Способ обработки целлюлозного материала и используемые в нем ферменты

Способ обработки целлюлозного материала и используемые в нем ферменты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к получению гидролизатов сахаров из целлюлозного материала. Более конкретно изобретение относится к получению ферментируемых сахаров из лигноцеллюлозного материала посредством ферментативной конверсии. Ферментируемые сахара используются, например, при получении биоэтанола или для других целей. В частности изобретение направлено на способ обработки целлюлозного материала с помощью целлобиогидролазы, эндоглюканазы, бета-глюкозидазы и, при необходимости, ксиланазы, а также к ферментным препаратам и их применениям. Изобретение также направлено на новые целлюлолитические полипептиды, кодирующие их полинуклеотиды и на векторы и хозяйские клетки, содержащие полинуклеотиды. Кроме того, изобретение направлено на применения полипептидов и на способ их получения.

Предшествующий уровень техники

Гидролизаты сахаров могут быть использованы для микробного получения множества химических соединений или биополимеров, таких как органические кислоты, например, молочная кислота, или этанола и других спиртов, например, n-бутанола, 1,3-пропандиола, или полигидроксиалконатов (PHAs). Гидролизаты сахаров могут также служить в качестве сырья для других немикробных способов, например для обогащения, выделения и очистки высокомолекулярных сахаров или различных способов полимеризации. Одно из главных применений гидролизатов сахаров заключается в получении биотоплива. Получение биоэтанола и/или других химических соединений может происходить в интегрированном процессе при биоочистке (Wyman, 2001).

Ограниченные ресурсы ископаемого топлива и повышенное количество освобождающегося из него CO₂, вызывающее парниковый эффект, повысили потребность в использовании биомассы как возобновляемого и чистого источника энергии. Одной из обещающих альтернативных технологий является производство биотоплива, т.е. этанола, из целлюлозных материалов. В транспортной отрасли в настоящее время биотопливо является единственным выбором, который мог бы уменьшить выход CO₂ посредством регламентирования его величины. Этанол можно использовать в существующих транспортных средствах и распределительных системах, а следовательно, не требуется дорогостоящих вложений в инфраструктуру. Сахара, полученные из возобновляемого лигноцеллюлозного сырья, можно также использовать в качестве сырья для множества химических продуктов, которые могут заменить химические продукты на основе нефти.

Большинство углеводородов в растениях находятся в форме лигноцеллюлозы, которая в основном представлена целлюлозой, гемицеллюлозой, пектином и лигнином. В процессе лигноцеллюлоза-этанол лигноцеллюлозный материал предварительно обрабатывают либо физическими, либо химическими методами, чтобы сделать целлюлозную фракцию более доступной гидролизу. После этого целлюлозную фракцию гидролизуют, чтобы получить сахара, которые с помощью дрожжей можно ферментировать в этанол. В качестве главного попутного продукта получают лигнин, который можно использовать в качестве твердого топлива.

Стоимость производства биоэтанола высока, а выход энергии низок, поэтому постоянно продолжаются попытки сделать этот процесс более экономичным. Ферментативный гидролиз рассматривается в качестве наиболее обещающей технологии превращения целлюлозной биомассы в ферментируемые сахара. Однако в промышленных масштабах гидролиз используют ограниченно, и особенно эта технология является неудовлетворительной, когда используется сильно лигнифицированный материал, такой как отходы деревообработки или сельского хозяйства. Стоимость ферментативной стадии является одним из главных экономических факторов процесса. Производились попытки улучшить эффективность ферментативного гидролиза целлюлозного материала (Badger, 2002).

В US 2002/0192774 A1 описывается непрерывный процесс конверсии твердой лигноцеллюлозной биомассы в горючие топливные продукты. После предварительной обработки посредством влажного окисления или разрыва паром биомасса частично разделяется на целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин, а затем подвергается частичному гидролизу с помощью одного или более карбогидразных ферментов (EC 3.2). В качестве примера приводится коммерческий продукт Celluclast™ фирмы Novo Nordisk A/S, обладающий целлюлазной и ксиланазной активностями.

В US 2004/000 5674 A1 описываются новые смеси ферментов, которые могут быть использованы непосредственно на лигноцеллюлозном субстрате, при этом можно избежать получения токсичных отходов, образующихся во время предварительной обработки, и можно сэкономить энергию. Синергетическая смесь ферментов содержит целлюлазу и дополнительный фермент, такой как целллюлаза, ксиланаза, ксиланаза, лигниназа, амилаза, протеаза липидаза или глюкуронидаза, или их любая комбинация. Подразумевается, что целлюлаза включает эндоглюканазу (EG), бета-глюкозидазу (BG) и целлобиогидролазу (CBH). Примеры иллюстрируют использование смеси препаратов ксиланазы и целлюлазы Trichoderma.

Kurabi et al. (2005) исследовали ферментативный гидролиз разорванного паром и предварительно обработанной органическим этанольным растворителем дугласии с помощью новых и коммерческих грибковых целлюлаз. Они тестировали два коммерческих целлюлазных препарата Trichoderma reesei и два новых препарата, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma sp. и Penicillum sp. Препарат из Trichoderma sp. показал значительно лучшие характеристики, чем другие препараты. Предполагалось, что лучшие характеристики, по меньшей мере, частично, обусловлены значительно более высокой бета-глюкозидазной активностью, которая ослабляет продукты, ингибирующие действие целлобиогидролазы и эндоглюканазы.

US 2004/005 3373 A1 относится к способу превращения целлюлозы в глюкозу путем обработки предварительно подготовленного лигноцеллюлозного субстрата смесью ферментов, включающей целлюлазу и модифицированную целлобиогидролазу I (CBHI). CBHI модифицировали инактивацией ее целлюлозо-связывающего домена (CBD). Преимущества модификации CBHI заключаются, например, в лучшем восстановлении и более высокой скорости гидролиза при высокой концентрации субстрата. Целлюлазу выбирают из группы, состоящей из EG, CBH и BG. CBHI предпочтительно получают из Trichoderma.

В US 2005/0164355 A1 описывается способ деградирования лигноцеллюлозного материала с помощью одного или более целлюлолитических ферментов в присутствии, по крайней мере, одного суфрактанта. Могут использоваться также вспомогательные ферменты, такие как гемицеллюлазы, эстераза, пероксидаза, протеаза, лакказа или их смеси. Присутствие суфрактанта усиливает деградацию лигноцеллозного материала по сравнению с отсутствием суфрактанта. Целлюлолитические ферменты могут быть любыми ферментами, включенными в деградацию лигноцеллюлозы, включая CBH, EG и BG.

Имеется большое количество публикаций, раскрывающих различные целлюлазы и гемицеллюлазы.

Например, в WO 03/000 941 раскрываются целлобиогидролазы (CBHs), которые относятся к CBHI-ферментам, получаемым из грибков. Не приводится никаких физиологических свойств этих ферментов, никаких примеров их применения. Hong et al. (2003b) характеризуют CBHI из Thermoascus aurantiacus, продуцируемую в дрожжах. Применения фермента не описаны. Tuohy et al. (2002) описывают три формы целлобиогидролазы из Talaromyces emersonii.

Эндоглюканазы семейства cel5 (EGs fam 5) описываются, например, в WO 03/062 409, которая относится к композициям, включающим, по крайней мере, два термостабильных фермента дли применения в пищевых отраслях. Hong et al. (2003а) описывают продуцирование термостабильной эндо-β-1,4-глюканазы из T.aurantiacus в дрожжах. Никаких применений не указывается. WO 01/70998 относится к β-глюканазам из Talaromyces emersonii. Обсуждаются применения для производства пищевых продуктов, кормов, напитков, пивоварения и детергентов. Лигноцеллюлозный гидролиз не упоминается. В WO 98/06 858 описывается бета-1,4-эндоглюказаназа из Aspergillus niger и обсуждается применение этого фермента в производстве продуктов питания и кормов. WO 97/13853 описывает методы скринирования ДНК-фрагментов, кодирующих ферменты в кДНК-библиотеках. кДНК-библиотека имеет дрожжевое или грибковое происхождение предпочтительно из Aspergillus. Фермент предпочтительно является целлюлазой. Van Petegen et al. (2002) описывают 3D-структуру эндоглюканазы cel5-семейства из Thermoascus aurantiacus. Parry et al. (2002) описывают принцип действия эндоглюканазы cel5-семейства из Thermoascus aurantiacus.

Эндоглюканазы семейства cel7 (EGs fam 7) раскрываются, например, в US 5,912,157, которая относится к эндоглюканазе Myceliphthora и ее гомологам и их применениям при производстве детергентов, в текстильной и целлюлозной промышленности. US 6,071,735 описывает целлюлазы, обнаруживающие высокую эндоглюканазную активности в щелочной среде. Обсуждаются применения в качестве детергента, целлюлозно-бумажной и текстильной промышленности. Биоэтанол не упоминается. US 5,763,254 раскрывает ферменты, деградирующие целлюлозу/гемицеллюлозу и имеющие консервативные аминокислотные остатки в CBD.

Эндоглюканазы семейства cel45 (EGs fam 45) раскрываются, например, в US 6,001,639, которая относится к ферментам, имеющим эндоглюканазную активность и содержащим две корсервативные аминокислотные последовательности. Обсуждаются в целом применения для текстильной промышленности, в качестве детергента и в целлюлозно-бумажной промышленности, обработка лигноцеллюлозного материала упоминается, но никаких примеров не приводится. WO 2004/053039 направлена на применение эндоглюканаз в качестве детергента. В US 5,958,082 раскрывается применение эндоглюканазы, особенно из Thielavia terrestris, в текстильной промышленности. EP 0495258 относится к детергентным композициям, содержащим целлюлазу Humicola. В US 5,948,672 описывается препарат целлюлазы, содержащий эндоглюканазу, особенно из Humicola, и его применение в текстильной и целлюлозной промышленности. Гидролиз лигноцеллюлозы не упоминается.

Небольшое количество бета-глюкозидазы (BG) усиливает гидролиз биомассы до глюкозы посредством расщепления целлобиозы, продуцируемой целлобиогидролазами. Конверсия целлобиозы в глюкозу обычно является главной лимитирующей скорость стадией. Бета-глюкозидазы раскрываются, например, в US 2005/021 4920, которая относится к BG из Aspergiilus fumigatus. Этот фермент продуцируется в Aspergiilus oryzae и Trichoderma reesei. В целом обсуждается применение фермента при деградации биомассы и в качестве детергента, однако примерами не иллюстрируется. В WO 02/095 014 описывается фермент из Aspergiilus oryzae, имеющий целлобиазную активность. Применение в производстве этанола из биомассы в целом обсуждается, но примеров не приводится. WO 2005/074656 раскрывает полипептиды, имеющие повышенную целлюлолитическую активность, происходящие, например, из T. aurantiacus; A. fumigatus; T. terrestris и T. aurantiacus. В WO 02/26879 раскрывается ферментативная обработка растительного материала. В US 6,022,725 раскрываются клонирование и амплификация бета-глюкозидазного гена Trichoderma reesei, а в US 6,103,464 описывается способ обнаружения ДНК, кодирующей бета-глюкозидазу из волокнистого грибка. Никаких примеров применения не приводится.

Ксиланазы описываются, например, в FR2786784, которая относится к термоустойчивой ксиланазе, полезной, например, в обработке корма для животных и в хлебопечении. Фермент происходит из волокнистого грибка, в частности рода Thermoascus.

В US 6,197,564 описываются ферменты, имеющие ксиланазную активность и полученные из Aspergillus aculeatus. Иллюстрируется их применение в хлебопечении. WO 02/24926 относится к ксиланазам из Talaromyces. Приводятся примеры применения в производстве кормов и хлебопечении. В WO 01/42433 раскрывается термоустойчивая ксиланаза из Talaromyces emersonii для использования в пищевой промышленности и производстве кормов.

Наиболее исследованные и широко применяемые целлюлолитические ферменты грибкового происхождения происходят из Trichoderma reesei (анаморфа Hypocrea jecorina). Соответственно большинство коммерчески доступных грибковых целлюлаз происходят из Trichoderma reesei. Однако большинство целлюлаз из менее известных грибков еще не применялось в практически значимых процессах, таких как деградация целлюлозного материала, включая лигноцеллюлозу.

Имеется постоянная потребность в новых методах деградации целлюлозных субстратов, в частности лигноцеллюлозных субстратов, и в новых ферментах и смесях ферментов, которые увеличивают эффективность деградации. Имеется также потребность в способах и ферментах, которые работают при высоких температурах, что дает возможность использования биомасс с высокой плотностью и ведет к высоким концентрациям сахаров и этанола. Этот подход может привести к значительной экономии в энергии и инвестиционных затратах. Высокая температура, кроме того, уменьшает риск заражения во время гидролиза. Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы удовлетворить, по крайней мере, часть этих потребностей.

Краткое описание изобретения

Это удивительно, но было обнаружено, что целлюлолитические ферменты, и особенно целлобиогидролазы, полученные из Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum или Chaetomium thermophilum, чрезвычайно полезны в гидролизе целлюлозного материала. Кроме целлобиогидролаз эти грибки также содержат эндоглюканазы, бета-глюкозидазы и ксиланазы, которые очень подходят для деградирования целлюлозного материала. Эти ферменты кинетически весьма эффективны в широком интервале температур, и хотя они имеют высокую активность при высокой температуре, они также весьма эффективны при стандартных температурах гидролиза. Это делает их исключительно хорошо подходящими для различных процессов гидролиза целлюлозных субстратов, проводимых как при традиционных температурах, так и при повышенных температурах.

Настоящее изобретение прелагает способ обработки целлюлозного материала с помощью целлобиогидролазы, эндоглюканазы и бета-глюкозидазы, при этом упомянутая целлобиогидролаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%-ную идентичность SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, либо ее ферментативно активный фрагмент.

Изобретение далее предлагает ферментный препарат, включающий целлобиогидролазу, эндоглюканазу и бета-глюкозидазу, где упомянутая целлобиогидролаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%-ную идентичность SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, либо ее ферментативно активный фрагмент.

Предлагается также применение упомянутого ферментного препарата для деградирования целлюлозного материала, а также применение упомянутого способа в процессе получения этанола из целлюлозного материала.

Изобретение также направлено на полипептид, включающий фрагмент, имеющий целлюлолитическую активность, выбираемый из группы, состоящей из:

a) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 66%-ную идентичность SEQ ID NO:4, 79%-ную идентичность SEQ ID NO:6, 78%-ную идентичность SEQ ID NO:12, 68%-ную идентичность SEQ ID NO:14, 72%-ную идентичность SEQ ID NO:16, 68%-ную идентичность SEQ ID NO:20, 74%-ную идентичность SEQ ID NO:22 или 24, или 78%-ную идентичность SEQ ID NO:26;

b) варианта а), включающего фрагмент, имеющий целлюлолитическую активность; и

с) фрагмента а) или b), имеющего целлюлолитическую активность.

Еще одним объектом изобретения является выделенный полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из:

a) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 или 25, или последовательности, кодирующей полипептид по п.35 притязаний;

b) нити, комплементарной a);

c) фрагмента a) или b), включающего, по меньшей мере, 20 нуклеотидов; и

d) последовательности, которая является вырожденной, как результат генетического кода, относительно любой из последовательностей, представленных в a), b) или c).

Далее изобретение также предлагает вектор, который включает упомянутый полинуклеотид в качестве гетерологичной последовательности, и хозяйскую клетку, включающую упомянутый вектор. Штаммы Escherichia coli, имеющие номера доступа DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 или DSM 17667, также включены в изобретение.

Другими целями изобретения являются ферментные препараты, включающие, по меньшей мере, новые полипептиды, и применение этих полипептидов или ферментных препаратов в топливной, текстильной, целлюлозно-бумажной, пищевой промышленности, в производстве детергентов, кормов и напитков.

Далее предлагается способ получения полипептида, включающего фрагмент, имеющий целлюлолитическую активность, при этом полипептид выбран из группы, состоящей из:

a) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 66%-ную идентичность SEQ ID NO:4, 79%-ную идентичность SEQ ID NO:6, 78%-ную идентичность SEQ ID NO:12, 68%-ную идентичность SEQ ID NO:14, 72%-ную идентичность SEQ ID NO:16, 68%-ную идентичность SEQ ID NO:20, 74%-ную идентичность SEQ ID NO:22 или 24, или 78%-ную идентичность SEQ ID NO:26;

b) варианта а), включающего фрагмент, имеющий целлюлолитическую активность; и

c) фрагмента а) или b), имеющего целлюлолитическую активность; и

причем указанный способ включает трансформацию хозяйской клетки вектором, кодирующим упомянутый полипептид, и культивирование упомянутой хозяйской клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию этого полипептида, и, при необходимости, выделение и очистку получаемого полипептида.

предлагается также способ обработки целлюлозного материала с помощью отработанной культуральной среды, по крайней мере, одного микроорганизма, способного продуцировать полипептид, как он охарактеризован выше, где способ включает реагирование целлюлозного материала с отработанной средой культивирования, чтобы получить гидролизованный целлюлозный материал.

Варианты воплощения изобретения представлены в зависимых пунктах формулы.

Другие цели, особености и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из последующих чертежей, подробного описания и примеров.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Температурные зависимости целлюлазной и бета-глюкозидазной активностей в супернатантах шести тестированных грибковых штаммах. Время инкубирования в данном анализе было 60 мин при данной температуре, анализ pH был 5.0 (MUL-активность) или 4.8 (CMCase или BGU). Активность, полученная при 60^оС, представлена как относительная активность от 100%. A) Thermoascus aurantiacus ALKO4239, B) Thermoascus aurantiacus ALKO4242, C) Acremonium thermophilum ALKO4245, D) Talaromyces thermophilus ALKO4246, E) Chaetomium thermophilum ALKO4261, F) Chaetomium thermophilum ALKO4265.

Фигура 2. Схематическое изображение экспрессионных кассет, используемых при трансформации протопластов Trichoderma reecei для продуцирования рекомбинантных грибковых протеинов. Рекомбинантные гены находились под управлением T. reecei cbh1 (cel7A) промотора (cbh1 prom), а терминация транскрипции гарантировалась использованием терминаторной последовательности T. reecei cbh1 (cbh1-term). В качестве маркера трансформации был включен amdS-ген.

Фигура 3. A) pH-оптимумы препаратов рекомбинантного протеина CBH/Cel7 из Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 и Acremonium thermophilum ALKO4245, определенные по 4-метилумбеллиферил-β-D-лактозиду (MUL) при 50^оС за 10 мин. Результаты приведены как средние (±SD) из трех отдельных измерений. B) Термальная устойчивость препаратов рекомбинантного протеина CBH/Cel7 из Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 и Acremonium thermophilum ALKO4245, определенные по 4-метилумбеллиферил-β-D-лактозиду (MUL) при оптимуме pH в течение 10 мин. Результаты приведены как средние (±SD) из трех отдельных измерений. Обе реакции содержали BSA (100 мкг/мл) в качестве стабилизатора.

Фигура 4. Гидролиз кристаллической целлюлозы (Avicel) с помощью очищенных рекомбинантных целлобиогидролаз при 45^оС. Концентрация субстрата 1% (вес/об), pH 5.0, концентрация фермента 1,4 мкМ. A) целлобиогидролазы, содержащие CBD, B) целлобиогидролазы (кор) без CBD.

Фигура 5. Гидролиз кристаллической целлюлозы (Avicel) с помощью очищенных рекомбинантных целлобиогидролаз при 70^оС. Концентрация субстрата 1% (вес/об), pH 5.0, концентрация фермента 1,4 мкМ. A) целлобиогидролазы, содержащие CBD, B) целлобиогидролазы (кор) без CBD.

Фигура 6. A) pH-зависимость активности гетерологично произведенных Acremonium EG_40/Cel45A, EG_40_подобной/Cel45B и Thermoascus EG_28/Cel5A определялась с помощью CMC-субстрата в течение 10-минутной реакции при 50^оС. B) Температурный оптимум Acremonium EG_40/Cel45A, EG_40_подобной/Cel45B и Thermoascus EG_28/Cel5A определялся при pH 5.5, 4.8 и 6.0, соответственно. Реакция с участием CMC в качестве субстрата проводилась в течение 60 мин, кроме EG_28/Cel5A, которую проводили в течение 10 мин. В качестве стабилизатора добавляли BSA (100 мкг/мл).

Фигура 7. A) pH-зависимость активности гетерологично произведенных Acremonium BG_101/Cel3A, Chaetomium BG_76/Cel3A и Thermoascus BG_81/Cel3A определялась с помощью 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозидного субстрата в течение 10-минутной реакции при 50^оС. B) Температурный оптимум Acremonium EG_40/Cel45A, EG_40_ подобной/Cel45B и Thermoascus EG_28/Cel5A определялся при pH 4.5, 5.5 и 4.5, соответственно. Реакция с участием 4-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида в качестве субстрата проводилась в течение 60 мин, в качестве стабилизатора добавляли BSA (100 мкг/мл).

Фигура 8. A) pH-зависимость ксиланазной активности гетерологично произведенной Thermoascus XYN_30/Xyn10A определялась с помощью субстрата из ксилана березы в течение 10-минутной реакции при 50^оС. B) Температурный оптимум XYN_30/Xyn10A определялся при pH 5.3 во время 60-минутной реакции, в качестве стабилизатора добавляли BSA (100 мкг/мл).

Фигура 9. Гидролиз промытого разорванного паром волокна ели (10 мг/мл) со смесью термофильных ферментов (СМЕСЬ 1) и ферментов из T. reesei при 55 и при 60^оС. Дозировка ферментов дана в FPU (единицах фильтровальной бумаги)/г сухого вещества субстрата, FPU анализировали при 50^оС, pH 5. Гидролиз проводили в течение 72 ч при pH 5, с помешиванием. Результаты даны как среднее (±SD) из трех отдельных измерений.

Фигура 10. Гидролиз промытой разорванной паром кукурузной соломы (10 мг/мл) со смесью термофильных ферментов (СМЕСЬ 2) и ферментов из T. reesei при 45, 55 и 57,5^оС. Дозировка ферментов для «СМЕСИ 2» была 5 FPU/г сухого вещества субстрата, а для ферментов из T. reesei - 5 FPU/г сухого вещества Celluclast, дополненного 100 нкат/г сухого вещества Novozym 188 (активность фильтровальной бумаги анализировалась при 50^оС, pH 5). Гидролиз проводили в течение 72 ч при pH 5, с помешиванием. Результаты даны как среднее (±SD) из трех отдельных измерений. Субстрат содержал растворимые восстановленные сахара (около 0,7 мг/мл). Это фоновое содержание сахаров вычиталось из от содержания восстановленных сахаров, образованных во время гидролиза.

Фигура 11. Гидролиз промытой разорванной паром кукурузной соломы (10 мг/мл) со смесью термофильных ферментов, содержащей новую термофильную ксиланазу из Thermoascus aurantiacus (СМЕСЬ 3) и ферментов из T. reesei при 45, 55 и 60^оС. Дозировка ферментов для «СМЕСИ 3» была 5 FPU/г сухого вещества субстрата, а для ферментов из T. reesei - 5 FPU/г сухого вещества Celluclast, дополненного 100 нкат/г сухого вещества Novozym 188 (активность фильтровальной бумаги анализировалась при 50^оС, pH 5). Гидролиз проводили в течение 72 ч при pH 5, с помешиванием. Результаты даны как среднее (±SD) из трех отдельных измерений. Субстрат содержал растворимые восстановленные сахара (около 0,7 мг/мл). Это фоновое содержание сахаров вычиталось из от содержания восстановленных сахаров, образованных во время гидролиза.

Фигура 12. Гидролиз промытого разорванного паром волокна ели (10 мг/мл) со смесью термофильных ферментов, содержащей новую термофильную ксиланазу XYN_30/Xyn10A из Thermoascus aurantiacus (СМЕСЬ 3) и ферментов из T. reesei при 45, 55 и 60^оС. Дозировка ферментов для «СМЕСИ 3» была 5 FPU/г сухого вещества субстрата, а для ферментов из T. reesei - 5 FPU/г сухого вещества Celluclast, дополненного 100 нкат/г сухого вещества Novozym 188 (активность фильтровальной бумаги анализировалась при 50^оС, pH 5). Гидролиз проводили в течение 72 ч при pH 5, с помешиванием. Результаты даны как среднее (±SD) из трех отдельных измерений.

Фигура 13. Влияние глюкозы на активность различных β-глюкозидазных препаратов. Стандартный анализ с использованием p-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида в качестве субстрата проводили в присутствии глюкозы в анализируемой смеси.

Фигура 14. FPU-активности смесей ферментов при температурах от 50 до 70^оС, представленные как процентное значение активности при стандартных условиях (50^оС, 1 ч).

Фигура 15. Относительная целлюлазная активность двух различных штаммов T. reesei, выращенных в средах, содержащих необработанную Nutriose (N0) или BG_81/Cel3A, предварительно обработанную Нутриозой (NBG81), в качестве источника углерода.

Подробное описание изобретения

Целлюлоза является главным структурным компонентом высших растений. Она обеспечивает клетки растений высокой напрягающей силой, помогающей им сопротивляться механическому стрессу и осмотическому давлению. Целлюлоза представляет собой β-1,4-глюкан, построенный из линейных цепочек остатков глюкозы, соединенных β-1,4-гликозидными связями. Целлобиоза является самой маленькой повторяющейся единицей целлюлозы. В клеточных стенках целлюлоза упакована в различно ориентированные слои, которые внедрены в матрикс гемицеллюлозы и лигнина. Гемицеллюлоза представляет собой разнородную группу углеводородных полимеров, содержащую, главным образом, различные глюканы, ксиланы и маннаны. Гемицеллюлоза состоит из линейного каркаса из β-1,4-связанных остатков с замещенными короткими боковыми цепями, обычно содержащими ацетил, глюкуронил, арабинозил и галактозил. Гемицеллюлоза может быть химически перекрестно-связанной с лигнином. Лигнин представляет собой сложный сшитый поперечными связями полимер различно замещенных р-гидроксифенилпропановых единиц, который обеспечивает силу клеточной стеки противостоять механическому стрессу, а также предохраняет целлюлозу от ферментативного гидролиза.

Лигноцеллюлоза представляет собой комбинацию целлюлозы и гемицеллюлозы и полимеров фенол-пропаноловых единиц и лигнина. Она физически твердая, плотная и непроницаемая и является самым распространенным биохимическим материалом в биосфере. Содержащими лигноцеллюлозу материалами являются: например, твердая и мягкая стружка древесины, мезга, опилки, отходы лесной и деревообрабатывающей промышленности; сельскохозяйственная биомасса, такая как солома злаков, ботва сахарной свеклы, солома и початки кукурузы, жом сахарного тростника, стебли, листья, пустые стручки, лузга и т.п.; твердые бытовые отходы, газеты и выброшенная офисная бумага, отходы от измельчения, например, зерна; отдающие энергию культуры (например, ива, тополь, просо, тростниковая канареечная трава и т.п.). Предпочтительными примерами являются кукурузная солома, просо, солома злаков, жом сахарного тростника и происходящие из древесины материалы.

«Целлюлозный материал», как этот термин здесь используется, относится к любому материалу, включающему целлюлозу, гемицеллюлозу и/или лигноцеллюлозу в качестве существенного компонента. «Лигноцеллюлозный материал» означает любой материал, включающий лигноцеллюлозу. Такие материалы являются, например, растительными материалами, такими как древесина, включая мягкую древесину и твердую древесину, травяные сельскохозяйственные культуры, остатки сельскохозяйственных культур, мезга и остатки бумаги, бумажные отходы, отходы пищевой и кормовой промышленности и т.д. Текстильные волокна, такие как хлопковые, волокна, происходящие из хлопка, льна, конопли, джута и сделанные человеком волокна, такие как модаль, вискоза, лиоцель, являются характерными примерами целлюлозных материалов.

В природе целлюлозный материал деградируется рядом различных организмов, включая бактерии и грибки. В типичном случае целлюлоза деградируется различными целлюлазами, действующими последовательно или одновременно. Для биологической конверсии целлюлозы в глюкозу обычно требуются три типа гидролитических ферментов: (1) Эндоглюканазы, которые разрезают внутренние бета-1,4-глюкозидные связи; (2) Экзоцеллобиогидролазы, которые отрезают дисахаридную целлобиозу от конца целлобиозной полимерной цепи; (3) Бета-1,4-глюкозидазы, которые гидролизуют целлобиозу и другие короткие целло-олигосахариды в глюкозу. Другими словами, тремя главными группами целлюлаз являются целлобиогидролазы (CBH), эндоглюканазы (EG) и бета-глюкозидазы (BG).

Для деградации более сложных целлюлозосодержащих субстратов требуется широкий круг различных ферментов. Например, лигноцеллюлоза деградируется гемицеллюлазами, а также ксиланазами и манназами. Гемицеллюлаза является ферментом, гидролизующим гемицеллюлозу.

«Целлюлолитическими ферментами» являются ферменты, имеющие «целлюлолитическую активность», что означает, что они способны гидролизовать целлюлозные субстраты или их производные на менее крупные сахариды. Целлюлолитические ферменты, таким образом, включают как целлюлазы, так и гемицеллюлазы. Целлюлазы, как этот термин здесь используется, включают целлобиогидролазы, эндоглюканазы и бета-глюкозидазы.

T. reesei имеет хорошо известную и эффективную целлюлазную систему, содержащую две CBH-азы, две главных и несколько менее значимых EG-аз и BG-аз. CBHI (Cel7A) T. reesei расщепляет сахар с редуцирующего конца целлюлозной цепи, содержит C-концевой целлюлозосвязывающий домен (CBD) и может составлять до 60% общего секретируемого протеина. CBHII (Cel6A) T. reesei расщепляет сахар с не-редуцирующего конца целлюлозной цепи, содержит N-концевой целлюлозосвязывающий домен и может составлять до 20% общего секретируемого протеина. Эндоглюканазы EGI (Cel7B) и EGV (Cel45A) имеют CBD на своем C-конце, EGII (Cel5A) имеет CBD на N-конце, а EGIII вообще не содержит целлюлозосвязывающего домена. CBHI, CBHII, EGI и EGII являются так называемыми «главными целлюлазами» Trichoderma, включающими вместе 80-90% общих секретируемых протеинов. Специалистам в данной области техники известно, что фермент может быть активным на нескольких субстратах, и ферментативные активности можно измерить, используя различные субстраты, методы и условия. Идентифицирование различных целлюлолитических активностей обсуждается, например, у van Tilbeurgh et al., 1988.

Помимо каталитического домена/кора, выражающего целлюлолитическую активность, целлюлолитические ферменты могут включать один или более связывающих доменов (CBDs), называемых также карбогидрат-связывающими доменами/модулями (CBD/CBM), которые могут быть расположены либо на N-, либо на C-конце каталитического домена. CBDs имеют карбогидрат-связывающую активность и опосредуют связывание целлюлазы с кристаллической целлюлозой, но имеют слабую или неэффективную целлюлазную активность фермента на растворимых субстратах. Имеются два домена, в типичном случае связанных через гибкую и высокогликозилированную линкерную область.

«Целлобиогидролаза» или «CBH», как этот термин используются здесь, относится к ферментам, которые расщепляют целлюлозу с конца глюкозной цепи и производят, главным образом, целлобиозу. Их также называют 1,4-бета-D-глюкан целлобиогидролазами или целлюлозо-1,4-бета-целлобиозидазами. Они гидролизуют 1,4-бета-D-глюкозидные связи с редуцирующего или нередуцирующего конца полимера, содержащего упомянутые связи, такого как целлюлоза, при этом освобождается целлобиоза. Две разные CBHs были выделениы из Trichoderma reesei, CBHI и CBHII. Они имеют модульную структуру, состоящую из каталитического домена, сцепленного с целлюлозо-связывающим доменом (CBD). В природе встречаются также целлобиогидролазы, у которых CBD отсутствует.

«Эндоглюказана» или «EG» относится к ферментам, которые разрезают внутренние гликозидные связи в целлюлозной цепи. Они классифицируются как EC 3.2.1.4. Они являются 1,4-бета-D-глюкан 4-глюканогидролазами и катализируют эндогидролиз 1,4-бета-D-гликозидных связей в полимерах глюкозы, таких как целлюлоза и ее производные. Некоторые встречающиеся в природе эндоглюканазы имеют целлюлозо-связывающий домен, в то время как другие его не имеют. Некоторые эндоглюканазы имеют также ксиланазную активность (Bailey et al., 1993).

«Бета-глюкозидаза» или «BG», или «βG» относится к ферментам, которые деградируют мало растворимые олигосахариды, включая целлобиозу, до глюкозы. Они классифицируются как EC 3.2.1.21. Они являются бета-D-глюкозид глюкогидролазами, которые типически катализируют гидролиз концевых нередуцирующих остатков бета-D-глюкозы. Эти ферменты распознают олигосахариды глюкозы. Типичными субстратами являются целлобиоза и целлотриоза. Целлобиоза является ингибитором целлобиогидролаз, по этой причине деградация целлобиозы является важной для преодоления конечного продукта ингибирования целлобиогидролаз.

Ксиланазы являются ферментами, которые способны распознавать гидролизовать гемицеллюлозу. Они включают как экзогидролитические, так и эндогидролитические ферменты. В типичном случае они имеют эндо-1,4-бета-ксиланазную (EC 3.2.1.8) или бета-D-ксилозидазную (EC 3.2.1.37) активность, которая расщепляет гемицеллюлозу до ксилозы. «Ксиланаза» или «Xyn» в связи с настоящим изобретением относится в особенности к ферменту, классифицируемому как EC 3.2.1.8, гидролизующему ксилозные полимеры лигноцеллюлозного субстрата или очищенного ксилана.

В дополнение к отмеченному целлюлазы можно классифицировать по разным гликозилгидролазным семействам в соответствии с их первичной последовательностью, подтвержденной анализом трехмерной структуры некоторых членов семейства (Henrissat 1991, Henrissat and Bairoch 1993, 1996). Некоторые гликозилгидролазы являются многофункциональными ферментами, которые содержат каталитические домены, принадлежащие к различным гликозилгидролазным семействам. Семейство 3 состоит из бета-глюкозидаз (EC 3.2.1.21), таких как описываемые здесь Ta BG_81, At BG_101 и Ct BG_76. Семейство 5 (ранее известное как celA) состоит, главным образом, из эндоглюканаз (EC 3.2.1.4), таких как описываемая здесь Ta EG_28. Семейство 7 (ранее целлюлазное семейство celC) содержит эндоглюканазы (EC 3.2.1.4) и целлобиогидролазы (EC 3.2.1.91), такие как описываемые здесь Ct EG_54, Ta CBH, At CBH_A, At CBH_C и Ct CBH. Семейство 10 (ранее celF) состоит, главным образом, из ксиланаз (EC 3.2.1.8), таких как описываемые здесь Ta XYN_30 и At XYN_60. Семейство 45 (ранее celK) содержит эндоглюканазы (EC 3.2.1.4), такие как описываемые здесь At EG_40 и At EG_40_подобная.

Целлюлолитические ферменты, полезные для гидролизации целлюлозного материала, получают из Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum или Chaetomium thermophilum. «Получают из» означает, что они могут быть получены из упомянутых видов, но это не исключает возможности получения их из других источников. Другими словами, они могут происходить из любого организма, включая растения. Предпочтительно они происходят из микроорганизмов, например, бактерий или грибков. Бактерии могут быть, например, из рода, выбранного из Bacillus, Azospirillum и Streptomyces. Более предпочтительно они происходят из грибков (включая филаментные грибки и дрожжи), например, из рода, выбранного из группы, состоящей из Thermoascus, Acremonium, Chaetomium, Achaetomium, Thielavia, Aspergillus, Botritis, Chrysosporium, Collibia, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melanocarpus, Myceliophthora, Myriococcum, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes и Trichoderma.

В соответствии с предпочтительным вариантом воплощения изобретения ферменты получают из штамма ALKO4242 Thermoascus aurantiacus, депонированного как CBS 116239, штамма ALKO4245, депонированного как CBS 116240 и классифицируемого в настоящее время как Acremonium thermophilium, или штамма ALKO4265 Chaetomium thermophilum, депонированного как CBS 730.95.

Целлобиогидролаза предпочтительно включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%-ную идентичность SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, или ее ферментативно активный фрагмент.

Целлобиогидролаза	Ген	Получаемая из	CBD	Нуклеиновая кислота SEQID NO:	Аминокислота SEQ ID NO:
Ta CBH	Ta cel7A	T. aurantiacus	-	1	2
At CBH_A	At cel7B	A. thermophilum	-	3	4
At CBH_C	At cel7A	A. thermophilum	+	5	6
Ct CBH	Ct cel7A	C. thermophilum	+	7	8

Эти CBHs имеют более выгодную константу целлюлозного ингибирования по сравнению с соответствующей константой CBH Trichoderma reesei, и они показывают лучшие результаты гидролиза при тестировании разных целлюлозных субстратов. SEQ ID NO: 2 и 4 не включают CBD. Особенно повышенные результаты гидролиза можно получить, когда целлюлозо-связывающий домен (CBD) присоединен к CBH, который не имеет своего собственного CBD. CBD может быть получен, например, из видов Trichoderma или Chaetomium, и предпочтительно он присоединен к CBH посредством линкера. Результирующий слитый протеин, содержащий CBH-коровую область, присоединенную к CBD посредством линкера, может включать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%-ную идентичность SEQ ID NO: 28 или 30. Такие слитые протеины кодируются полинуклеотидами, включающими последовательность SE