Антитела к эфрину в2 и способы их применения

Антитела к эфрину в2 и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данной заявкой испрашивается приоритет согласно 35 USC §119 по отношению к предварительной патентной заявке США № 60/760891, зарегистрированной 20 января 2006 г., полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в основном к областям молекулярной биологии. Более конкретно, изобретение относится к антителам к эфрину В2 и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Развитие системы кровоснабжения является основным требованием для многих физиологических и патологических процессов. Активно растущие ткани, такие как эмбрионы и опухоли, требуют соответствующей системы кровоснабжения. Потребность в этом удовлетворяется за счет продуцирования проангиогенных факторов, которые стимулируют образование новых кровеносных сосудов в результате процесса, называемого ангиогенезом. Образование сосуда представляет собой сложный, но регулярный биологический процесс, включающий все или многие из следующих стадий: a) эндотелиальные клетки (EC) пролиферируют из существующих ECs или дифференцируют из клеток-предшественников; b) EC мигрируют и соединяются с образованием тяжеобразных структур; c) сосудистые тяжи затем претерпевают тубулогенез, образуя сосуды с внутренним просветом; d) существующие тяжи или сосуды выпускают отростки, дающие начало вторичным сосудам; e) исходное сосудистое сплетение претерпевает дальнейшее ремоделирование и реконструирование и f) периэндотелиальные клетки привлекаются для заключения в оболочку эндотелиальных трубок, обеспечивая сосудам поддержку и модуляторные функции; такие клетки включают перициты для мелких капилляров, клетки гладкой мышцы для более крупных сосудов и миокардиальные клетки в сердце. Hanahan, Science 277:48-50 (1997); Hogan & Kolodziej, Nat. Rev. Genet. 3:513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112:19-28 (2003).

В настоящее время точно установлено, что ангиогенез вовлечен в патогенез множества заболеваний. В их число входят солидные опухоли и метастазы, атеросклероз, ретролентальная фиброплазия, гемангиома, хроническое воспаление, внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как пролиферативные ретинопатии, например диабетическая ретинопатия, старческая дегенерация желтого пятна (AMD), неоваскулярная глаукома, иммунное отторжение трансплантированной ткани роговицы и других тканей, ревматоидный артрит и псориаз. Folkman et al., J. Biol. Chem. 267:10931-34 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991) и Garner A., «Vascular diseases» In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), p. 1625-1710.

В случае опухолевого роста ангиогенез очевидно является ключевым фактором для перехода от гиперплазии к неоплазии и для обеспечения питания для роста и метастазирования опухоли. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). Неоваскуляризация позволяет опухолевым клеткам получить ростовое преимущество и пролиферативную автономию по сравнению с нормальными клетками. Опухоль обычно начинается с одной аберрантной клетки, которая может пролиферировать только до размера в несколько кубических миллиметров из-за удаленности от доступного капиллярного ложа, и она может оставаться «дремлющей» без дальнейшего роста и распространения в течение длительного периода времени. Некоторые опухолевые клетки затем переключаются на ангиогенный фенотип для активирования эндотелиальных клеток, которые пролиферируют и созревают в новые капиллярные кровеносные сосуды. Эти заново образованные кровеносные сосуды создают условия не только для дальнейшего роста первичной опухоли, но также и для распространения и реколонизации метастатических опухолевых клеток. Соответственно, наблюдали корреляцию между плотностью микрососудов в опухолевых срезах и выживаемостью пациентов с раком молочной железы, а также в случае с некоторыми другими опухолями. Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-24 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-46 (1992). Точные механизмы, контролирующие ангиогенное переключение, до конца не выяснены, однако считается, что неоваскуляризация опухолевого образования происходит в результате прямого баланса совокупности стимуляторов и ингибиторов ангиогенеза (Folkman, Nat. Med. 1(1):27-31 (1995)).

Процесс развития сосудистой системы строго регулируется. В настоящее время известно, что значительное количество молекул, в основном секретируемых факторов, продуцируемых окружающими клетками, регулирует дифференциацию, пролиферацию, миграцию и объединение EC в тяжеобразные структуры. Например, было установлено, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является ключевым фактором, вовлеченным в стимуляцию ангиогенеза и в индуцирование проницаемости сосудов. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). Тот факт, что утрата даже одной аллели VEGF приводит к эмбриональной летальности, указывает на незаменимую роль данного фактора в развитии и дифференциации кровеносной системы. Более того, было показано, что VEGF является ключевым медиатором неоваскуляризации, связанной с опухолями и внутриглазными болезнями. Ferrara et al., Endocr. Rev., выше. Большинство изученных опухолей человека избыточно экспрессируют мРНК VEGF. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-59 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-35 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-34 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-39 (1995).

Кроме того, уровни концентрации VEGF в глазных жидкостях тесно коррелируют с наличием активной пролиферации кровеносных сосудов у пациентов с диабетической или другими связанными с ишемией ретинопатиями. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-87 (1994). Более того, исследования показали, что VEGF локализован в хориоидальных неоваскулярных мембранах у пациентов, страдающих от AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-68 (1996).

Нейтрализующие антитела к VEGF подавляют рост множества опухолевых клеточных линий человека в голых мышах (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995); Borgström et al., Cancer Res. 56:4032-39 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-24 (1996)), а также ингибируют внутриглазной ангиогенез в моделях ишемических ретинальных заболеваний (Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). Вследствие этого моноклональные антитела к VEGF или другие ингибиторы активности VEGF являются перспективными кандидатами на роль средств для лечения опухолей и различных внутриглазных неоваскулярных заболеваний. Подобные антитела описаны, например, в EP 817648, опубликованном 14 января 1998 г., а также в WO 98/45331 и WO 98/45332, оба опубликованы 15 октября 1998 г. Одно антитело к VEGF, бевацизумаб, получило одобрение FDA для использования в сочетании с режимом химиотерапии при лечении метастатического рака ободочной и прямой кишки (CRC). Бевацизумаб также в настоящее время проходит апробацию во многих клинических испытаниях, направленных на лечение различных симптомов рака.

Лиганд эфрин B2 («эфрин-B2» или «эфрин B2») является членом семейства эфриновых лигандов, которое представляет собой большое семейство тирозинкиназных рецепторов в геноме человека (обзор в Dodelet, Oncogene, 19:5614-5619, 2000). Человеческие тирозинкиназы эфринового лиганда подразделяют в соответствии с идентичностью последовательности на класс A и класс B с соответствующими рецепторами A-типа и B-типа, называемыми Ephs или Eph-рецепторами. Передача сигнала может происходить прямым способом, при котором рецепторная тирозинкиназа активируется лигандом, и обратным способом, при котором трансмембранные лиганды эфрина B активируются путем взаимодействия с рецепторами. Взаимодействия Eph-рецептор-лиганд играют роль в широком диапазоне биологических функций, включая управление аксонами, образование границ тканей, образование и развитие сосудов и клеточную подвижность (Kullander et al. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 3:475-486, 2002; Cheng et al. Cytokine Growth Factor Rev., 13:75-85, 2002; Coulthard et al. Int. J. Dev. Biol., 46:375-384, 2002).

Очевидно, что сохраняется потребность в средствах, которые имеют клинические показатели, оптимальные для их разработки в качестве терапевтических средств. Изобретение, приведенное в данном описании, отвечает данной потребности и обеспечивает другие преимущества.

Полное содержание всех литературных источников, упомянутых в данном описании, включая патентные заявки и публикации, включено в данное описание посредством ссылок.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение частично основано на выявлении различных средств, связывающих эфрин B2 (таких, как антитела и их фрагменты). Эфрин B2 представляет собой важную и полезную терапевтическую мишень, и изобретение относится к композициям и способам, основанным на связывании эфрина B2. Средства по изобретению, связывающие эфрин B2, как описано в данном документе, служат основой важных терапевтических и диагностических средств для применения в выявлении патологических состояний, связанных с экспрессией и/или активностью проводящих путей лиганда эфрина B2. Соответственно, изобретение относится к способам, композициям, наборам и изделиям, относящимся к связыванию эфрина B2.

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связывают (таким, которые специфически связывают) эфрин B2.

В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу к эфрину B2, где полноразмерная IgG-форма антитела специфически связывает человеческий эфрин B2 с аффинностью связывания, равной 30 пм или лучшей. Как хорошо известно в данной области, аффинность связывания лиганда с его рецептором можно определять при помощи любого из множества аналитических методов и выражать в единицах множества количественных величин. Соответственно, в одном варианте осуществления аффинность связывания выражена в значениях Kd и отражает истинную аффинность связывания (например, с минимизированными эффектами авидности). Как правило и предпочтительно, аффинность связывания измеряют in vitro, либо в бесклеточной, либо в связанной с клетками среде. Любой из множества аналитических методов, известных в данной области, включая те, что описаны в данном документе, можно использовать для проведения измерений аффинности связывания, включая, например, Biacore, радиоиммуноанализ (RIA) и ELISA.

В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу, которое связывает область эфрина B2, связывающую Eph-рецептор (такой, как EphB1, EphB2 и/или EphB3).

В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу, которое связывает полипептид, содержащий, состоящий из или состоящий в основном из внеклеточного домена эфрина B2.

В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу к эфрину B2, которое конкурирует с Eph-рецептором (таким, как EphB1, EphB2, EphB3) за связывание эфрина B2.

В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу к эфрину B2, которое ингибирует, снижает и/или блокирует активность эфрина B2. В некоторых вариантах осуществления ингибируется, снижается и/или блокируется аутофосфорилирование эфрина B2.

В одном аспекте антитело к эфрину В2 по изобретению содержит:

(a) по меньшей мере, одну, две, три, четыре или пять последовательностей гипервариабельной области (HVR), выбранных из группы, состоящей из:

(i) HVR-L1, включающей последовательность A1-A11, где A1-A11 представляет собой RASQDVSTAVA (SEQ ID №:6),

(ii) HVR-L2, включающей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой SASFLYS (SEQ ID №:8),

(iii) HVR-L3, включающей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой EQTDSTPPT (SEQ ID №:12),

(iv) HVR-H1, включающей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GFTVSSGWIH (SEQ ID №:2),

(v) HVR-H2, включающей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой AVIFHNKGGTDYADSVKG (SEQ ID №:4) и

(vi) HVR-H3, включающей последовательность F1-F14, где F1-F14 представляет собой ARTSAWAQLGAMDY (SEQ ID №:5); и

(b) по меньшей мере, одну вариантную HVR, где вариантная последовательность HVR содержит модификацию, по меньшей мере, одного остатка в последовательности, представленной в SEQ ID №:1-12.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, где каждая HVR содержит, состоит из или состоит в основном из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №: 1-12, и где SEQ ID №:6 или 7 соответствуют HVR-L1, SEQ ID №:8 или 9 соответствуют HVR-L2, SEQ ID №:10, 11 или 12 соответствуют HVR-L3, SEQ ID №:1 или 2 соответствуют HVR-H1, SEQ ID №:3 или 4 соответствуют HVR-H2 и SEQ ID №:5 соответствует HVR-H3.

В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая по порядку включает SEQ ID №:6, 8, 10, 1, 3, 5.

В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая по порядку включает SEQ ID №:7, 9, 11, 1, 3, 5.

В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая по порядку включает SEQ ID №:6, 8, 12, 2, 4, 5.

Вариантные HVR в антителе по изобретению могут иметь модификации одного или более (например, двух, трех, четырех, пяти или более) остатков в составе HVR.

В одном варианте осуществления вариант HVR-L1 содержит 1-4 (1, 2, 3 или 4) замены в следующих положениях в любом их сочетании: A7 (S или D); A8 (T или S); A9 (A или S) и A10 (V или L).

В одном варианте осуществления вариант HVR-L2 содержит 1-3 (1, 2 или 3) замены в следующих положениях в любом их сочетании: B1 (S или A); B4 (F или N) и B6 (Y или E).

В одном варианте осуществления вариант HVR-L3 содержит 1-6 (1, 2, 3, 4, 5 или 6) замен в следующих положениях в любом их сочетании: C1 (Q или E); C3 (S или T); C4 (Y или D); C5 (T, D или S); C6 (T или N) и C8 (P или F).

В одном варианте осуществления вариант HVR-H1 содержит 1-4 (1, 2, 3 или 4) замены в следующих положениях в любом их сочетании: D4 (I или V); D5 (T или S); D6 (G или S) и D7 (S или G).

В одном варианте осуществления вариант HVR-H2 содержит 1-4 (1, 2, 3 или 4) замены в следующих положениях в любом их сочетании: E4 (Y или F); E5 (P или H); E7 (N или K) и E9 (A или G).

В одном варианте осуществления вариант HVR-H3 содержит 1-14 замен в следующих положениях: F1 (A); F2 (R); F3 (T); F4 (S); F5 (A); F6 (W); F7 (A); F8 (Q); F9 (L); F10 (G); F11 (A); F12 (M); F13 (D) и F14 (Y). Буква(ы) в скобках после каждого положения обозначает иллюстративную аминокислоту для замещения (то есть замены); как является очевидным для специалиста в данной области, возможность использования других аминокислот в качестве аминокислот для замены в контексте данного описания можно осуществить в рабочем порядке, используя методики, известные в данной области и/или описанные в данном документе.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему область HVR-H1, включающую последовательность SEQ ID №:1 или 2. В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему область HVR-H2, включающую последовательность SEQ ID №:3 или 4. В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему область HVR-H3, включающую последовательность SEQ ID №:5. В одном варианте осуществления изобретение относится к антителу, содержащему область HVR-L1, включающую последовательность SEQ ID №:6 или 7. В одном варианте осуществления изобретение относится к антителу, содержащему область HVR-L2, включающую последовательность SEQ ID №:8 или 9. В одном варианте осуществления изобретение относится к антителу, содержащему область HVR-L3, включающую последовательность SEQ ID №:10, 11 или 12.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три из следующих:

(i) последовательность HVR-H1, включающую последовательность SEQ ID №:2;

(ii) последовательность HVR-H2, включающую последовательность SEQ ID №:4;

(iii) последовательность HVR-H3, включающую последовательность SEQ ID №:5.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, содержащему, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три из следующих:

(i) последовательность HVR-L1, включающую последовательность SEQ ID №:6;

(ii) последовательность HVR-L2, включающую последовательность SEQ ID №:8;

(iii) последовательность HVR-L3, включающую последовательность SEQ ID №:12.

Аминокислотные последовательности SEQ ID №:1-12 пронумерованы, принимая во внимание отдельные HVR (то есть H1, H2 или H3), как указано на фигуре 1, нумерация соответствует системе нумерации Kabat, как описано ниже.

В одном аспекте изобретение относится к антителам, содержащим последовательности HVR тяжелой цепи, как указано на фигуре 1.

В одном аспекте изобретение относится к антителам, содержащим последовательности HVR легкой цепи, как указано на фигуре 1.

Некоторые варианты осуществления антител по изобретению содержат вариабельный домен легкой цепи гуманизированного антитела 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также упомянутого в патенте США № 6407213 и в Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93), как представлено ниже в SEQ ID №:13.

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID №:13) (остатки HVR подчеркнуты).

В одном варианте осуществления последовательность вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 модифицирована по одному или более положениям 30, 66 и 91 (Asn, Arg и His соответственно, как указано выше жирным шрифтом/курсивом). В одном варианте осуществления модифицированная последовательность huMAb4D5-8 содержит Ser в положении 30, Gly в положении 66 и/или Ser в положении 91. Соответственно, в одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность, представленную ниже в SEQ ID №:14:

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID №:14) (остатки HVR подчеркнуты).

Замененные остатки относительно huMAb4D5-8 указаны выше жирным шрифтом/курсивом.

Антитела по изобретению могут содержать любую подходящую каркасную последовательность вариабельного домена, при условии что связывающая активность в отношении эфрина B2 в основном сохраняется. Например, в некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат каркасную консенсусную последовательность тяжелой цепи подгруппы III человека. В одном варианте осуществления данных антител каркасная консенсусная последовательность содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах осуществления данных антител положение 71 представляет собой A, 73 представляет собой T и/или 78 представляет собой A. В одном варианте осуществления данные антитела содержат каркасные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также упомянутого в патентах США № 6407213 и 5821337, а также в Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93). В одном варианте осуществления данные антитела дополнительно содержат каркасную консенсусную последовательность легкой цепи κI человека. В одном варианте осуществления данные антитела содержат последовательности HVR легкой цепи huMAb4D5-8, как описано в патентах США № 6407213 и 5821337). В одном варианте осуществления данные антитела содержат последовательности вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также упомянутого в патентах США № 6407213 и 5821337, а также в Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93).

В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID №: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 и/или 37, а последовательности H1, H2 и H3 HVR включают SEQ ID №:2, 4 и/или 5 соответственно. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID №:38, 39, 40 и/или 41, а последовательности L1, L2 и L3 HVR включают SEQ ID №:6, 8 и/или 12 соответственно.

В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID №:42, 43, 44, 8 и/или 45, а последовательности H1, H2 и H3 HVR включают SEQ ID №:1, 3 и/или 5 соответственно. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID №:15, 16, 17 и/или 18, а последовательности L1, L2 и L3 HVR включают SEQ ID №:6, 8 и/или 10 соответственно.

В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID №:42, 43, 47 и/или 45, а последовательности H1, H2 и H3 HVR включают SEQ ID №:1, 3 и/или 5 соответственно. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность включает последовательность SEQ ID №:15, 16, 47 и/или 18, а последовательности L1, L2 и L3 HVR включают SEQ ID №:7, 9 и/или 11 соответственно.

В одном варианте осуществления проводят созревание аффинности антитела по изобретению, чтобы получить желаемую аффинность связывания мишени. В одном примере аффинно зрелое антитело по изобретению содержит замену в одном или большем количестве аминокислотных положений H29, H30, H31, H32, H52, H52a, H54, H56, L30, L31, L32, L33, L50, L53, L55, L89, L91, L92, L93, L94 и L96. В одном примере аффинно зрелое антитело по изобретению содержит одну или большее количество следующих замен: (a) в тяжелой цепи V29I, S30T, S31G, G32S, F52Y, H52aP, K54N и G56A или (b) в легкой цепи S30D, T31S, A32S, V33L, S50A, F53N, Y55E, E89Q, T91S, D92Y, S93D или T, T94N и P96F.

В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:49. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:48. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:49, и вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:48.

В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:51. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:50. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:51, и содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:50.

В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:53. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:52. В одном варианте осуществления антитело по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:53, и вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID №:52.

В одном аспекте изобретение относится к антителу, которое конкурирует с любым из вышеуказанных антител за связывание с эфрином B2. В одном аспекте изобретение относится к антителу, которое связывается с тем же самым или схожим эпитопом на эфрине B2, что и любое из вышеуказанных антител.

Как известно в данной области и как описано более подробно ниже в данном описании, аминокислотная положение/граница, определяющая размеры гипервариабельной области антитела, может варьировать в зависимости от контекста и различных определений, принятых в данной области (как описано ниже). Некоторые положения внутри вариабельного домена могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения, поскольку данные положения могут считаться находящимися внутри гипервариабельной области по одному набору критериев, в то же время рассматриваться как находящиеся за пределами гипервариабельной области по другому набору критериев. Одно или большее количество данных положений можно также обнаружить в протяженных гипервариабельных областях (как дополнительно определено ниже).

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой поликлональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело выбирают из группы, состоящей из химерного антитела, аффинно зрелого антитела, гуманизированного антитела и человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂ или scFv.

В одном варианте осуществления антитело представляет собой химерное антитело, например антитело, содержащее антигенсвязывающие последовательности донора, отличного от человека, перенесенные в гетерологичную не принадлежащую человеку, человеческую или гуманизированную последовательность (например, последовательности каркаса и/или константного домена). В одном варианте осуществления донор, отличный от человека, представляет собой мышь. В одном варианте осуществления антигенсвязывающая последовательность является синтетической, например, полученной при помощи мутагенеза (например, скрининг фаговым дисплеем и так далее). В одном варианте осуществления химерное антитело по изобретению имеет мышиные V-области и человеческую C-область. В одном варианте осуществления V-область легкой цепи мыши является слитой с легкой цепью каппа человека. В одном варианте осуществления V-область тяжелой цепи мыши является слитой с C-областью IgG1 человека.

Гуманизированные антитела по изобретению включают такие, которые имеют аминокислотные замены в FR, а также аффинно зрелые варианты с изменениями в привнесенных CDR. Замещенные аминокислоты в CDR или FR не ограничиваются теми, что присутствуют в антителе донора или реципиента. В других вариантах осуществления антитела по изобретению дополнительно имеют изменения в аминокислотных остатках в Fc-области, что ведет к улучшенной эффекторной функции, включая усиленную функцию CDC и/или ADCC и B-клеточный лизис. Другие антитела по изобретению включают такие, которые имеют специфические изменения, повышающие стабильность. В других вариантах осуществления антитела по изобретению имеют изменения в аминокислотных остатках в Fc-области, что ведет к пониженной эффекторной функции, например пониженной функции CDC и/или ADCC и/или пониженному B-клеточному лизису. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению характеризуются более слабым связыванием (таким, как отсутствие связывания) с человеческим фактором комплемента C1q и/или человеческим Fc-рецептором на естественных киллерных (NK) клетках. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению характеризуются более слабым связыванием (таким, как отсутствие связывания) с человеческим FcγRI, FcγRIIA и/или FcγRIIIA. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению относятся к IgG классу (например, IgG1 или IgG4) и содержат, по меньшей мере, одну мутацию в E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 и/или P329 (система нумерации ЕС). В некоторых вариантах осуществления антитела содержат мутацию L234A/L235A или D265A/N297A.

В одном аспекте изобретение относится к анти-эфрин B2 полипептидам, содержащим любую из антигенсвязывающих последовательностей, представленных в данном описании, где анти-эфрин B2 полипептиды специфически связывают эфрин B2.

Антитела по изобретению связывают (а именно, специфически связывают) эфрин B2 и в некоторых вариантах изобретения могут модулировать один или более аспектов связанных с эфрином B2 эффектов, включая, но не ограничиваясь ими, активацию эфрина B2, молекулярную передачу сигнала в нисходящем направлении эфрином B2, активацию связывающего эфрин B2 Eph-рецептора (например, EphB1, EphB2 и/или EphB3), молекулярную передачу сигнала в нисходящем направлении связывающим эфрин B2 Eph-рецептором (например, EphB1, EphB2 и/или EphB3), нарушение связывания связывающего эфрин B2 Eph-рецептора (например, EphB1, EphB2 и/или EphB3) с эфрином B2, фосфорилирование эфрина B2 и/или мультимеризацию эфрина B2, и/или фосфорилирование связывающего эфрин B2 Eph-рецептора, и/или нарушение любого биологически значимого проводящего пути эфрина B2 и/или связывающего эфрин B2 Eph-рецептора (например, EphB1, EphB2 и/или EphB3), и/или лечение и/или профилактику опухоли, пролиферативного клеточного заболевания или рака; и/или лечение или профилактику заболевания, связанного с экспрессией и/или активностью эфрина B2 (а именно, повышенной экспрессией и/или активностью эфрина B2). В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению специфически связывается с эфрином B2. В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывается с внеклеточным доменом эфрина B2 (ECD). В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывается с полипептидом, состоящим из или в основном состоящим из внеклеточного домена эфрина B2. В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывает эфрин B2 с Kd, равной 30 пм или сильнее. В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению снижает, ингибирует и/или блокирует активность эфрина B2 in vivo и/или in vitro. В некоторых вариантах осуществления антитело снижает, ингибирует и/или блокирует аутофосфорилирование эфрина B2. В некоторых вариантах осуществления антитело конкурирует за связывание (уменьшает и/или блокирует) со связывающим эфрин B2 Eph-рецептором (например, EphB1, EphB2 и/или EphB3).

В одном аспекте изобретение относится к использованию антитела по изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или пролиферативное клеточное нарушение. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой невропатию или нейродегенеративное заболевание.

В одном аспекте изобретение относится к композициям, содержащим одно или более антител по изобретению и носитель. В одном варианте осуществления носитель является фармацевтически приемлемым.

В одном аспекте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитело к эфрину В2 по изобретению.

В одном аспекте изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению.

В одном аспекте изобретение относится к композициям, содержащим одну или более нуклеиновых кислот по изобретению и носитель. В одном варианте осуществления носитель является фармацевтически приемлемым.

В одном аспекте изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор по изобретению. Вектор может быть любого типа, например рекомбинантный вектор, такой как вектор экспрессии. Можно использовать любые из множества клеток-хозяев. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, например E. coli. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомячка (CHO).

В одном аспекте изобретение относится к способам получения антитела по изобретению. Например, изобретение относится к способам получения антитела к эфрину В2 (которое, как определено в данном описании, включает полноразмерное антитело и его фрагменты), указанный способ включает экспрессирование в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора по изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и извлечение указанного антитела.

В одном аспекте изобретение относится к изделию, представляющему собой контейнер, и композиции, заключенной в контейнере, где композиция содержит одно или более антител к эфрину B2 по изобретению. В одном варианте осуществления композиция содержит нуклеиновую кислоту по изобретению. В одном варианте осуществления композиция, содержащая антитело, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления изделие по изобретению дополнительно включает инструкции по введению композиции (например, антитела) субъекту (такие, как инструкции для любого из способов, описанных в данном документе).

В одном аспекте изобретение относится к набору, включающему первый контейнер, содержащий композицию, содержащую одно или более антител к эфрину B2 по изобретению, и второй контейнер, содержащий буферный раствор. В одном варианте осуществления буферный раствор является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления композиция, содержащая антитело, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления набор дополнительно включает инструкции по введению композиции (например, антитела) субъекту.

В одном аспекте изобретение относится к использованию антитела к эфрину В2 по изобретению для создания лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или пролиферативное клеточное нарушение. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой невропатию или нейродегенеративное заболевание. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой патологическое состояние, связанное с ангиогенезом.

В одном аспекте изобретение относится к использованию антитела по изобретению для создания лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза.

В одном аспекте изобретение относится к использованию нуклеиновой кислоты по изобретению для создания лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или пролиферативное клеточное нарушение. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой невропатию или нейродегенеративное заболевание. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой патологическое состояние, связанное с ангиогенезом.

В одном аспекте изобретение относится к использованию вектора экспрессии по изобретению для создания лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или пролиферативное клеточное нарушение. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой невропатию или нейродегенеративное заболевание. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой патологическое состояние, связанное с ангиогенезом.

В одном аспекте изобретение относится к использованию клетки-хозяина по изобретению для создания лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или пролиферативное клеточное нарушение. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой невропатию или нейродегенеративное заболевание. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой патологическое состояние, связанное с ангиогенезом.

В одном аспекте изобретение относится к использованию изделия по изобретению для создания лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или пролиферативное клеточное нарушение. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой невропатию или нейродегенеративное заболевание.

В одном аспекте изобретение относится к использованию набора по изобретению для создания лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или пролиферативное клеточное нарушение. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой невропатию или нейродегенеративное заболевание. В некоторых вариантах осуществления нарушение представляет собой патологическое состояние, связанное с ангиогенезом.

Изобретение относится к способам и композициям, полезным для модулирования болезненных состояний, связанных с экспрессией и/или активностью эфрина B2, такой как повышенная или пониженная экспрессия и/или активность либо нежелательная экспрессия и/или активность.

В одном аспекте изобретение относится к способам лечения или профилактики опухоли, рака и/или пролиферативного клеточного нарушения, связанного с повышенной экспрессией и/или активностью эфрина B2, где способы включают введение эффективного количества антитела к эфрину В2 субъекту, нуждающемуся в подобном лечении.

В одном аспекте изобретение относится к способам лизиса клетки (такой, как раковая или опухолевая клетка), где способы в