровень техники

Инфаркт миокарда является одним из ишемических заболеваний сердца. Он представляет собой нарушение, которое вызывает некроз миокарда, где спазм венечной артерии сердца возникает вследствие атеросклероза и подобного расстройства, и кровоток в венечной артерии значительно снижается или останавливается. Расширение и/или ухудшение состояния пораженной инфарктом области является причиной осложнений, таких как сердечная недостаточность и/или вызванная ишемией тяжелая аритмия, и становится угрозой для жизни.

По мере того как инфаркт миокарда прогрессирует, клетки миокарда в пораженных инфарктом зонах отмирают и/или отторгаются и заменяются фиброзными тканями, такими как коллагеновое волокно. В такой зоне инфаркта наблюдается дефект сократительной способности, и такая зона не выдерживает внутрисердечного давления, которое повышается при сокращении сердца, и тогда фиброзная стенка понемногу расширяется. В результате для компенсации гипофункции возникает гипертрофия эндокардиальной полости в области, не пораженной инфарктом, и дилатация целого левого желудочка. Такое явление называют ремоделированием левого желудочка, и оно, как известно, в дальнейшем снижает функцию сердца и повышает болезненность и впоследствии смертность. Поэтому для улучшения прогноза инфаркта миокарда представляется важным подавить прогрессирование ремоделирования левого желудочка как можно раньше, и разработка эффективных способов лечения является желательной.

IL-6 является цитокином, названным стимулирующим В-клетки фактором 2 (BSF2), или интерфероном β2. IL-6 был открыт как фактор дифференцировки, принимающий участие в активации В-лимфоцитов (непатентный документ 1), и позже был найден как многофункциональный цитокин, который влияет на функцию различных клеток (непатентный документ 2). Было показано, что IL-6 вызывает созревание Т-лимфоцитов (непатентный документ 3).

IL-6 передает свою биологическую активность посредством двух типов белков на клетке. Одним из белков является рецептор IL-6, который представляет собой лигандсвязывающий белок, с которым связывается IL-6, и он имеет молекулярную массу приблизительно 80 кД (непатентные документы 4 и 5). Кроме мембраносвязанной формы, которая пронизывает мембрану и экспрессируется на клеточной мембране, рецептор IL-6 присутствует как растворимый рецептор IL-6, который в основном состоит из внеклеточной области мембраносвязанной формы.

Другим белком является мембранный белок gp130, который имеет молекулярную массу приблизительно 130 кД и вовлекается в передачу сигнала, не связанную с лигандом. Биологическая активность IL-6 передается в клетку посредством образования комплекса IL-6/рецептор IL-6, а затем связывания комплекса с gp130 (непатентный документ 6).

Ингибиторы IL-6 представляют собой вещества, которые ингибируют передачу биологической активности IL-6. К настоящему времени известны антитела против IL-6 (анти-IL-6-антитела), антитела против рецепторов IL-6 (антитела против рецептора IL-6), антитела против gp130 (анти-gp130-антитела), варианты IL-6, неполные пептиды IL-6 или рецепторов IL-6 и подобные им.

Имеется несколько сообщений относительно антител против рецептора IL-6 (непатентные документы 7 и 8; патентные документы 1-3). Известно гуманизированное РМ-1-антитело (патентный документ 4), которое было получено путем переноса в человеческое антитело гипервариабельного участка (CDR), антитела мыши РМ-1 (непатентный документ 9), которое является одним из антител против рецептора IL-6.

К настоящему времени исследователи сделали предположение, что IL-6 влияет на функцию и структуру сердца исходя из таких фактов, что IL-6 оказывает отрицательное влияние на сократимость сердечной мышцы (непатентный документ 10), что гипертрофия сердца развивается у мыши, у которой gp130 постоянно активируется вследствие повышенной экспрессии IL-6 и рецепторов IL-6 (непатентный документ 11), и так далее. После инфаркта миокарда IL-6 экспрессируется в левом желудочке, в частности в пограничной зоне инфаркта миокарда, связанного с реперфузией (непатентный документ 12), и уровень экспрессии связан с размером левого желудочка (LV) после инфаркта миокарда (непатентный документ 13). Кроме того, было показано, что клетки миокарда вырабатывают IL-6 при слабой нагрузке кислорода (непатентный документ 14) и что экспрессия цитокинов в немышечных клетках в процессе постинфарктного ремоделирования играет регулирующую роль в изменениях внеклеточного матрикса (непатентный документ 15). Кроме того, что касается связи между инфарктом миокарда и IL-6, показано, что система JAK/STAT, активированная IL-6, обладает защитным действием от инфаркта миокарда (непатентный документ 16).

С другой стороны, на основании эксперимента на IL-6-нокаут-мышах было показано, что недостаток IL-6 не оказывал влияния на размер пораженной инфарктом зоны, ремоделирование левого желудочка или тому подобное (непатентный документ 17). Как описано выше, роль IL-6 в развитии инфаркта миокарда и ремоделировании левого желудочка после инфаркта миокарда неизвестна.

Ссылки предшествующего уровня техники в данной области, относящиеся к настоящему изобретению, представлены ниже.

[Непатентный документ 1] Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76

[Непатентный документ 2] Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78

[Непатентный документ 3] Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988)167, 1253-1258

[Непатентный документ 4] Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981

[Непатентный документ 5] Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828

[Непатентный документ 6] Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581

[Непатентный документ 7] Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146

[Непатентный документ 8] Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630

[Непатентный документ 9] Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906

[Непатентный документ 10] Finkel, M. S. et al., Science (1992) 257, 387-389

[Непатентный документ 11] Hirota, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 4862-4866

[Непатентный документ 12] Gwechenberger, M. et al., Circulation (1999) 99, 546-551

[Непатентный документ 13] Ono, K. et al., Circulation (1998) 98, 149-156

[Непатентный документ 14] Yamauchi-Takihara, K. et al., Circulation (1995) 91, 1520-1524

[Непатентный документ 15] Yue, P. et al., Am. J. Physiol. (1998) 275,H250-H258

[Непатентный документ 16] Negoro, S. et al., Cardiovasc. Res. (2000) 47, 797-805

[Непатентный документ 17] Fuchs M. et al., FASEB J. (2003) 17, 2118-2120

[Патентный документ 1] Международная публикация WO 95/09873

[Патентный документ 2] Французская патентная публикация No. FR 2694767

[Патентный документ 3] Патент США No. 5216128

[Патентный документ 4] Международная публикация WO 92/19759

Описание изобретения

[Проблемы, которые можно решить с помощью изобретения]

До настоящего времени полагали, что IL-6 принимает участие в развитии инфаркта миокарда и в последующем ремоделировании левого желудочка. Однако его конкретная роль не выяснена. Кроме того, не обнаружено, какого типа эффект введения ингибитора IL-6 можно продемонстрировать на инфаркте миокарда и на последующем ремоделировании левого желудочка.

Настоящее изобретение было выполнено в подобной ситуации, и целью настоящего изобретения было разработать средства для лечения инфаркта миокарда, содержащие ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента. Кроме того, настоящее изобретение относится к средствам, способствующим подавлению ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, содержащим ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента. Кроме того, к другим целям настоящего изобретения относится разработка способов лечения инфаркта миокарда и способов подавления ремоделирования левого желудочка, последующего за инфарктом миокарда, причем все способы включают стадию введения ингибитора IL-6 субъектам, у которых развился инфаркт миокарда.

[Средства решения проблем]

Для решения описанных выше проблем авторы настоящего изобретения исследовали влияние антител против рецептора IL-6 на улучшение состояния пораженной инфарктом зоны при инфаркте миокарда и на подавление ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда.

Вначале авторы настоящего изобретения создали модели инфаркта миокарда путем лигирования левой нисходящей передней ветви сосудов у самцов мышей Balb/c. Затем 500 мкг антитела против рецептора IL-6 (MR16-1) вводили внутрибрюшинно мышам-моделям инфаркта миокарда.

В результате повышение активности миелопероксидазы (МРО) в зоне, пораженной инфарктом миокарда, было в значительной степени подавлено. Кроме того, была подавлена экспрессия хемотаксического белка-1 моноцита миокарда (МСР-1) как в зоне инфаркта, так и в области, не пораженной инфарктом, у мышей при введении антитела против рецептора IL-6. Кроме того, эхокардиографические и гистологические проверки обнаружили, что гипертрофия сердца была подавлена у мышей при введении антитела против рецептора IL-6.

Таким образом, вначале авторы настоящего изобретения обнаружили, что путем введения антитела против рецептора IL-6 можно улучшить состояние пораженной инфарктом зоны при инфаркте миокарда и подавить ремоделирование левого желудочка после инфаркта миокарда, и окончательно завершили настоящее изобретение.

Точнее, настоящее изобретение относится:

[1] к средству для лечения инфаркта миокарда, содержащему ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента;

[2] к средству по п. [1], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает IL-6;

[3] к средству по п. [1], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает рецептор IL-6;

[4] к средству по п. [2] или [3], где антитело представляет собой моноклональное антитело;

[5] к средству по п. [2] или [3], где антитело представляет собой антитело против IL-6 человека или рецептора IL-6 человека;

[6] к средству по п. [2] или [3], где антитело представляет собой рекомбинантное антитело;

[7] к средству по п. [6], где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело;

[8] к средству для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, содержащему ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента;

[9] к средству по п. [8], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает IL-6;

[10] к средству по п. [8], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает рецептор IL-6;

[11] к средству по п. [9] или [10], где антитело представляет собой моноклональное антитело;

[12] к средству по п. [9] или [10], где антитело представляет собой антитело против IL-6 человека или рецептора IL-6 человека;

[13] к средству по п. [9] или [10], где антитело представляет собой рекомбинантное антитело;

[14] к средству по п. [13], где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело;

[15] к средству по любому из пп. от [8] до [14], которое используют для лечения инфаркта миокарда;

[16] к способу лечения инфаркта миокарда у субъекта, включающему стадию введения ингибитора IL-6 субъекту, у которого развился инфаркт миокарда;

[17] к способу подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда у субъекта, включающему стадию введения ингибитора IL-6 субъекту, у которого развился инфаркт миокарда;

[18] к способу по п. [16] или [17], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает IL-6;

[19] к способу по п. [16] или [17], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает рецептор IL-6;

[20] способу по п. [18] или [19], где антитело представляет собой моноклональное антитело;

[21] к способу по п. [18] или [19], где антитело представляет собой антитело против IL-6 человека или рецептора IL-6 человека;

[22] к способу по п. [18] или [19], где антитело представляет собой рекомбинантое антитело;

[23] к способу по п. [22], где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело;

[24] к применению ингибитора IL-6 для получения средства, предназначенного для лечения инфаркта миокарда;

[25] к применению ингибитора IL-6 для получения средства, предназначенного для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда;

[26] к применению по п. [24] или [25], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает IL-6;

[27] к применению по п. [24] или [25], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает рецептор IL-6;

[28] к применению по п. [26] или [27], где антитело представляет собой моноклональное антитело;

[29] к применению по п. [26] или [27], где антитело представляет собой антитело против IL-6 человека или рецептора IL-6 человека;

[30] к применению по п. [26] или [27], где антитело представляет собой рекомбинантное антитело; и

[31] к применению по п. [30], где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело.

Наилучший способ выполнения изобретения

Авторы изобретения обнаружили, что улучшение состояния зоны поражения при инфаркте миокарда и подавление ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда может быть достигнуто путем введения антитела против рецептора IL-6. Изобретение основано на полученных данных.

Настоящее изобретение относится к средствам для лечения инфаркта миокарда и средствам для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, содержащим ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента.

Употребляемый в описании термин “ингибитор IL-6” относится к веществу, которое блокирует опосредованную IL-6 передачу сигнала и ингибирует биологическую активность IL-6. Предпочтительно, ингибитор IL-6 является веществом, которое проявляет ингибиторную активность против связывания IL-6, рецептора IL-6 или gp130.

Ингибиторы IL-6 согласно изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, например, анти-IL-6-антитела, антитела против рецептора IL-6, анти-gp130-антитела, варианты IL-6, растворимые варианты рецептора IL-6 и неполные пептиды IL-6 или рецепторов IL-6 и низкомолекулярные соединения, которые проявляют подобные активности. Предпочтительные ингибиторы IL-6 согласно изобретению включают в себя антитела, которые распознают рецепторы IL-6.

Источник антитела не очень ограничен в настоящем изобретении; однако предпочтительно, если антитело продуцируется клетками млекопитающих и, более предпочтительно, клетками человека.

Анти-IL-6-антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть получено в виде поликлонального или моноклонального антитела известными способами. В частности, моноклональные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, включают в себя антитела, синтезированные гибридомами, и антитела, продуцируемые клетками хозяина, трансформированными экспрессирующим вектором, который включает в себя ген антитела, генно-инженерными методами. Связываясь с IL-6, антитело предотвращает связывание IL-6 с рецептором IL-6 и блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.

Такие антитела включают в себя МН166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956), антитело SK2 (Sato, K. et al., труды 21^st Annual Meeting of the Lapanese Society for Immunology (1991) 21, 166) и пр.

В основном гибридомы, продуцирующие анти-IL-6-антитело, могут быть получены известными методами следующим образом. Точнее, такие гибридомы могут быть получены при использовании IL-6 в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации обычными методами иммунизации, слияния полученных иммунных клеток с известными родительскими клетками обычным методом слияния клеток и скрининга клеток, производящих моноклональное антитело, обычным методом скрининга.

Точнее, анти-IL-6-антитела могут быть получены следующим образом. Например, IL-6 человека, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, может быть получен при использовании гена IL-6 и/или аминокислотных последовательностей, описанных в публикациях Eur. J. Biochem. (1987) 168, 543-550; J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541; и/или Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688.

После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной экспрессирующей векторной системой, введенной с последовательностью гена IL-6, желаемый белок IL-6 очищают известным методом из хозяйской клетки или из культурального супернатанта. Полученный очищенный белок IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Как вариант, слитый белок, составленный из белка IL-6 и другого белка, может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена.

Антитела против рецептора IL-6, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител известными методами. В частности, антитела против рецептора IL-6, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно являются моноклональными антителами, продуцируемыми клетками млекопитающих. Моноклональные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, включают в себя такие антитела, которые получают из гибридом, и такие антитела, которые получают из клеток-хозяев, трансформированных экспрессирующим вектором, содержащим ген антитела, генно-инженерными методами. Путем связывания с рецептором IL-6 антитело предотвращает связывание IL-6 с рецептором IL-6 и блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.

Такие антитела включают в себя антитело MR16-1 (Tamura, T. еt al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928); антитело PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906); антитело AUK12-20, антитело AUK64-7 и антитело AUK146-15 (WO 92/19759), и пр. Среди них антитело РМ-1 может служить примером предпочтительного моноклонального антитела против рецептора IL-6 человека, и антитело MR16-1 - примером предпочтительного моноклонального антитела против рецептора IL-6 мыши.

В сущности, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело против рецептора IL-6, могут быть получены известными методами следующим образом. Точнее, такие гибридомы могут быть получены при использовании рецептора IL-6 в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации обычным методом иммунизации, слияния полученных иммунных клеток с известной родительской клеткой обычным методом слияния клеток и скрининга клеток, продуцирующих моноклональное антитело, обычным методом скрининга.

Точнее, антитела против рецептора IL-6 могут быть получены следующим образом. Например, рецептор IL-6 человека или рецептор IL-6 мыши, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, может быть получен при использовании генов рецептора IL-6 и/или аминокислотных последовательностей, описанных в публикации европейской патентной заявки No. EP 325474 и в публикации японской патентной заявки (Kokai) No. (JP-A) Hei 3-155795, соответственно.

Существует два типа белков-рецепторов IL-6, т.е. белок, экспрессируемый на клеточной мембране, и белок, отделенный от клеточной мембраны (растворимый рецептор IL-6) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Растворимый рецептор IL-6 состоит главным образом из внеклеточной области связанного с клеточной мембраной рецептора IL-6 и отличается от мембраносвязанного рецептора IL-6 тем, что в нем отсутствует трансмембранная область или же как трансмембранная, так и внутриклеточная области. Любой рецептор IL-6 может быть использован в качестве белка-рецептора IL-6, поскольку он может быть использован как сенсибилизирующий антиген для получения антитела против рецептора IL-6, используемого в настоящем изобретении.

После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной экспрессирующей векторной системой, введенной с последовательностью гена рецептора IL-6, желаемый белок-рецептор IL-6 очищают известным методом из хозяйской клетки или из культурального супернатанта. Полученный очищенный белок-рецептор IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. В качестве альтернативы, клетка, экспрессирующая рецептор IL-6 или слитый белок, составленный из белка-рецептора IL-6 и другого белка, может быть использована в качестве сенсибилизирующего антигена.

Анти-gp130-антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител известными методами. В частности, анти-gp130-антитела, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно являются моноклональными антителами, продуцируемыми клетками млекопитающих. Моноклональные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, включают в себя антитела, полученные из гибридом, и антитела, полученные из клеток-хозяев, трансформированных экспрессирующим вектором, который содержит ген антитела, генно-инженерными методами. Путем связывания с gp130 антитело предотвращает связывание gp130 с комплексом IL-6/рецептор IL-6 и блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.

Такие антитела включают в себя антитело АМ64 (JP-A Hei 3-219894); антитело 4B11 и антитело 2Н4 (патент США 5571513); антитело B-S12 и антитело В-Р8 (JP-A Hei 8-291199) и пр.

В сущности, гибридомы, продуцирующие моноклональное анти-gp130-антитело, могут быть получены известными методами следующим образом. Точнее, такие гибридомы могут быть получены при использовании gp130 в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации обычным методом иммунизации, слияния полученных иммунных клеток с известной родительской клеткой обычным методом слияния клеток и скрининга продуцирующих моноклональное антитело клеток обычным методом скрининга.

Точнее, моноклональное антитело может быть получено следующим образом. Например, gp130, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, может быть получен при использовании гена gp130 и/или аминокислотной последовательности, описанной в публикации европейской патентной заявки No. EP 411946.

После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной экспрессирующей векторной системой, введенной с последовательностью гена gp130, желаемый белок gp130 очищают известным методом из хозяйской клетки или из культурального супернатанта. Полученный очищенный белок gp130 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. В качестве альтернативы, клетка, экспрессирующая gp130 или слитый белок, составленный из белка gp130 и другого белка, может быть использована в качестве сенсибилизирующего антигена.

Виды млекопитающих, которые подвергают иммунизации сенсибилизирующим антигеном, не очень ограничены, но предпочтительно их выбирают с учетом совместимости с родительской клеткой, используемой для слияния клеток. Как правило, используют грызунов, таких как мыши, крысы и хомяки.

Иммунизацию животных сенсибилизирующим антигеном осуществляют известными методами. Например, в качестве обычного метода, иммунизацию выполняют путем инъекции млекопитающим сенсибилизирующего антигена внутрибрюшинно или подкожно. В частности, сенсибилизирующий антиген предпочтительно разбавляют или суспендируют в соответствующем количестве забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), физиологического раствора или подобного раствора, смешивают с соответствующим количеством обычного адъюванта (например, полного адъюванта Фрейнда), эмульгируют и затем вводят млекопитающему несколько раз каждые 4-21 день. Кроме того, соответствующий носитель может быть использован для иммунизации сенсибилизирующим антигеном.

После такой иммунизации в сыворотке достигается повышенный уровень желаемого антитела, и затем иммунные клетки получают от млекопитающего для выполнения методики по слиянию клеток. Предпочтительные иммунные клетки, предназначенные для слияния клеток, включают в себя, в частности, клетки селезенки.

Относительно клеток миеломы млекопитающих, которые могут быть использованы в качестве родительской клетки, т.е. клетки-партнера, которую подвергают слиянию с описанными выше иммунными клетками, различные известные штаммы клеток, например, P3X63Ag8.653 (Kearney, J.F. et al., J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133), и пр. используют соответствующим образом.

В сущности, слияние описанной выше иммунной клетки и клетки миеломы может быть осуществлено известными методами, например, методом Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Emzymol. (1981) 73, 3-46), и подобным методом.

Точнее говоря, слияния клеток, описанного выше, достигают в обычной питательной культуральной среде в присутствии усиливающего слияние клеток средства. Например, полиэтиленгликоль (PEG), вирус Sendai (HVJ) и тому подобное используют в качестве усилителя слияния клеток. Для повышения эффективности слияния могут быть добавлены также вспомогательные средства, такие как диметилсульфоксид.

Отношение используемых иммунных клеток и клеток миеломы предпочтительно составляет, например, от 1 до 10 иммунных клеток на каждую клетку миеломы. Культуральная среда, используемая для описанного выше слияния клеток, представляет собой, например, культуральную среду RPMI1640 или MEM, которая подходит для пролиферации описанных выше миеломных клеток. Обычная культуральная среда, используемая для культивирования данного типа клеток, также может быть использована. Кроме того, добавки сыворотки, такой как фетальная телячья сыворотка (FCS), могут быть использованы в комбинации.

Что касается слияния клеток, представляющие интерес слитые клетки (гибридомы) образуются путем смешивания предопределенных количеств описанной выше иммунной клетки и миеломной клетки в указанной выше культуральной среде, и затем путем добавления и смешивания с раствором PEG в концентрации от 30 до 60% (масс./об.) (например, раствор PEG со средней молекулярной массой приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретого приблизительно до 37°С. Затем, средства, усиливающие слияние клеток, и тому подобные, которые не желательны для роста гибридом, могут быть удалены путем повторения стадий последовательного добавления соответствующей культуральной среды и удаления супернатанта центрифугированием.

Описанные выше гибридомы подвергают отбору путем культивирования клеток в обычной избирательной культуральной среде, например, культуральной среде НАТ (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в культуральной среде НАТ продолжается в течение достаточного периода, обычно в течение от нескольких дней до нескольких недель, чтобы уничтожить клетки, отличные от представляющих интерес гибридом (не слитые клетки). Затем осуществляют метод серийных разведений для скрининга и клонирования гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело.

Кроме метода иммунизации животного, отличного от человека, антигеном для получения описанных выше гибридом, желаемое человеческое антитело, которое проявляет способность к связыванию с желаемым антигеном или антиген-экспрессирующей клеткой, может быть получено путем сенсибилизации лимфоцита человека желаемым белком-антигеном или антиген-экспрессирующей клеткой in vitro и слияния сенсибилизированного В-лимфоцита с миеломной клеткой человека (например, U266) (см. публикацию японской патентной заявки (Kokoku) No. (JP-B) Hei 1-59878 (рассмотренная одобренная японская патентная заявка, опубликованная для опротестования). Кроме того, желаемое человеческое антитело может быть получено путем введения антигена или антиген-экспрессирующей клетки трансгенному животному, которое имеет набор генов антитела человека, и затем путем осуществления описанного выше метода (см. международные патентные заявки No. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Полученные таким образом гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, могут быть подвергнуты субкультивированию в обычной культуральной среде, и их можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода.

Для получения моноклональных антител из описанных выше гибридом можно использовать следующие способы: (1) способ, в котором гибридомы культивируют обычными методами, и антитела получают в виде культурального супернатанта; (2) способ, в котором гибридомы быстро размножаются путем введения их совместимому с ними млекопитающему, и антитела получают в виде асцита; и так далее. Первый способ является предпочтительным для получения антител высокой чистоты, а последний способ является предпочтительным для продуцирования антител в большом масштабе.

Например, получение гибридом, продуцирующих антитело против рецептора IL-6, может быть осуществлено способом, описанным в японской патентной заявке JP-A Hei 3-139293. Получение может быть осуществлено способом, включающим в себя инъекцию гибридомы, продуцирующей антитело РМ-1, в абдоминальную полость мыши линии BALB/c, получение асцита и затем очистку антитела РМ-1 из асцита, или способом, включающим в себя культивирование гибридомы в соответствующей среде (например, среде RPMI1640, содержащей 10% фетальной коровьей сыворотки и 5% ВМ-Condimed H1 (Boehringer Mannheim); среде SFM для гибридом (GIBCO-BRL); среде PFHM-II (GIBCO-BRL) и т.д.) и затем получение антитела РМ-1 из культурального супернатанта.

Рекомбинантное антитело может быть использовано в качестве моноклонального антитела согласно изобретению, где антитело получают методом генетической рекомбинации путем клонирования гена антитела из гибридомы, внесения гена в соответствующий вектор и затем внесения вектора в организм хозяина (см. например, публикацию Borrebaeck, C.A.K. and Larrick, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, опубликованную в Великобритании издательством MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990).

Точнее, мРНК (mRNA), кодирующую вариабельную (V) область антитела, выделяют из клетки, которая продуцирует представляющее интерес антитело, такой как гибридома. Выделение мРНК может быть осуществлено путем получения тотальной РНК известными методами, такими как метод ультрацентрифугирования с использованием гуанидина (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) и метод AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), и получения мРНК с использованием набора для очистки мРНК (Pharmacia) и подобными методами. В качестве альтернативы, мРНК может быть непосредственно получена при использовании набора для очистки QuickPrep мРНК (Pharmacia).

кДНК V-области антитела синтезируют из полученной мРНК, используя обратную транскриптазу. Синтез кДНК может быть достигнут при использовании набора для синтеза первой нити кДНК, содержащего обратную транскриптазу AMV (AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit), и так далее. Кроме того, для синтеза и амплификации кДНК может быть использован 5′-RACE-метод (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) с помощью набора 5′-Ampli FINDER RACE (Clontech) и ПЦР (PCR). Представляющий интерес фрагмент ДНК очищают из полученных продуктов ПЦР и затем “сшивают” с вектором ДНК. Затем рекомбинантный вектор получают при использовании описанной выше ДНК и вносят в Echerichia coli или подобную бактерию, и колонии отбирают для получения желаемого рекомбинантного вектора. Нуклеотидная последовательность желаемой ДНК может быть подтверждена, например, дидезокси-методом.

После получения ДНК, кодирующей V-область представляющего интерес антитела, ее сшивают с ДНК, которая кодирует константную область (C-область) желаемого антитела, и вводят в экспрессирующий вектор. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующая V-область антитела, может быть введена в экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую С-области антитела.

Для получения антитела, которое предполагают использовать в настоящем изобретении, как описано ниже, ген антитела вводят в экспрессирующий вектор таким образом, что он экспрессируется под контролем регулирующей экспрессию области, например энхансера и промотора. Затем антитело может быть экспрессировано посредством трансформации клетки-хозяина данным экспрессирующим вектором.

В настоящем изобретении для снижения гетерологичной антигенности против человека и тому подобного могут быть использованы искусственно модифицированные рекомбинантные антитела, например химерные антитела, гуманизированные антитела или человеческие антитела. Указанные модифицированные антитела могут быть получены известными методами.

Химерное антитело может быть получено путем лигирования ДНК, кодирующей V-область антитела, полученной, как описано выше, с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, введения ДНК в экспрессирующий вектор и внесения вектора хозяину для продуцирования антитела (см. публикацию европейской патентной заявки No. EP 125023; публикацию международной патентной заявки No. WO 92/19759). Данный известный метод может быть использован для получения химерных антител, используемых в настоящем изобретении.

Гуманизированные антитела также называют реконструированными человеческими антителами, и они представляют собой антитела, где гипервариабельные участки (CDR) антитела млекопитающего, отличного от человека (например, антитела мыши), переносят в CDR антитела человека. Общие способы данной рекомбинации генов также известны (см. публикацию европейской патентной заявки No. EP 125023, публикацию международной патентной заявки No. WO 92/19759).

Конкретнее, последовательность ДНК, сконструированную таким образом, что CDR антитела мыши сшивают с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют посредством PCR из нескольких олигонуклеотидов, которые должны быть синтезированы с таким расчетом, чтобы содержать перекрывающиеся части на их концах. Полученную ДНК сшивают с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, и затем вносят в экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор вносят в клетки хозяина для продуцирования гуманизированного антитела (см. публикацию европейской патентной заявки No. EP 125023, публикацию международной патентной заявки No. WO 92/19759).

FR антитела человека, которые подвергают сшиванию через CDR, выбирают с таким расчетом, что CDR образуют подходящий антигенсвязывающий участок. Аминокислота(ы) в FR вариабельных областей антитела может быть заменена при необходимости так, что CDR реконструированного антитела человека образуют соответствующий антигенсвязывающий участок (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

С-области антитела человека используют для получения химерных и гуманизированных антител, и они включают в себя Сγ. Например, могут быть использованы Сγ1, Сγ2, Сγ3 или Сγ4. Кроме того, для улучшения стабильности антитела или его продуцирования, С-области антитела человека могут быть модифицированы.

Химерные антитела состоят из вариабельной области антитела, продуцируемого млекопитающими, отличными от человека, и продуцируемого из С-области человеческого антитела; и гуманизированные антитела состоят из CDR антитела, продуцируемого млекопитающими, отличными от человека, и каркасных областей и С-областей, полученных из антитела человека. Оба имеют пониженную антигенность в организме человека, и поэтому они являются пригодными в качестве антител для использования в настоящем изобретении.

Предпочтительные отдельные примеры гуманизированных антител, используемых в настоящем изобретении, включают в себя гуманизированное антитело РМ-1 (см. публикацию международной патентной заявки WO 92/19759).

Кроме того, в дополнение к описанному методу получения человеческого антитела, способы получения человеческих антител “пэннинг”-методом с использованием библиотеки антител человека также известны. Например, возможно экспрессировать вариабельные области антител человека на поверхности фагов в виде одноцепочечных антител (scFv) методом фагового дисплея, и затем выбрать антигенсвязывающие фаги. Путем анализа генов выбранных фагов можно определить последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области антитела человека, которые связываются с антигеном. Как только последовательность scFv ДНК, связывающаяся с антигеном, найдена, соответствующий содержащий указанную последовательность экспрессирующий вектор может быть сконструирован для получения антитела человека. Указанные методы уже известны, и публикации WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388 могут быть использованы в качестве ссылки.

Описанный выше сконструированный ген антитела может быть подвергнут экспрессии обычными методами. В случае, когда используют клетку млекопитающего, ген антитела может быть экспрессирован при использовании ДНК, в которой ген антитела, который должен