Способ хроматографии в режиме слабого распределения

Способ хроматографии в режиме слабого распределения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

[0001] Настоящее изобретение относится к способам выделения очищенного продукта из несущей жидкости (load fluid), содержащей одну или более примесь. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, указанный способ включает пропускание несущей жидкости через среду при рабочих условиях, обеспечивающих связывание по меньшей мере 1 мг продукта на 1 мл среды, и выделение очищенного продукта из элюата, выходящего из колонки в цикле загрузки а также на стадии любой по существу изократической промывки. В других вариантах реализации настоящего изобретения указанный способ включает пропускание несущей жидкости через среду при рабочих условиях, характеризуемых значением коэффициента распределения, по меньшей мере равным 0,1.

Уровень техники

[0002] В промышленной биотехнологии очистка белков в коммерческом масштабе является важной проблемой, препятствующей расширению применения рекомбинантных белков в терапевтических и диагностических целях. Развитие данного производственного сектора тормозят проблемы, связанные с выходом, чистотой и производительностью. С появлением технологии рекомбинантных белков появилась возможность получения нужного белка с использованием культур эукариотных или прокариотных клеток-хозяев, подвергнутых генетическим изменениям и способных экспрессировать ген, кодирующий данный белок. Однако при культивировании клеток-хозяев образуется смесь нужного белка с примесями, либо происходящими от самого белка, например, его изоформами, либо от клеток, например, белками клеток-хозяев. Применение подобных рекомбинантных белков в фармацевтических целях зависит от возможности качественного отделения существенных количеств белка от указанных примесей.

[0003] Известные способы очистки белков предполагают отделение целевого белка от примесей на основе различий в размере, заряде, растворимости и степени гидрофобности. Указанные способы включают хроматографические, в том числе аффинную, ионообменную, эксклюзионную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, аффинную хроматографию с использованием иммобилизованных металлов и гидроксиапатитную хроматографию. В указанных способах разделение часто проводят на хроматографических средах, выбранных таким образом, чтобы обеспечить селективное удерживание целевого белка или примесей. В режиме связывания с последующим элюированием (или, для краткости, связывания-элюирования) целевой белок селективно связывается с разделяющей средой и затем его дифференциально элюируют из нее различными растворителями. В проточном режиме примеси специфически связываются с разделяющей средой при отсутствии связывания целевого белка, что позволяет получать целевой белок в выходящем потоке.

[0004] Существующие способы очистки белков, в том числе антител, включают по меньшей мере две хроматографические стадии. Например, первой стадией очистки белков часто является аффинная хроматография, использующая специфическое взаимодействие между целевым белком и иммобилизованным агентом, обеспечивающим специфическую сорбцию. Для аффинного связывания белков, таких как антитела, содержащих Fc-фрагменты, особенно полезны сорбенты на основе белка А. Однако недостатком использования хроматографии на белке А является смыв последнего, что приводит к загрязнению элюированного целевого белка. Кроме того, аффинное связывание не позволяет разделять изоформы целевого белка, в том числе агрегированные формы.

[0005] С тем, чтобы обеспечить извлечение белков, свободных от примесей, образующихся как на стадии культивирования, так и, возможно, на предыдующих стадиях очистки, различные исследователи использовали метод связывания-элюирования, проточный и вытеснительный методы хроматографии. В качестве примера можно назвать следующие группы исследователей, применявших стадию связывания-элюирования в качестве второй стадии очистки после стадии аффинного связывания: авторы патента США US 4,983,722, в котором предложен способ снижения содержания белка А в смеси путем использования ионообменной хроматографии в режиме связывания-элюирования; авторы патента США US 5,429,746, предложившие способ выделения антител IgG из смеси, загрязненной белком А, при помощи хроматографии с гидрофобным взаимодействием в режиме связывания-элюирования; авторы патента США US 5,644,036, предложившие трехстадийный способ выделения очищенных препаратов антител IgG, включающий стадии разделения на белке А, ионообменной хроматографии в режиме связывания-элюирования и эксклюзионной хроматографии. Другие группы исследователей после стадии аффинной хроматографии использовали очистку в проточном режиме. Например, в заявке РСТ WO 04/076485 предложен способ удаления примеси белка А из антител, очищенных хроматографией на белке А, с последующей стадией ионообменной хроматографии в проточном режиме. В заявке РСТ WO 03/059935 предложен способ очистки белков, включающий стадии хроматографии на гидроксиапатите в проточном режиме и последующей аффинной хроматографии.

[0006] В целях избежания проблем, связанных с предшествующими стадиями очистки, другие группы исследователей применяли одностадийные схемы полной очистки. Например, в патенте США US 6,177,548 предложен одностадийный способ удаления агрегатов из биологического образца, основанный на ионном обмене в проточном режиме, согласно которому рН образца доводят до значения, на 0,2 лог. ед. меньше изоэлектрической точки образца. В патенте США US 5,451,662 предложен одностадийный способ разделения смесей неочищенных белков путем ионного обмена в режиме связывания-элюирования, согласно которому рН смеси доводят до значения, лежащего между изоэлектрическими точками разделяемых фракций белков. В заявке РСТ WO 05/044856 предложен одностадийный вытеснительный способ удаления высокомолекулярных агрегатов из препаратов антител с использованием гидроксиапатитной хроматографии.

[0007] Ни один из известных способов, использующих режим связывания с последующим элюированием или проточный режим, однако, не способен удовлетворить всем требованиям биотехнологической промышленности, в том числе по производительности, выходу и чистоте продукта. Способы связывания с последующим элюированием и вытеснительный способ ограничены, помимо прочих факторов, предельной емкостью разделительной среды по целевому белку. С другой стороны, проточные способы способны обеспечивать разделение при более высоких нагрузках, но они ограничены емкостью разделительной среды по примесям. При использовании проточных способов не происходит существенного связывания целевого продукта с колонкой, и любое связывание продукта рассматривают как фактор, понижающий выход. До сих пор сохраняется потребность в способах высокопроизводительного получения очищенных белков, удовлетворяющих таким требованиям по чистоте и выходу, которые обеспечивают возможность их применения в терапии и диагностике. Кроме того, в процессах промышленного производства возникают потребности в надежных, мощных и экономически эффективных схемах очистки.

Описание изобретения

[0008] Настоящее изобретение относится к способам выделения очищенного продукта из несущей жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь, путем пропускания несущей жидкости через среду при рабочих условиях, обеспечивающих связывание по меньшей мере 1 мг продукта на 1 мл указанной среды, и выделения очищенного продукта в элюате, выходящем из колонки в цикле подачи нагрузки, а также при любой по существу изократической промывке. В других вариантах реализации настоящего изобретения указанные рабочие условия обеспечивают связывание по меньшей мере 5 мг продукта на 1 мл среды. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения указанные рабочие условия обеспечивают связывание по меньшей мере 10 мг продукта на 1 мл среды. В других вариантах реализации настоящего изобретения указанные рабочие условия обеспечивают связывание по меньшей мере 20, 30, 40, 50 и 60 мг продукта на 1 мл среды.

[0009] Кроме того, настоящее изобретение относится к способам выделения очищенного продукта из несущей жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь, путем пропускания указанной несущей жидкости через среду при рабочих условиях, характеризуемых значением коэффициента распределения, равным по меньшей мере 0,1, и выделения очищенного продукта в элюате, выходящем из колонки в цикле подачи нагрузки и при любой по существу изократической промывке. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения коэффициент распределения составляет примерно от 0,2 до примерно 20,0. В другом варианте реализации настоящего изобретения коэффициент распределения составляет примерно от 0,2 до примерно 10,0. В других вариантах реализации настоящего изобретения коэффициент распределения составляет примерно от 1,0 до примерно 5,0. Еще в одном варианте реализации настоящего изобретения коэффициент распределения составляет примерно от 0,5 до примерно 5,0. В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения коэффициент распределения составляет примерно от 0,5 до примерно 1,5.

[0010] Настоящее изобретение также относится к способам выделения очищенного продукта из несущей жидкости, которая содержит по меньшей мере одну примесь, путем пропускания указанной несущей жидкости через среду при рабочих условиях, обеспечивающих связывание по меньшей мере от 1 до порядка 70 мг продукта на 1 мл среды и характеризуемых значением коэффициента распределения от 0,3 до 20, и выделения очищенного продукта в элюате, выходящем из колонки в цикле нагрузки и при любой по существу изократической промывке.

[0011] Настоящее изобретение также относится к определению на стадии скрининга рабочих условий, обеспечивающих связывание по меньшей мере 1 мг продукта на 1 мл среды, или, в порядке альтернативы, характеризуемых значением коэффициента распределения, равным по меньшей мере 0,1. Стадия скрининга может включать исследование связывания в статическом режиме или на колонке, такие как изократическое или градиентное элюирование.

[0012] К рабочим условиям в зависимости от используемой среды относятся значение рН, ионная сила, концентрация солей, концентрация эксципиентов ((наполнителей) в том числе фосфатов, кальция, аргинина, глицина, N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES)) и количество противолигандов (например, концентрация имидазола).

[0013] В качестве среды используют любой тип сорбента (смолы) для хроматографии или разделительной среды, в том числе анионообменные и катионообменные заряженные ионообменные смолы, сорбенты для хроматографии с гидрофобным взаимодействием, гидроксиапатиты и сорбенты для аффинной хроматографии с иммобилизованными металлами.

[0014] Очищенные продукты, которые можно выделять с применением настоящего изобретения, включают гибридные белки, белки, содержащие Fc-фрагменты, иммуноконъюгаты, цитокины, интерлейкины, гормоны и терапевтические ферменты.

[0015] Примеси, удаляемые с использованием настоящего изобретения, включают белки клеток-хозяев, нуклеиновые кислоты, изоформы продукта, эндотоксины, белок А и вирусы.

[0016] Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, хроматографическая среда обеспечивает удаление из несущей жидкости по меньшей мере 99,9% примесей, в том числе белков клеток-хозяев, нуклеиновых кислот, изоформ продукта, эндотоксинов и белка А.

[0017] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения, концентрация изоформ продукта в очищенном продукте не превышает примерно 2%.

[0018] В дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения величина нагрузки среды может составлять по меньшей мере 500 мг или по меньшей мере 1000 мг на 1 мл среды.

[0019] Согласно одному из аспектов настоящего изобретения, выделение очищенного продукта из несущей жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь, осуществляют посредством пропускания несущей жидкости через заряженную ионообменную среду при рабочих условиях, которые включают значения рН и ионной силы, обеспечивающие связывание по меньшей мере 1 мг продукта на 1 мл среды, или, в качестве альтернативы, характеризуемых значением коэффициента распределения, равным по меньшей мере 0,1.

[0020] Согласно другому аспекту настоящего изобретения, выделение очищенного продукта из несущей жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь, осуществляют при пропускании несущей жидкости через сорбент для хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий при рабочих условиях, которые включают значения рН, ионной силы и концентрации солей, обеспечивающие связывание по меньшей мере 1 мг продукта на 1 мл среды, или, в качестве альтернативы, характеризуемых значением коэффициента распределения, равным по меньшей мере 0,1.

[0021] Согласно еще одному из аспектов настоящего изобретения, выделение очищенного продукта из несущей жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь, осуществляют при пропускании несущей жидкости через гидроксиапатитный сорбент при рабочих условиях, которые включают значения рН, ионной силы и концентраций фосфат-ионов, кальция, аргинина, глицина, буфера HEPES и имидазола, обеспечивающие связывание по меньшей мере 1 мг продукта на 1 мл среды, или, в качестве альтернативы, характеризуемых значением коэффициента распределения, равным по меньшей мере 0,1.

[0022] Согласно еще одному из аспектов настоящего изобретения, выделение очищенного продукта из несущей жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь, осуществляют при пропускании несущей жидкости через сорбент для аффинной хроматографии, содержащий иммобилизованные металлы, при рабочих условиях, которые включают уровень контрлиганда, значения рН и ионной силы, обеспечивающие связывание по меньшей мере 1 мг продукта на 1 мл среды, или, в качестве альтернативы, характеризуемых значением коэффициента распределения, равным по меньшей мере 0,1.

[0023] Возможно сочетание предложенных в настоящем изобретении способов по меньшей мере еще с одной стадией очистки. Дополнительные стадии очистки могут быть выполнены до или после применения предложенного в настоящем изобретении способа. Например, способы согласно настоящему изобретению можно комбинировать с хроматографией на белке А в качестве начальной стадии очистки.

[0024] Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, жидкость, содержащую продукт, элюируют из колонки с белком А с использованием буферного элюента с низкой ионной силой. рН и проводимость содержащей продукт жидкости регулируют с помощью нейтрализирующего буфера так, чтобы ионная сила содержащей продукт жидкости, которую далее используют в качестве нагрузки, не превышала 20 мМ. Полученную несущую жидкость пропускают через анионообменную среду при рабочих условиях, определенных согласно настоящему изобретению.

[0025] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения буферный раствор - элюент содержит молекулы с заряженными катионными группами, рКа которых составляет 6,5-10. В других вариантах реализации настоящего изобретения буферный раствор - элюент дополнительно содержит молекулы с заряженными анионными группами, рКа которых составляет 2-5. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения буферный раствор элюента содержит молекулы цвиттерионов с рН, равным 7-9.

[0026] Настоящее изобретение также обеспечивает очищенные продукты, в том числе белки и антитела, полученные способами, предложенными в настоящем изобретении.

[0027] Дополнительные задачи и преимущества настоящего изобретения будут описаны в следующем далее описании, частично очевидны из описания или могут быть определены при применении настоящего изобретения на практике. Задачи и преимущества настоящего изобретения реализуются и достигаются с использованием элементов и сочетаний, отдельно определенных в формуле настоящего изобретения.

[0028] Следует понимать, что как настоящее общее описание, так и последующее подробное описание приведены только в качестве примера и для пояснения и не являются ограничительными для объема настоящего изобретения.

[0029] Рисунки, сопровождающие настоящее изобретение, включены в настоящее описание, составляют его часть, и вместе с описанием данного изобретения служат для пояснения принципов настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

[0030] На Фиг.1 показаны (А) отношение между коэффициентом распределения и изотермой адсорбции продукта и (В) изотермы адсорбции продукта на смоле в трех режимах: связывания-элюирования, слабого распределения и проточном режиме.

[0031] На Фиг.2 показаны (А) области значений коэффициента распределения для ионообменной хроматографии в трех режимах: связывания-элюирования, слабого распределения и проточного, и (В) области значений коэффициента распределения для трех режимов хроматографии на гидроксиапатите.

[0032] На Фиг.3 показаны схематические хроматограммы для трех режимов работы: связывания-элюирования, слабого распределения и проточного.

[0033] На Фиг.4 показаны для сравнения хроматограммы в режиме слабого распределения и в проточном режиме.

[0034] На Фиг.5 показаны (А) типичные профили удаления примесей в зависимости от значения Кр и (В) выход целевого продукта в зависимости от величины нагрузки и значения Кр.

[0035] На Фиг.6 показана типичная последовательность определения стадий хроматографии в режиме слабого распределения, включающая: 1) высокопроизводительный скрининг для определения значений Кр; 2) опыты с низкой величиной нагрузки; 3) опыты с высокой величиной нагрузки для определения емкости; 4) опыты с оптимальной для режима слабого распределения нагрузкой.

[0036] На Фиг.7 показана диаграмма значений Кр в зависимости от значений рН и общей концентрации хлоридов, определенных из набора данных, полученных при низкой концентрации, как описано в Эксперименте 1.1.

[0037] На Фиг.8 показано количество удаляемого белка А в зависимости от значения коэффициента распределения Кр согласно описанию Эксперимента 1.1. Логарифм количества удаляемого белка увеличивается с ростом Кр. Проточный режим обозначен в пунктирной рамке как FT, режим слабого распределения - как WP.

[0038] На Фиг.9 показана диаграмма значений IgКp в зависимости от значения рН и логарифма общей концентрации хлоридов согласно описанию в Эксперименте 2.1.

[0039] На Фиг.10 приведены профили прохождения через колонку (А) белков клеток-хозяев и (В) белка А в зависимости от значения Кр при ионообменной хроматографии антитела Маb-ААВ.

[0040] На Фиг.11 показан оптимальный ряд рабочих значений Кр при хроматографии антитела Mab-MYA на гидроксиапатите в режиме слабого распределения. Оптимальное значение Кр в данном примере находится в диапазоне 1,5-20.

[0041] На Фиг.12 приведен оптимальный ряд рабочих значений Кр при хроматографии антитела Маb-А5Т4 на гидроксиапатите в режиме слабого распределения. Оптимальное значение Кр в данном примере находится в диапазоне 2-20.

[0042] На Фиг.13 приведен оптимальный ряд рабочих значений Кр при хроматографии антитела Mab-MYO на гидроксиапатите в режиме слабого распределения. Оптимальное значение Кр в данном примере находится в диапазоне 5-20.

Подробное описание изобретения

А. Определения

[0043] С целью облегчения понимания настоящего изобретения вначале приводятся определения некоторых терминов. Дополнительные определения приведены в подробном описании настоящего изобретения.

[0044] Термин «Проточный режим» означает способ разделения препаратов продуктов, согласно которому по меньшей мере один продукт, содержащийся в препарате, проходит через хроматографический сорбент или хроматографическую среду, в то время как по меньшей мере одно потенциальное загрязнение или примесь связывается с сорбентом или средой. Обычно коэффициент распределения продукта в проточном режиме составляет менее 0,1, а концентрация связываемого продукта - менее 1 мг/мл. Проточный режим является изократической операцией.

[0045] Термин «Режим связывания с последующим элюированием» (или «Режим связывания-элюирования») означает способ разделения препаратов продуктов, согласно которому по меньшей мере один продукт, содержащийся в препарате, связывается с хроматографическим сорбентом или хроматографической средой. Коэффициент распределения продукта в режиме связывания-элюирования обычно превышает 20; концентрация связываемого продукта составляет 1-20 мг/мл. Связанный подобным образом продукт элюируют в ходе соответствующей стадии.

[0046] Термин «Режим слабого распределения» означает способ разделения препаратов продуктов, согласно которому по меньшей мере один продукт, содержащийся в препарате, и по меньшей мере одно загрязнение или одна примесь связываются с хроматографически сорбентом или хроматографической средой. Количество связываемого продукта в данном режиме составляет по меньшей мере 1 мг продукта на 1 мл сорбента или среды. Коэффициент распределения продукта при этом обычно составляет по меньшей мере 0,1. Режим слабого распределения представляет собой изократическую операцию.

[0047] Термин «Коэффициент распределения» (Кр) означает равновесное отношение концентрации продукта, поглощенного сорбентом (Q), к концентрации продукта в растворе (с) при определенных значениии рН и составе раствора. Коэффициент распределения Кр связан с изотермами адсорбции продукта (см. Фиг.1). Коэффициент распределения соответствует углу наклона изотермы адсорбции продукта при крайне низких концентрациях раствора. Он также связан с максимальной емкостью следующим уравнением:

Кр=Q/C=Q_max/k_d,

где Q_max - максимальная емкость сорбента по отношению к продукту, k_d - константа диссоциации для взаимодействия сорбента с продуктом. Коэффициент распределения обычно измеряют путем экспериментов в статическом режиме, однако возможно использование других способов, в том числе изократической хроматографии.

[0048] Термин «Связанный продукт» (Q) означает количество продукта, связывающегося с сорбентом в состоянии равновесия с потоком.

[0049] Термин «Антитело» означает любой иммуноглобулин или его фрагмент и охватывает любые полипептиды, содержащие фрагмент, связывающийся с антигенами. Данный термин включает поликлональные, моноклональные, моноспецифические, полиспецифические, неспецифические, гуманизированные, человеческие, одноцепочечные, химерные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутантные, привитые и полученные in vitro антитела, но не ограничивается ими. Термин «антитела» также охватывает фрагменты антител, в том числе Fab, F(ab')₂, Fv, scFv, Fd, dAb и другие фрагменты антител, сохраняющие способность связываться с антигенами. Обычно подобные фрагменты содержат домен, связывающийся с антигенами.

[0050] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитела содержат С_H2/С_H3-фрагмент и поэтому поддаются очистке хроматографией на белке А. Термин «С_H2/С_H3-фрагмент» относится к аминокислотным остаткам фрагмента Fc молекулы иммуноглобулина, взаимодействующим с белком А. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения С_H2/С_H3-фрагмент содержат неизмененный С_H2-фрагмент и следующий за ним неизмененный С_H3-фрагмент.В других вариантах реализации настоящего изобретения С_H2/С_H3-фрагмент содержит Fc-фрагмент иммуноглобулина. Примерами белков, содержащих С_H2/С_H3-фрагмент, являются антитела, иммуноадгезивы и гибридные белки, содержащие целевой белок, слитый или конъюгированный с С_H2/С_H3-фрагментом.

[0051] Термин «нагрузка» относится к любому загружаемому в колонку материалу, содержащему целевой продукт и полученному либо из осветленных клеточных культур, либо из кондиционированной ферментационной среды или из частично очищенного промежуточного продукта, полученного на стадии хроматографии. Термин «несущая жидкость» означает жидкость, содержащую материал нагрузки и пропускаемую через среду при рабочих условиях согласно настоящему изобретению.

[0052] Термин «примесь» означает любые чужеродные или нежелательные молекулы, в том числе биологические макромолекулы, такие как ДНК, РНК и белки, отличные от очищаемого целевого белка и присутствующие в образце, который подвергают очистке. К примесям относятся, например: изоформы белка, в том числе его агрегаты, фракции с высокой молекулярной массой, низкомолекулярные фракции и фрагменты и дезамидированные молекулы; белки, отличные от целевого и выделяемые клетками-хозяевами (белки клеток-хозяев); белки, являющиеся частью абсорбента, используемого при аффинной хроматографии и вымываемые вместе с образцом в ходе предшествующих стадий очистки, например, белок А; эндотоксины; вирусы.

[0053] Термин «по существу изократический раствор» означает раствор, состав и рН которого лишь незначительно отличаются от соответствующих величин для несущей жидкости.

[0054] Термин «колоночный элюат» (column effluent) означает жидкость, выходящую из среды или колонки в течение цикла подачи нагрузки или в период контакта с нагрузкой.

[0055] Термин «величина нагрузки» означает общее количество продукта, загруженного в колонку в цикле подачи нагрузки при проведении хроматографии или приводимого в контакт с сорбентом в ходе статического связывания, измеренное в единицах массы продукта на единицу объема сорбента.

[0056] Термин «Логарифмическая степень очистки (ЛСО)» означает десятичный логарифм отношения массы примесей в нагрузке перед стадией очистки к массе примесей в очищенной целевой фракции.

[0057] Термин «изократическая хроматография» означает работу хроматографической колонки с использованием растворителя, сила которого не меняется в ходе рабочего периода.

В. Описание способа

[0058] В настоящем изобретении предложены способы выделения очищенных продуктов из несущей жидкости, содержащей по меньшей мере одну примесь. Изобретение может быть использовано для широкомасштабного получения белков для терапевтических и диагностических целей.

1. Режим слабого распределения

[0059] Заявители неожиданно обнаружили, что в режиме хроматографии, промежуточном между известными режимами (связывания-элюирования и проточным), возможно достижение высокой степени удаления примесей и высокого выхода продукта, а также использование высоких величин нагрузок по продукту. Заявители назвали указанный промежуточный режим связывания «режимом слабого распределения».

[0060] В режиме слабого распределения несущую жидкость, содержащую целевой продукт и по меньшей мере одну примесь, пропускают через хроматографическую среду, с которой связываются как продукт, так и примеси. Однако примеси связываются со средой сильнее, чем продукт, и по мере продолжения подачи нагрузки, несвязанный продукт проходит через указанную среду и может быть выделен из элюата, выходящего из колонки. Дополнительно можно провести промывку хроматографической среды в изократических условиях для выделения дополнительных количеств слабо связанного со средой продукта, и затем объединить очищенный продукт, полученный при по существу изократической промывке, с очищенным продуктом из элюата, полученного в цикле подачи нагрузки.

[0061] В соответствии с настоящим изобретением режим слабого распределения характеризуется рабочими условиями, обеспечивающими связывание по меньшей мере 1 мг продукта на 1 мл среды. В одном варианте реализации настоящего изобретения рабочие условия обеспечивают связывание по меньшей мере 5 мг продукта на 1 мл среды. В другом варианте реализации настоящего изобретения рабочие условия обеспечивают связывание по меньшей мере 10 мг продукта на 1 мл среды. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения рабочие условия обеспечивают связывание по меньшей мере 20 мг продукта на 1 мл среды.

[0062] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, общая масса продукта, которая оказывается связанной с указанной средой, составляет по меньшей мере 10% общей массы продукта, загруженного в среду. В некоторых других вариантах реализации настоящего изобретения общая масса продукта, которая оказалась связанной с указанной средой, составляет по меньшей мере 20% общей массы продукта, загруженного в среду. В других вариантах реализации настоящего изобретения общая масса продукта, связанного со средой, составляет по меньшей мере 30% общей массы продукта, загруженного в среду.

[0063] В соответствии с настоящим изобретением, режим слабого распределения также характеризуется значением коэффициента распределения, которое составляет по меньшей мере 0,1. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения работа в режиме слабого распределения подразумевает работу в условиях, характеризуемых значением коэффициента распределения, в диапазоне от примерно 0,2 до примерно 20,0. В других вариантах реализации настоящего изобретения работа в указанном режиме подразумевает работу в условиях, характеризуемых значением коэффициента распределения, которое находится в диапазоне от примерно 0,2 до примерно 10,0. В других вариантах реализации настоящего изобретения работа в данном режиме подразумевает работу в условиях, характеризуемых значением коэффициента распределения, которое находится в диапазоне от примерно 1,0 до примерно 5,0. В других вариантах реализации настоящего изобретения работа в режиме слабого распределения подразумевает работу в условиях, характеризуемых значением коэффициента распределения, которое находится в диапазоне от примерно 0,5 до примерно 5,0. В других вариантах реализации настоящего изобретения работа в данном режиме подразумевает работу в условиях, характеризуемых значением коэффициента распределения, которое находится в диапазоне от примерно 0,5 до примерно 1,5.

[0064] По меньшей мере один вариант реализации настоящего изобретения предусматривает рабочие условия режима слабого распределения, обеспечивающие связывание по меньшей мере от примерно 1 до примерно 70 мг продукта на 1 мл среды и характеризуемые значением коэффициента распределения, равным от 0,3 до 20.

[0065] На Фиг.1 приведены изотермы адсорбции продукта в режимах связывания-элюирования, слабого распределения и в проточном режиме. Видно, что связывание продукта в режиме слабого распределения является промежуточным по сравнению с режимом связывания-элюирования и проточным режимом. Поскольку значение коэффициента распределения продукта Кр является отношением концентрации адсорбированного продукта к концентрации продукта в растворе, значения Кр в режиме слабого распределения также являются промежуточными по сравнению с режимом связывания-элюирования и проточным режимом.

[0066] На Фиг.2А показаны области значений коэффициентов распределения для режимов связывания-элюирования и слабого распределения и проточного режима в зависимости от ионной силы. Оказывается, что коэффициент распределения примесей K_imp в режиме слабого распределения выше, чем в проточном режиме. В более жестких условиях режима слабого распределения повышение производительности способа в отношении выхода продукта достигается по сравнению с проточным режимом вследствие более сильного связывания примесей, а по сравнению с режимом связывания-элюирования вследствие очень слабого связывания продукта по сравнению с примесями и использования им малой части емкости сорбента. В более жестких условиях связывания коэффициент распределения примесей K_imp повышается, что обеспечивает снижение остаточных концентраций примесей в объединенных фракциях продукта в режиме слабого распределения по сравнению с целевой фракцией в проточном режиме. Области проточного режима и режимов слабого распределения и связывания-элюирования для гидроксиапатитной хроматографии в зависимости от концентраций фосфат-ионов и NaCl показаны на Фиг.2В.

[0067] В Таблице А обобщены различия характеристик трех режимов связывания: связывания-элюирования (В-Е), слабого распределения (WP) и проточного (FT).

Таблица А
Характеристики режимов хроматографии, сравниваемых в настоящем изобретении
	FT	WP	В-Е
Кр	<0,1	0,1-20	>20
Ограничения по величине нагрузки	Наличие примесей Величина нагрузки - 10-50 мг продукта/мл Фактически зависят от чистоты нагрузки	Наличие примесей Величина нагрузки - 50-500 мг продукта/мл Фактически зависят от чистоты нагрузки	Общее количество продукта и примесей - менее 100 мг продукта/мл
Объем нагрузки	Умеренный, для разбавленных примесей 10-20 объемов колонки	Очень высокий, для разбавленных примесей до 50 объемов колонки	Более низкий вследствие связывания продукта вместе с примесями, 5-20 объемов колонки
Концентрация продукта в элюате	Равна концентрации в нагрузке в большей части цикла нагружения	Равна концентрации в нагрузке в большей части цикла нагрузки после начального запаздывания	Менее 5% от концентрации в нагрузке
Остаточная концентрация примесей	Низкая	Очень низкая	Зависит от условий элюирования, объема целевой фракции и емкости
Количество связанного продукта (Q)	Менее 1 мг/мл	Менее 10-20 мг/мл	Более 10-20 мг/мл
Интервал рабочих условий	Относительно широкий	Небольшой интервал между двумя другими режимами	Жесткие условия связывания нагрузки, широкий интервал условий элюирования
Подвижная фаза	Изократическая	Изократическая	При элюировании состав буферного раствора после нагружения изменяют

[0068] Режим слабого распределения также отличается от режима связывания-элюирования и проточного режима по характеру хроматограмм, как показано на Фиг.3. На первый взгляд, хроматограммы, полученные в проточном режиме и режиме слабого распределения, кажутся почти одинаковыми, поскольку продукт выделяют из элюата и промывочных фракций в изократических условиях. Однако на хроматограммах существуют небольшие, но заметные отличия, по которым данные режимы можно отличить друг от друга. Как видно из Фиг.4, по сравнению с проточным режимом, в режиме слабого распределения в профиле начального проскока наблюдают появление продукта на выходе из колонки с запаздыванием при объеме элюата более 0,1 объема колонки. В режиме слабого распределения наблюдают также более медленное вымывание продукта из колонки. Также возможно появление небольшого десорбционного пика, который соответствует степени связывания сорбентом продукта в количестве 10-50% от концентрации продукта в подаваемой нагрузке. Данная часть продукта может быть выделена путем промывки сорбента изократическим раствором в количестве 1-5 объемов колонки после завершения цикла подачи нагрузки (load cycle) и выделения продукта с элюатом.

[0069] На Фиг.5А показаны общие тенденции величины ЛСО примесей для различных диапазонов значений коэффициента распределения продукта. При значениях Кр, соответствующих проточному режиму, величина ЛСО примесей относительно низка. Работа в условиях более высоких значений Кр значительно увеличивает ЛСО во фракциях элюата до выхода из колонки примесей. Как показано в примерах, работа при повышенных значениях Кр увеличивает ЛСО по меньшей мере на 2 лог. ед. по сравнению с обычными проточными условиями.

[0070] Повышение Кр обычно повышает связывание с сорбентом как продукта, так и примесей. Более сильное связывание примесей при более высоких значениях Кр ведет к более высокой ЛСО во фракциях элюата до момента проскока примесей на выходе из колонки. Однако величина нагрузки в точке проскока примесей при повышении Кр падает, поскольку продукт начинает конкурировать с примесями за связывающие центры сорбента, что схематически представлено на Фиг.5А верхней кривой Кр. Поэтому режим слабого распределения соответствует интервалу рабочих условий, в котором повышение ЛСО примесей и требования к емкости колонки для конкретного процесса разделения сбалансированы.

[0071] Верхний предел Кр для хроматографии в режиме слабого распределения также зависит от величины нагрузки на колонку, что показано на Фиг.5В. Коэффициент распределения не оказывает влияния на выход продукта, если его значения