Антитело против pannrpa (варианты)

Антитело против pannrpa (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к кристаллическим структурам фрагментов нейропилина 1 (Nrp1) и нейропилина 2 (Nrp2) как в виде одиночных фрагментов, так и в комплексе с антителами к нейропилину, а также к их применению. Дополнительно в изобретении предлагаются антитела, связывающиеся с Nrp1 и/или Nrp2, и способы их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Развитие сосудистой системы является фундаментальной потребностью для многих физиологических и патологических процессов. Активно растущие ткани, например эмбриональные и опухолевые, требуют достаточного кровоснабжения. Они удовлетворяют эту потребность, вырабатывая проангиогенные факторы, которые стимулируют образование и поддержание новых кровеносных сосудов посредством процесса, обычно называемого ангиогенезом. Образование сосудов представляет собой сложное, но упорядоченное биологическое явление, включающее все или многие из следующих этапов: a) эндотелиальные клетки (EC) пролиферируют из существующих EC или дифференцируются из клеток предшественников; b) EC мигрируют и сливаются, образуя тяжевидные структуры; c) затем сосудистые тяжи проходят тубулогенез, формируя сосуды с центральным просветом; d) существующие тяжи или сосуды выпускают отростки, формируя вторичные сосуды; e) примитивное сосудистое сплетение проходит дальнейшее ремоделирование и структурную перестройку; и f) привлекаются периэндотелиальные клетки, заключающие в оболочку эндотелиальные трубки, что обеспечивает сосудам поддерживающую и модулирующую функцию: такие клетки включают перициты для мелких капилляров, гладкие мышечные клетки для более крупных сосудов и миокардиальные клетки в сердце. Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997); Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002); Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112: 19-28 (2003).

В настоящее время точно установлено, что ангиогенез участвует в патогенезе множества нарушений. К таким нарушениям относятся солидные опухоли и метастазы, атеросклероз, ретролентальная фиброплазия, гемангиомы, хроническое воспаление, внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как пролиферативные ретинопатии, например диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), неоваскулярная глаукома, иммунное отторжение пересаженной ткани роговицы и других тканей, ревматоидный артрит и псориаз. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); and Garner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710.

В случае опухолевого роста ангиогенез критически важен для перехода от гиперплазии к неоплазии, а также для обеспечения питания, необходимого для роста и метастазирования опухоли. Folkman et al, Nature 339:58 (1989). Неоваскуляризация позволяет опухолевым клеткам достичь эффективности роста и пролиферативной автономии, сравнимых с нормальными клетками. Опухоль обычно начинается с одной аберрантной клетки, которая может пролиферировать только до размера нескольких кубических миллиметров вследствие удаленности от доступного капиллярного ложа и может длительное время пребывать в "спящем" состоянии без дальнейшего роста и диссеминации. Те же опухолевые клетки впоследствии переключаются на ангиогенный фенотип, активируя эндотелиальные клетки, которые пролиферируют и созревают в новые капиллярные кровеносные сосуды. Такие вновь сформированные кровеносные сосуды создают возможность не только для продолжения роста первичной опухоли, но и для рассеивания и реколонизации метастатических опухолевых клеток. В соответствии с этим наблюдается корреляция между плотностью микрососудов в срезах опухолей и выживаемостью больных при раке молочной железы и ряде других опухолей. Weidner et al, N. Engl. J. Med 324: 1-6 (1991); Horak et al, Lancet 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340: 145-146 (1992). Точные механизмы, регулирующие переключение на ангиогенез, не вполне понятны, но полагают, что неоваскуляризация опухолевой массы обусловлена прямым балансом по численности между стимуляторами и ингибиторами ангиогенеза (Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31).

Процесс развития сосудов строго регулируется. К настоящему времени выявлено большое число молекул, главным образом секретируемых окружающими клетками, которые регулируют дифференциацию, пролиферацию, миграцию и слияние EC в тяжевидные структуры. Например, в качестве ключевого фактора, вовлеченного в стимуляцию ангиогенеза и в индуцирование сосудистой проницаемости, был идентифицирован фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Ferrara et al, Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). Обнаружение того факта, что утрата даже одного аллеля VEGF приводит к летальнеому исходу эмбриона, указывает на незаменимую роль этого фактора в развитии и дифференциации сосудистой системы. Кроме того, было продемонстрировано, что VEGF является ключевым медиатором неоваскуляризации, связанной с опухолями и внутриглазными заболеваниями. Ferrara et al., Endocr. Rev. выше. Проведенные исследования показали, что большинство опухолей человека сверхэкспрессируют мРНК VEGF. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91: 153-159 (1993); Brown et al, Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al, Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al, Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996); Dvorak et al, Am. J. Pathol. 146: 1029-1039 (1995).

Уровни концентрации VEGF в глазной жидкости проявляют высокую корреляцию с наличием активной пролиферации кровеносных сосудов у больных с диабетической и другими связанными с ишемией ретинопатиями. Aiello et al, N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994). Кроме того, исследования продемонстрировали, что у больных, пораженных AMD, VEGF локализован в хориоидальных неоваскулярных мембранах. Lopez et al, Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 37:855-868 (1996).

Нейтрализующие антитела против VEGF подавляют рост множества клеточных линий опухолей человека у голых мышей (Kim et al, Nature 362:841-844 (1993); Warren et al, J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgström et al, Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al, Cancer Res. 56:921-924 (1996)), а также подавляют внутриглазной ангиогенез в моделях ишемических нарушений сетчатки. Adamis et al, Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996). Следовательно, моноклональные антитела против VEGF или другие ингибиторы действия VEGF являются перспективными кандидатами на роль средств для лечения опухолей и различных внутриглазных неоваскулярных нарушений. Такие антитела описаны, например, в документах EP 817648, опубликованном 14 января 1998 г., и WO98/45331, и WO98/45332, опубликованных 15 октября 1998 г. Одно из антител против VEGF, бевацизумаб (bevacizumab), было разрешено FDA для применения в комбинации с химиотерапией для лечения метастатического колоректального рака (CRC) и немелкоклеточного рака легких (NSCLC). Бевацизумаб в настоящее время также исследуется во многих продолжающихся клинических испытаниях по лечению различных раковых заболеваний.

В ходе развития нервной системы нейроны выпускают аксоны (типа кабелей), которые мигрируют на большие расстояние, чтобы достичь своих мишеней. Смотри обзор Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005) Nature 436:193-200. На переднем конце растущего аксона имеется высокоподвижная сенсорная структура, называемая конусом роста. Через динамические циклы вытягивания и втягивания филоподиальных удлинений конус роста постоянно воспринимает и оценивает сигналы от мириад направляющих раздражителей в окружающем его пространстве, точно выбирая правильный маршрут для удлинения по направлению к своей конечной мишени.

За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в понимании механизма направленного движения аксонов. Смотри обзор Dickson (2002) Science 298:1959-64. Направляющие раздражители существуют в четырех разновидностях: аттрактанты и репелленты, которые могут действовать или на коротком расстоянии (то есть ассоциированы с клетками или матриксом) или на более дальнем расстоянии (то есть способны к диффузии). До сих пор были идентифицированы четыре основных семейства молекул, направляющих аксоны: нетрины, семафорины, эфрины и белки, носящие название slit-протеины. Смотри обзор Huber et al (2003) Annu Rev Neurosci 26:509-63.

Семафорины (Sema), также называемые коллапсинами, относятся к большому семейству филогенетически консервативных секретируемых и связанных с мембранами белков. Члены семейства семафоринов способны в процессе развития нервной системы опосредовать как отталкивающие, так и притягивающие импульсы в наведении аксонов. Raper (2000) Curr Opin Neurobiol 10:88-94. К настоящему времени идентифицированы более тридцати семафоринов, причем все они имеют общий консервативный N-концевой домен Sema, состоящий приблизительно из 500 аминокислот. Члены семейства семафоринов классифицируются на восемь подсемейств в зависимости от их структурного сходства и биологического (видового) происхождения. Для более подробной информации об унифицированной номенклатуре семафоринов, смотри Semaphorin Nomenclature Committee (1999) Cell 97:551-552.

Семейство нейропилина (NRP) состоит из двух гомологичных белков, нейропилина-1 (NRP1) и нейропилина-2 (NRP2). NRP1 был впервые идентифицирован как трансмембранный гликопротеин типа I с молекулярной массой 130 кДа, экспрессируемый на конусах роста растущих аксонов. Позднее на основе экспрессионного клонирования был идентифицирован NRP2. Fujisawa and Kitsukawa (1998) Curr Opin Neurobiol 8:587-592. Обнаружено, что NRP являются рецепторами подгруппы семафоринов (семафоринов класса 3). Было высказано предположение о том, что NRP функционируют как несигнальные корецепторы, наряду с другим семейством рецепторов семафоринов, плексинами.

Хотя первоначально NRP были описаны как медиаторы направления аксонов, было также обнаружено, что они играют критически важную роль в развитии сосудов. Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005). Они идентифицированы как изоформспецифические рецепторы VEGF, экспрессируемые на опухолевых и эндотелиальных клетках, что свидетельствует о необходимости направить значительные усилия на выяснение роли NRP в сосудистой и опухолевой биологии. Soker et al (1998) Cell 92:735-745; Klagsbrun et al (2002) Adv Exp Med Biol 515:33-48. Генетические исследования дали строгие доказательства того, что Nrp1 необходим для сосудистого морфогенеза. Утрата функции Nrp1 приводит к ремоделированию сосудов и дефектам ветвления, фенотипу, который дополнительно усиливается при утрате функции Nrp2. Kawasaki et al. (1999) Development 126:4895- 4902; Takashima et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:3657-3662. Эти результаты позволяют предположить, что на ранних этапах развития Nrp1 и Nrp2 могут иметь перекрывающиеся функции. Однако на более поздних этапах развития экспрессия каждого Nrp разделяется, причем Nrp1 экспрессируется, главным образом, в артериях, а Nrp2 в венах и лимфатических сосудах. Yuan et al (2002) Development 129:4797-4806; Herzog et al. (2001) Mech Dev 109:115-119. Примечательно, что изолированная утрата функции Nrp2 специфическим образом нарушает развитие лимфатической системы.

Поскольку Nrp1 в период развития экспрессируется во многих других типах клеток, роль сосудистого Nrp1 изучали посредством генерирования EC-специфического генного нокаута, который приводил к развитию сходных сосудистых дефектов с нулевым аллелем. Gu et al. (2003) Dev Cell 5:45-57. Интересно, что это исследование также показало, что связывание Sema3A с NRP1 не обязательно для развитие сосудистой системы. Еще в одном исследовании наблюдались дефекты направления верхней части эндотелиальных клеток при развитии заднего мозга у эмбрионов Nrp1 KO. Gerhardt et al. (2004) Dev Dyn 231:503-509.

Несмотря на обширные исследования роли NRP1 в развитии сосудистой системы, остается неясным, реализует ли NRP1 свою сосудистую функцию исключительно через метаболический путь рецептора VEGF-VEGF 2 (VEGFR2), действуя как усилитель связывания VEGF с VEGFR2 и, следовательно, как сигнальный фактор для VEGFR2, или через сигнальный путь, независимый от VEGFR2, или через комбинацию обоих указанных метаболических путей.

Моноклональные антитела можно получать, применяя технологию рекомбинантной ДНК. Моноклональные антитела, особенно полученные от грызунов, нашли самое широкое применение, однако антитела нечеловеческого происхождения часто оказываются антигенными для человека. В данной области техники предпринимались попытки для преодоления этой проблемы, связанные с конструированием "химерных" антител, в которых антигенсвязывающий домен нечеловеческого происхождения сочленен с константным доменом человека (Cabilly et al., патент США № 4816567). Изотип константного домена человека можно выбирать с таким расчетом, чтобы придать химерному антителу способность участвовать в антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности. В дальнейших попытках разрешить антигенсвязывающие функции антител и свести к минимуму применение гетерологичных последовательностей в антителах человека, к различным антигенам были генерированы гуманизированные антитела, в которых значительно меньшая часть последовательности, чем интактный вариабельный домен человека, была замещена в некоторых участках соответствующей последовательностью от биологических видов, отличных от человека. Например, остатки из последовательностей грызунов подставлялись в соответствующие сегменты антител человека. В практическом аспекте гуманизированные антитела представляют собой типичные антитела человека, в которых некоторые остатки гипервариабельного участка (CDR) и, возможно, некоторые остатки каркасного участка (FR) замещены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов. Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536.

Перед тем как терапевтическое антитело будет вводиться человеку, желательно провести доклинические исследования на млекопитающих, отличных от человека, с тем, чтобы оценить эффективность и/или токсичность антитела. В идеальном случае антитела, являющиеся предметом таких исследований, способны распознавать целевой антиген, эндогенный для животного хозяина, например мыши или нечеловекообразного примата, и взаимодействовать с ним с высокой эффективностью.

Технология фагового дисплея предоставила мощный инструмент для генерирования и отбора новых белков, способных связываться с таким лигандом как антиген. Применяя методику фагового дисплея, можно создавать большие библиотеки вариантов белков и быстро сортировать их для отбора тех последовательностей, которые с высокой аффинностью способны связываться с целевым антигеном. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариантные полипептиды, сливают с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих оболочечный белок вируса, например белок гена III или белок гена VIII. Были разработаны моновалентные системы фагового дисплея, в которых последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок или полипептид, слита с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка гена III. (Bass, S. (1990) Proteins 8:309; Lowman and Wells (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3:205). В моновалентной системе фагового дисплея слияние генов экспрессируется на низком уровне, а белки гена III дикого типа также экспрессируются таким образом, что сохраняется инвазионная способность частиц. Способы создания библиотек пептидов и скрининга этих библиотек были раскрыты во многих патентах (например, патент США № 5723286, патент США № 5432 018, патент США № 5580717, патент США № 5427908 и патент США № 5498530).

Важной для разработки библиотек фагового дисплея антител оказалась демонстрация экспрессии пептидов на поверхности нитевидного фага и экспрессии функциональных фрагментов антител в периплазме E. Coli. (Smith et al. (1985) Science 228:1315; Skerra and Pluckthun (1988) Science 240:1038). Библиотеки антител или антигенсвязывающих полипептидов были получены множеством способов, включая изменение единичного гена путем инсерции случайных последовательностей ДНК или посредством клонирования семейства родственных генов. Способы демонстрации антител или антигенсвязывающих фрагментов с применением фагового дисплея были описаны в патентах США №№ 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 и 5658727. Затем библиотеку скринируют на экспрессию антител или антигенсвязывающих белков, обладающих желаемыми свойствами.

Технология фагового дисплея имеет несколько преимуществ перед традиционными гибридомными и рекомбинантными методами в получении антител с желаемыми характеристиками. Эта технология позволяет создавать большие библиотеки антител с разными последовательностями за меньшее время и без использования животных. Для подготовительных работ с целью получения гибридом или гуманизированных антител, бесспорно, может потребоваться несколько месяцев. В дополнение к этому, поскольку не требуется иммунизация, можно создавать фаговые библиотеки антител для тех антигенов, которые токсичны или обладают низкой антигенностью (Hogenboom (1988) Immunotechniques 4:1-20). Фаговые библиотеки антител также можно использовать для создания и идентификации новых терапевтических антител.

Библиотеки фагового дисплея были использованы для создания антител человека из иммунизированных и неиммунизированных последовательностей зародышевых линий человека или из репертуара Ig не подвергавшихся каким-либо воздействиям B-клеток (Barbas & Burton(1996) Trends Biotech 14:230; Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13:3245; Vaughan et al. (1996) Nat. Biotech. 14:309; Winter EP 0368 684 B1). Не подвергавшиеся каким-либо воздействиям антигенсвязывающие библиотеки создавались с применением разнообразных лимфоидных тканей. Некоторые из этих библиотек имеются в продаже, например библиотеки, разработанные компанией Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan et al. (1996) Nature Biotech 14:309; Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57). Однако многие из этих библиотек имеют ограниченное разнообразие.

Способность идентифицировать и выделять высокоаффинные антитела из библиотеки фагового дисплея важна для получения новых антител в целях их терапевтического применения. Возможность выделения высокоаффинных антител из библиотеки зависит от размера библиотеки, эффективности продуцирования в бактериальных клетках и от разнообразия библиотеки. Смотри, например, Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57. Размер библиотеки уменьшается при неэффективности продукции вследствие неправильного свертывания антитела или антигенсвязывающего белка или из-за наличия стоп-кодона. Экспрессия в бактериальных клетках может быть подавлена, если антитело или антигенсвязывающий домен свернуты неправильно. Экспрессию можно улучшить за счет мутирования остатков на границе вариабельного и константного доменов или избранных остатков CDR. (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9533, Ulrich et al. (1995) PNAS, 92:11907-11911; Forsberg et al. (1997) J Biol. Chem. 272:12430). Если фаговые библиотеки антител продуцируются в бактериальных клетках, то важным фактором в обеспечении правильного свертывания является последовательность каркасной области.

Для выделения высокоаффинных антител также важно создавать разнообразные библиотеки антител или антигенсвязывающих белков. Библиотеки с разнообразием с ограниченных CDR создавались с применением разнообразных подходов. Смотри, например, Tomlinson (2000) Nature Biotech. 18:989-994. Области CDR3 отчасти представляют интерес потому, что нередко обнаруживается их участие в связывании антигенов. Области CDR3 тяжелой цепи значительно варьируются по размеру, последовательности и структурной конформации.

Другие специалисты также генерировали разнообразие посредством рандомизации CDR вариабельных областей тяжелых и легких цепей с использованием всех 20 аминокислот в каждом положении. Полагали, что использование всех 20 аминокислот может привести к большому разнообразию последовательностей вариантных антител и к увеличению шансов на идентификацию новых антител. (Barbas (1994) PNAS 91:3809; Yelton, DE (1995) J. Immunology 155:1994; Jackson, J.R. (1995) J. Immunology 154:3310 and Hawkins, RE (1992) J. Mol. Biology 226:889).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к кристаллическим структурам фрагментов нейропилина-1 и нейропилина-2 (Nrp1 и Nrp2) в виде одиночных фрагментов или в комплексе в антителами, которые селективно блокируют связывание или семафорина, или VEGF. Nrp воспринимают неожиданное расположение доменов, при котором домены a2, b1 и b2 образуют плотно упакованный кор. Варианты расположения эпитопов антител, наряду с экспериментами in vitro, показывают, что VEGF и семафорины не конкурируют напрямую за связывание с Nrp. Основываясь на кристаллографическом димере Nrp, опосредованном доменом a1, настоящее изобретение дополнительно предлагает модели для димеризации рецептора и связывания лиганда.

Основываясь на этих результатах, в одном из аспектов настоящее изобретение предлагает кристалл, образованный фрагментом Nrp1_b1b2, который дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного фрагмента, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=65,9 Å, b=66,7 Å, c=74,7 Å и пространственную группу P2₁2₁2₁.

В следующем аспекте изобретение относится к кристаллу, образованному фрагментом Nrp1_a2b1b2, который дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного фрагмента, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=53,2 Å, b=68,2 Å, c=66,6 Å и пространственную группу P2₁.

Еще в одном аспекте изобретение относится к кристаллу комплекса, образованного фрагментом Nrp1_b1 и Fab-фрагментом антитела против Nrp1^B (YW107.4.87), который подавляет связывание фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) с Nrp1, причем указанный кристалл дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного комплекса, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=213 Å, b=213 Å, c=45,3 Å и пространственную группу H3.

В следующем аспекте изобретение относится к кристаллу, образованному фрагментом Nrp2_b1b2, который дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного фрагмента, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=36,5 Å, b=70,5 Å, c=122 Å и пространственную группу P2₁2₁2₁.

Еще в одном аспекте изобретение относится к кристаллу, образованному фрагментом Nrp2_a2b1b2, который дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного фрагмента, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=50,1 Å, b=193 Å, c=66,2 Å и пространственную группу P2₁.

Еще в одном аспекте изобретение относится к кристаллу комплекса, образованного фрагментом Nrp2_a1a2b1b2 и Fab-фрагментом антитела против panNrp^A, который подавляет связывание семафорина с Nrp2, причем указанный кристалл дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного комплекса, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=148 Å, b=106 Å, c=92,4 Å и пространственную группу C2.

Далее изобретение относится к кристаллу комплекса, образованного фрагментом Nrp2_a1a2b1b2 и Fab-фрагментом антитела против panNrp^A, который подавляет связывание семафорина с Nrp2, причем указанный кристалл дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного комплекса, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=121 Å, b=121 Å, c=203 Å и пространственную группу P3₂21.

Еще в одном аспекте изобретение относится к антителу против panNrp^A, содержащему последовательность вариабельного домена легкой цепи, показанную на фиг.7, и/или последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, показанную на фиг.8, или к его фрагменту.

Еще в одном аспекте изобретение относится к Fab-фрагменту антитела против panNrp^A YW68.11, содержащему последовательность, показанную на фиг.9A.

В следующем аспекте изобретение относится к Fab-фрагменту антитела против panNrp^A YW68.11.26, содержащему последовательность, показанную на фиг.9B.

Еще в одном из дальнейших аспектов изобретение относится к антителу против Nrp, которое конкурирует за связывание Nrp с антителом против panNrp^A.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело против Nrp связывается, по существу, с тем же эпитопом, что и антитело против panNrp^A.

В другом варианте осуществления изобретения антитело против Nrp связывается с эпитопом, содержащим, по меньшей мере, часть поверхности взаимодействия, определяемую аминокислотными остатками Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73 P74, H75, F76, A133 и R138 аминокислотной последовательности Nrp2_a1a2b1b2.

Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против Nrp связывается как с Nrp1, так и с Nrp2.

В следующих вариантах осуществления изобретения антитело против Nrp имеет аффинность связывания по меньшей мере, приблизительно 0,10 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2 или, по меньшей мере, приблизительно 0,15 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2 или, по меньшей мере, приблизительно 0,20 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2 или, по меньшей мере, приблизительно 0,25 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2 или, по меньшей мере, приблизительно 0,30 нМ как с Nrp1, так и с Nrp2.

Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против Nrp блокирует связывание Sema3 как с Nrp1, так и с Nrp2.

Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против Nrp не блокирует связывание VEGF с Nrp1 или Nrp2.

В особом варианте осуществления изобретения антитело против Nrp подавляет биологическую активность семафорина in vitro.

В дополнительном варианте осуществления изобретения антитело против Nrp подавляет биологическую активность семафорина in vivo.

Еще в одном аспекте изобретение относится к способу получения антагониста семафорина, включающему конструирование молекулы, связывающейся с сайтом, содержащим, по меньшей мере, часть поверхности взаимодействия, определяемой аминокислотными остатками Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73 P74, H75, F76, A133 и R138 аминокислотной последовательности Nrp2_a1a2b1b2, синтез соединения и подтверждение того, что соединение блокирует связывание семафорина с Nrp1 и Nrp2.

В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист не препятствует связыванию VEGF с Nrp1 или Nrp2, а способ может включать дополнительный этап подтверждения того, что указанный антагонист не препятствует связыванию VEGF с Nrp1 или Nrp2.

Еще в одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает этап подтверждения того, что антагонист не препятствует биологической активности VEGF.

Антагонист может, например, быть выбран из группы, состоящей из антител, фрагментов антител, связывающих полипептидов, пептидов, и низкомолекулярных непептидных молекул, и, предпочтительно, представляет собой антитело или фрагмент антитела, причем фрагменты антитела включают (без ограничений) Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, dAb, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител, минитела, димерные антитела (diabodies) и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Еще в одном аспекте изобретение относится к способу получения антагониста VEGF, включающему применение трехмерной структуры, полученной из кристалла комплекса, образованного фрагментом Nrp1_b1 и Fab-фрагментом антитела против Nrpl^B (YW107.4.87), в котором кристалл дифрагирует рентгеновское излучение, производя такую картину дифракции, которая отображает трехмерную структуру указанного комплекса, имеющего приблизительно следующие параметры элементарной ячейки: a=213 Å, b=213 Å, c=45,3 Å и пространственную группу H3, для конструирования молекулы, связывающейся с сайтом, содержащим, по меньшей мере, часть эпитопа, связанного с указанным антителом Nrpl^B, синтез соединения и подтверждение того, что соединение подавляет связывание VEGF с Nrp1.

В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист не препятствует связыванию семафорина с Nrp1, а способ может дополнительно включать этап подтверждения этого факта.

В другом варианте осуществления изобретения антагонист подавляет биологическую активность VEGF.

Еще в одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает этап подтверждения того, что антагонист подавляет биологическую активность VEGF.

В следующем варианте осуществления изобретения антагонист подавляет сосудистое ремоделирование.

Еще в одном из дальнейших вариантов осуществления изобретения антагонист выбран из группы, состоящей из антител, фрагментов антител, связывающих полипептидов, пептидов и низкомолекулярных непептидных молекул, и, предпочтительно, представляет собой антитело или фрагмент антитела, причем фрагмент антитела может представлять, например, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, dAb, линейное антитело, одноцепочечную молекулу антитела, минитело, димерное антитело или полиспецифическое антитело, которые образованы из фрагментов антитела.

Далее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества антагониста VEGF, полученного описанным выше способом, который предлагается настоящим изобретением. Рак может быть, например, выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, немелкоклеточного рака легких, неходжкинской лимфомы (NHL), рака почки, рака предстательной железы, рака печени, рака головы и шеи, меланомы, рака яичника, мезотелиомы и множественной миеломы.

В другом варианте осуществления изобретения лечение дополнительно включает второе лечебное средство, причем второе лечебное средство может быть выбрано (без ограничений) из группы, состоящей из антиангиогенного средства, антинеопластической композиции, химиотерапевтического средства и цитотоксического средства, например, такого как дополнительный антагонист VEGF.

В следующем варианте осуществления изобретения дополнительный антагонист VEGF представляет собой антитело против hVEGF или его фрагмент.

Антитело против hVEGF может, например, быть способным связываться с тем же эпитопом VEGF, что и антитело A4.6.1, и, более конкретно, бевацизумаб или ранибизумаб.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения вторым терапевтическим средством является ингибитор рецептора тирозинкиназы, выбранный из группы, состоящей из ваталаниба (PTK787), эрлотиниба (TARCEVA^®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA^®), ZD6126 (ANG453), ZDl839, сунитиниба (SUTENT^®), семаксаниба (SU5416), AMG706, AG013736, иматиниба (GLEEVEC^®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, лапатиниба (GSK572016), VELCADE^®, AZD2171, сорафениба (NEXAVAR^®), XL880 и CHIR-265.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Таблица 1 - Сбор данных и статистика детализации

Фиг.1 - VEGF не блокирует индуцированный Sema3A коллапс конуса роста нейронов DRG

A) Изображения конусов роста аксонов. Необработанные DRG имеют крупные и богатые актином конусы роста (острие стрелки), которые значительно уменьшаются при добавлении Sema3A. Антитела против Nrp были добавлены в дозе 50 мкг/мл.

B) Количественная оценка коллапса конусов роста, индуцированного Sema3A. Процентный показатель спавшихся конусов роста вычисляли путем подсчета спавшихся и не спавшихся конусов роста (N=4 эксплантата на состояние). Планки погрешностей представляют стандартную ошибку средней.

Фиг.2 - Сводка данных по структуре кристалла нейропилина.

A) Эктодомен Nrp состоит из тандема CUB (a1a2), тандема фактора коагуляции V/VIII (b1b2) и одного домена MAM (c1). Упрощенное схематическое представление семи структур кристалла, представленных в этом сообщении с пределами разрешения, перечисленными ниже. Оранжевые сферы показывают связанный ион кальция в домене a2.

B) Выравнивание последовательности доменов a1a2b1b2 в Nrp1 и Nrp2 человека. Элементы вторичной структуры относятся к структуре Nrp2-a1a2b1b2 (синий - a1, зеленый - a2, желтый - b1, красный - b2) и названы согласно договоренности, принятой для домена CUB спермадгезина (Romero, A. et al., Nat Struct Biol 4, 783-8 (1997)) и домена C2 фактора коануляции V (Macedo-Ribeiro, S. et al., Nature 402, 434-9 (1999)). Остатки, ограниченные синими и желтыми рамками, обрисовывают эпитопы антитела для анти-panNrp^A и анти-Nrp1^B соответственно. Аминокислоты, выделенные оранжевым цветом, показывают сайт связывания Ca²⁺ в a2, а остатки, выделенные красным цветом, представляют предполагаемый сайт связывания Ca²⁺ в домене a1. Остатки, затушеванные зеленым цветом, выделяют положения аминокислотных замещений, которые разрывают взаимодействие между Sema3A и Nrp1 (Gu, C. et al., J Biol Chem 277, 18069-76 (2002)). Это выравнивание было проведено с применением компьютерной программы EsPript (Gouet, P. et al., Nuclei Acids Res 3l, 3320-3 (2003)).

Фиг.3 - общая доменная архитектура нейропилинов.

A) доменная организация Nrp2 (синий - a1, зеленый - a2, желтый - b1, красный - b2) в комплексе с Fab-фрагментом антитела против panNrp^A (светло-оранжевый - тяжелая цепь, серый - легкая цепь). N-гликозилированные остатки выделены пурпурным цветом (маджента).

B) Ленточное отображение структур a2b1b2 Nrp1 и Nrp2; оранжевые сферы выделяют связанный ион кальция.

C) Совмещение комплекса Nrp2/Fab из двух разных кристаллических форм на основе доменов a2b1b2. Обратите внимание на плохое совмещение доменов a1 по сравнению с областью a2b1b2. Все рисунки структур получены при помощи компьютерной программы PyMol (http://www.pymol.org).

Фиг.4 - молекулярные детали доменов CUB нейропилина.

A) В структурах a2b1b2 домен a2 включает связанный ион кальция (оранжевый). Домены Nrp a1 (смотри панель C) и a2 утрачивают нить b1, обнаруживаемую у спермадгезина (Romero et al, выше).

B) Ион кальция в домене a2 Nrp1 координирован тремя отрицательно заряженными аминокислотами, двумя карбонильными кислородами основной цепи и молекулой воды. Эти взаимодействия высоко консервативны для Nrp (смотри фиг.S2-S3).

C) (Левая панель) Аминокислоты раскрашены в соответствии с процентным содержанием доступной для растворителя поверхности, которая скрыта на границе раздела Nrp2/Fab (красный - 75-100%, оранжевый - 50-74%, желтый - 25-49%). Антитело против panNrp^A перекрестно реактивно с Nrp1 и Nrp2, а одиннадцать из четырнадцати остатков в структурном эпитопе идентичны (черный текст - идентичные, белый текст - не консервативные, звездочками отмечены остатки, в которых боковая цепь направлена в сторону белкового стержня a1). Остатки, выделенные зеленым цветом, показывают положения аминокислотных замещений, которые необходимы для взаимодействий между Nrp1 и Sema3A²³. (Правая панель) Атомы Ca в этих аминокислотных замещениях показаны в виде зеленых сфер. Атомы Ca, затушеванные пурпурным цветом, показывают предполагаемый сайт связывания кальция.

D) Поверхность раздела против panNrp^A/Nrp2. Nrp2 показан как молекулярная поверхность в соответствии с электростатическим потенциалом (красный - кислотный, синий - щелочной). Контактные остатки антитела управляются ароматическими остатками из CDR H2, H3 и L3.

Фиг.5 - Признаки доменов Nrp, связывающихся с VEGF и с гепарином.

A) Совмещение кристаллических структур Nrp b1b2 (Nrp1 - желтый (b1) и красный (b2), Nrp2 - серый). Синие (Nrp1) и зеленые (Nrp2) остатки подчеркивают конформационные различия в "пиках" b2, но не b1.

B) Молекулярные поверхности крысиной (инвентарный номер PDB 2ORZ) (Vancer Kooi, C. W., et al., Proc Natl Acad Sci USA (2007)) и человеческой кристаллических структур b1b2 окрашены в соответствии с электростатическим потенциалом. Желтые стрелки указывают на кислотный желобок, который образован "пиками" в домене b1 и представляет сайт связывания тафтсина в крысиной структуре (Vander Kooi et al., выше). Зеленые стрелки показывают приблизительное расположение участка связывания гепарина.

C) Относительный консерватизм последовательности (зеленый - 100%, желтый - ≥75%) доменов b1b2 среди двенадцати Nrp (фиг.S3) был картирован на поверхности структуры Nrp1 b1b2 человека. Два высококонсервативных участка выделены оранжевым цветом. Остатки, выделенные голубым цветом (циан), означают те остатки, которые контактируют с Fab в комплексе анти-Nrp1^B-Fab/b1. Домен a2 (пшеничный) показан с применением совмещения структур b1b2 и a2b1b2 из Nrp1.

D) Ленточное представление комплекса анти-Nrp1^B-Fab/b1 (желтый - b1, оранжевый - тяжелая цепь, серый - легкая цепь).

E) Поверхность раздела анти-Nrp1^B/b1. Домен b1 упрощенно изображен как молекулярная поверхность в соответствии с электростатическим потенциалом: желтая стрелка указывает желобок для связывания хвоста VEGF. Только CDR H3 и Ll контактируют с b1.

Фиг.6 - Кристаллографический димер Nrp2 предполагает модели связывания VEGF и семафорина

A) Nrp2 образует седловидный димер в обеих кристаллических формах комплекса Nrp2/Fab. Эта фигура выделяет домены Nrp2 a1a2b1b2 из моносимметричной формы комплекса Fab. Указаны предполагаемые сайты связывания хвоста VEGF, гепарина и семафорина.

B) Потенциальные модели комплексов VEGF/Nrp и семафорин/Nrp, основанные на Nrpa1-опосредованном димере в кристаллических структурах.

Фиг.7 - Выравнивание последовательности вариабельного домена легкой цепи антитела против panNrp ^A (клоны YW68.11 и YW68.11.26).

Фиг.8 - Выравнивание последовательности вариабельного домена тяжелой цепи антител