Комбинированная терапия с использованием антагонистов альфа5бета1

Комбинированная терапия с использованием антагонистов альфа5бета1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Представленное изобретение относится к использованию антагонистов VEGF и антагонистов альфа5бета1 для лечения рака и подавления ангиогенеза и/или подавления проницаемости сосудов, включая ненормальный ангиогенез при некоторых заболеваниях. Представленное изобретение также относится к использованию агонистов VEGFR и агонистов альфа5бета1 для повышения ангиогенеза и сосудистой проницаемости. Представленное изобретение также относится к антителам против альфа5бета1, включающим их составам и наборам и способам их изготовления и применения.

Уровень техники изобретения

Признана важная роль VEGF-A в патологическом и непатологическом ангиогенезе. Введение VEGF в моделях in vivo вызывает сильный ангиогенный ответ (Plouet, J et al., (1989) EMBO J. 8:3801-3808; Leung, D.W., et al., (1989) Science 246:1306-1309). Потеря одного аллельного гена VEGF-A приводит к повышению эмбриональной смертности у мышей (Carmeliet, P., et al., (1996) Nature 380:435-439; Ferrara, N et al., (1996) Nature 380:439-442). VEGF также известен в качестве фактора сосудистой проницаемости в связи с его способностью вызывать кровоизлияния (Senger, D.R. et al., (1995) Science 219:983-985; Dvorak, H.F., et al., (1995) Am. J. Pathol. 146: 1029-1039). Таким образом VEGF-A вовлечен в ангиогенез на этапе развития, воспроизводства и костный ангиогенез, в дополнение к другим непатологическим видам ангиогенеза.

VEGF-A связывается с двумя рецепторными тирозинкиназами (РТК), VEGFR-1 (Flt-1) и VEGFR-2 (KDR, Flk-1). Обычно считается, что VEGFR-2 является основным медиатором митогенных, ангиогенных и увеличивающих проницаемость действий VEGF-A. В феврале 2004 US Food and Drug Administration (FDA) одобрила бевацизумаб, гуманизированные моноклональные антитела против VEGF (фактора роста эндотелия сосудов)-A, для лечения метастатического рака кишечника в сочетании с основанными на 5-фторурациле (ФУ) режимами химиотерапии. Впоследствии FDA одобрила пегаптиниб, аптамер, который блокирует изоформу VEGF-A из 165 аминокислот, для лечения влажной (неоваскулярной) формы связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD).

Несмотря на эти достижения, многие пациенты, получающие лечение антагонистами VEGF в конечном счете становятся жертвами своей болезни. Следовательно, имеется потребность в разработке новых медикаментов и способов лечения для лечения заболеваний, которые более не поддаются или только частично поддаются терапии антагонистами VEGF. Также существует потребность в разработке альтернативных и/или лучших способов лечения для лечения рака и осложнившихся заболеваний, вызванных или затрагиваемых ненормальным ангиогенезом.

Краткое описание изобретения

Представленное изобретение относится к медикаментам и способам лечения пациентов, которые могут получить выгоду от уменьшения ангиогенеза, страдающих от ненормального ангиогенеза и/или страдающих от неоплазии. В соответствии с одним вариантом осуществления представленное изобретение предлагает способ ингибирования ангиогенеза и/или сосудистой проницаемости у субъекта, включающий стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антагониста альфа5бета1, одновременно или последовательно. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, представленное изобретение предлагает способ лечения субъекта, страдающего от заболевания, причем субъект или ранее реагировал на лечение заболевания антагонистом VEGF, но лишь частично, или уже не реагирует на антагонист VEGF, включающий стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества антагониста альфа5бета1. В соответствии с другим вариантом осуществления, представленное изобретение предлагает способ лечения субъекта, страдающего заболеванием, устойчивым или трудноизлечимым при помощи лечения антагонистом альфа5бета1, самостоятельно или в комбинации с химиотерапией, включающий стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества антагониста VEGF.

Представленное изобретение также касается новых антител против альфа5бета1, наборов и композиций, их включающих, и способов их изготовления или применения. В соответствии с одним из вариантов осуществления новые антитела против альфа5бета1 являются описанными здесь антителами 7H5 или 7H12, или их гуманизированной или химерной формой. В соответствии с другим отдельным вариантом осуществления антитела 7H5 или 7H12 или их химерные или гуманизированные формы могут находиться в форме фрагментов Fab, Fab', F(ab)'₂, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv, диатела, полиспецифического антитела и линейного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления новые антитела против альфа5бета1 могут быть конъюгированы с другим объектом, но не ограничиваясь перечисленным, таким как терапевтический препарат, или флуоресцентный краситель, или иной маркер для обнаружения альфа5бета1 у пациентов или в образцах от пациентов. Подобные новые антитела против альфа5бета1 могут быть использованы в различных терапевтических и диагностических методах. Например, такие антитела против альфа5бета1 могут быть использованы при лечении ненормального ангиогенеза, неоплазии, заболеваний глаз и аутоиммунных заболеваний. Подобные антитела могут быть использованы для обнаружения белка альфа5бета1 у пациентов или в образцах от пациентов путем осуществления контакта таких антител с белком альфа5бета1 у пациентов или в образцах пациентов и количественного или качественного определения связанных с белком альфа5бета1 антител против альфа5бета1.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления, представленное изобретение предлагает способ лечения рака у субъекта, включающий стадию введения антагониста VEGF и антагониста альфа5бета1 одновременно или последовательно. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления рак реагирует на терапию антагонистом VEGF. Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ лечения связанной с возрастом дегенерации желтого пятна у субъекта, страдающего от AMD, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антагониста альфа5бета1 одновременно или последовательно. По еще одному варианту осуществления предложен способ лечения аутоиммунных заболеваний у субъекта, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антагониста альфа5бета1 одновременно или последовательно.

В одном из вариантов осуществления подвергающемуся лечению субъекту может быть сначала введен антагонист VEGF, а затем проведено лечение антагонистом альфа5бета1. В другом варианте осуществления, субъект подвергается лечению антагонистом VEGF и антагонистом альфа5бета1 одновременно. В соответствии с другим вариантом осуществления субъект подвергается лечению антагонистом VEGF до тех пор, пока субъект не перестанет реагировать на лечение антагонистом VEGF, после чего субъект подвергается лечению антагонистом альфа5бета1. В одном отдельном варианте осуществления субъект подвергался лечению антагонистом VEGF, если рак был неинвазивным или на ранней стадии и подвергался лечению альфа5бета1 антагонистом, когда рак был инвазивным. По другому варианту осуществления субъект, подвергавшийся лечению антагонистом альфа5бета1, имел повышенный уровень альфа5бета1 в пораженной болезнью ткани по сравнению с тканью от субъекта, не страдающего заболеванием. В этом случае способ может далее включать стадию обнаружения альфа5бета1 у субъекта, например в больной ткани после лечения антагонистом VEGF. В соответствии с одним вариантом осуществления инвазивным раком является метастазирующий рак. В соответствии с другим вариантом осуществления, рак на ранней стадии - это рак, излечиваемый вспомогательной терапией (например, химиотерапией или хирургическим удалением).

В одном предпочтительном варианте осуществления субъект, страдающий от болезни, имеет патологию ангиогенеза. В соответствии с другим вариантом осуществления, болезнь выбрана из группы, состоящей из рака, иммунного заболевания или глазного заболевания. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, заболевание выбрано из группы, состоящей из солидной опухоли, метастатической опухоли, опухоли мягких тканей, заболевания, связанного с неоваскуляризацией глаза, воспалительного заболевания, связанного с ненормальным ангиогенезом, заболевания, возникающего после трансплантации субъекту, и заболевания, связанного с ненормальным развитием сосудисто-волокнистой ткани. В соответствии с другим предпочтительным вариантом, болезнь выбрана из группы, состоящей из рака груди (включая метастатический рак груди), рака шейки матки, рака кишечника (включая метастатический рак кишечника), рака легких (включая немелкоклеточный рак легких), не-Ходжкинской лимфомы (NHL), хронического лимфолейкоза, почечноклеточного рака, рака простаты, включая устойчивый к гормонам рак простаты, рака печени, рака головы и шеи, меланомы, рака яичника, мезотелиомы, рака мягких тканей, желудочно-кишечная опухоль стромы, мультиформная глиобластома и множественная миелома. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, болезнь выбрана из группы, состоящей из ретинопатии, вызванной возрастом дегенерации желтого пятна (например, влажной AMD), диабетического отека сетчатки, покраснения радужки, псориаза, воспалительного заболевания почек, гемолитического уремического синдрома, диабетической ретинопатии (например, пролиферативная диабетическая ретинопатия), артрита (например, псориатического артрита, остеоартрита, ревматоидного артрита), воспалительной болезни кишечника, хронического воспаления, хронического отслоения роговицы, хронического увеита, хронического витрита, корнеального отторжения пересаженной ткани, корнеальной неоваскуляризации, корнеальной неоваскуляризации пересаженной ткани, болезни Крона, миопии, глазной неоваскулярной болезни, болезни Педжета, пемфигоида, полиартрита, пост-лазерной радиальной кератотомии, неоваскуляризации сетчатки, синдрома Шегрена, язвенного колита, отторжения имплантанта, воспаления легких, нефротического синдрома, отека, асцитов, связанных со злокачественными опухолями, удара, ангиофибромы и неоваскулярной глаукомы. В одном из вариантов осуществления, субъекту дополнительно вводится терапевтический препарат, выбранный из группы, состоящей из анти-неопластического препарата, химиотерапевтического препарата и цитотоксического препарата.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения, подвергающийся лечению антагонистом альфа5бета1 субъект страдает от рецидива после лечения антагонистом VEGF или стал невосприимчивым к лечению антагонистом VEGF. В соответствии с другим вариантом осуществления, подвергающийся лечению антагонистом альфа5бета1 и антагонистом VEGF субъект страдает от метастатического рака или ранее подвергался вспомогательной терапии. В одном варианте осуществления, заболевание у являющегося кандидатом пациента является рецидивом, невосприимчивым или устойчивым к химиотерапевтическим препаратам, таким как иринотекан. Примеры таких заболеваний включают, но не ограничены, метастатический рак кишечника, рецидив метастатического рака кишечника, метастатический рак груди, рецидив метастатического рака груди, метастатический рак груди HER2+, адъювантный рак груди, адъювантный рак груди HER2+, метастатический рак поджелудочной железы, адъювантный рак толстой кишки, адъювантный немелкоклеточный рак легких, адъювантный рак прямой кишки, адъювантный немелкоклеточный рак легких, метастатический немелкоклеточный рак легких, метастатический рак яичника, метастатический почечноклеточный рак и адъювантный почечноклеточный рак.

В соответствии с одним вариантом осуществления субъекту, страдающему от описанного здесь заболевания, после лечения антагонистом VEGF проводится поддерживающая терапия, где поддерживающая терапия подразумевает использование антагониста альфа5бета1 самого по себе или после, или одновременно с антагонистом VEGF.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антагонист VEGF может быть выбран из группы, состоящей из антитела, иммуноадгезина, пептитела, малой молекулы и нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF при жестких условиях (например, рибозим, siРНК или аптамер). В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антагонист VEGF является антителом. В соответствии с другим вариантом осуществления антитело является моноклональным антителом. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления связывание антител против VEGF с человеческим VEGF может быть полностью ингибировано антителами Avastin^®. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антитела против VEGF являются человеческими, гуманизированными или химерными. В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления антителами против VEGF является антитело Avastin^®. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела против VEGF выбраны из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)'₂, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления антагонист VEGF является биспецифическим антителом, которое связывается с VEGF и альфа5бета1 и является антагонистом альфа5бета1.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антагонист альфа5бета1 может быть выбран из группы, состоящей из антитела, иммуноадгезина, пептитела, малой молекулы и нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа5бета1, при жестких условиях.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист альфа5бета1 является антителом. В соответствии с другим вариантом осуществления антитело является моноклональным антителом. В соответствии со следующим вариантом осуществления, моноклональное антитело является химерным антителом, таким как антитело против человеческого альфа5бета1, известное как M200 или F200. В соответствии с одним вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 включают последовательность VH SEQ ID NO:1 и последовательность VL SEQ ID NO:2. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 включают последовательность SEQ ID NO:3 и последовательность SEQ ID NO:4. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 включают последовательность SEQ ID NO:4 и последовательность SEQ ID NO:5. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения связывание антител против альфа5бета1 с человеческим альфа5бета1 может быть полностью ингибировано антителами 7H5 или антителами 7H12. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 являются человеческими, гуманизированными или химерными. В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления антителами против человеческого альфа5бета1 являются антитело 7H5, антитело 7H12 или химерное, или гуманизированное антитело на их основе. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 выбраны из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)'₂, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления антагонист альфа5бета1 является биспецифическим антителом, которое связывает VEGF и альфа5бета1 и является антагонистом VEGF. В соответствии с еще одним вариантом осуществления антагонист анти-альфа5бета1 имеет измененную эффекторную функцию. В соответствии с одним вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 изменены с целью уменьшения или подавления антителозависимого клеточного цитотоксического действия (ADCC) или комплементзависимого цитотоксического действия (CDC) (например, путем изменения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Fc антитела). В соответствии с еще одним вариантом осуществления, антитела против альфа5бета1 были изменены для увеличения периода полужизни в человеческом организме (например путем изменения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок Fc антитела).

В соответствии с одним вариантом осуществления антагонист VEGF или антагонист альфа5бета1 конъюгирован с цитотоксическим препаратом или химиотерапевтическим препаратом. В соответствии с другим вариантом осуществления цитотоксический препарат является радиоизотопом или токсином.

Представленное изобретение предлагает композиции, включающие антагонист VEGF, антагонист альфа5бета1 и фармацевтически приемлемый носитель. Представленное изобретение также предлагает изделия, включающие инструкции по обнаружению альфа5бета1 у субъекта, подвергавшегося лечению антагонистом VEGF.

Представленное изобретение также касается применения агонистов VEGFR и агонистов альфа5бета1 для стимуляции ангиогенеза и проницаемости сосудов и композиций, включающих агонисты VEGFR, и агонисты альфа5бета1, и фармацевтически приемлемый носитель. Комбинированная терапия агонистами VEGFR и агонистами альфа5бета1 может быть использована при лечении различных заболеваний, при которых может наступить улучшение при увеличении ангиогенеза и сосудистой проницаемости, включая, например, излечение ран, такое как лечение хронических ран, острых ран и обычных ран.

Краткое описание фигур

Фигура 1 показывает увеличение популяции экспрессирующих альфа5бета1 клеток стромы после обработки ксенотрансплантированных опухолей HT29 антителами против VEGF, B20-4.1.

Фигура 2 представляет собой диаграмму, показывающую связывание антител 7H5 и 7Hl2 с клетками HUVEC в исследовании прямого связывания.

Фигура 3 показывает связывание антител 7H5 и 7H12 с клетками HUVEC, но не с клетками RAJI по данным анализа FACS.

Фигура 4 является диаграммой, показывающей адгезию HUVEC к фибронектину в присутствии очищенных моноклональных антител 7H5 и 7H12.

Фигура 5 представляет собой (А) столбчатую диаграмму, демонстрирующую действие 7H5 и 7H12 на развитие клеток HUVEC по общему числу клеток и (В) столбчатую диаграмму, демонстрирующую действие 7H5 и 7H12 на развитие клеток HUVEC по окраске Alamar blue в другом исследовании.

Фигура 6 представляет собой фотографию миграции клеток HUVEC после обработки 7H5 на 0 ч и 30 ч по сравнению с отрицательным контролем (IgG).

Фигура 7 представляет собой столбчатую диаграмму, количественно демонстрирующую миграцию клеток HUVEC после обработки 7H5 и 7H12.

Фигура 8 представляет собой столбчатую диаграмму, демонстрирующую процент клеток HUVEC, экспрессирующих активированную каспазу-3 в исследованиях апоптоза после обработки 7H5 и 7H12.

Фигура 9 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую активность каспазы 3/7 в клетках HUVEC после обработки 7H5 и 7H12.

Фигура 10 представляет собой диаграмму, демонстрирующую активность 7H12 и/или бевацизумаба на модели заживления раны уха кролика.

Фигура 11 демонстрирует результаты лечения антителами против VEGF с дополнением антителами против альфа5бета1 или без них на модели рака груди в виде (А) диаграммы, демонстрирующей средний объем опухоли в группе у подвергавшихся лечению мышей, или (В) график Каплана-Мейера, демонстрирующий процент животных, остающихся в исследовании, как функцию времени. Животные изымались из исследования, когда их опухоли достигали или превышали 1500 мм³.

Фигура 12 демонстрирует результаты лечения антителами против VEGF с дополнением антителами против альфа5бета1 или без них на модели рака толстой кишки в виде (А) диаграммы, демонстрирующей средний объем опухоли в группе у подвергавшихся лечению мышей, или (В) график Каплана-Мейера, демонстрирующий процент животных, остающихся в исследовании, как функцию времени. Животные изымались из исследования, когда их опухоли достигали или превышали 1500 мм³.

Фигура 13 демонстрирует результаты лечения антителами против альфа5бета1 или химиотерапевтическим препаратом на модели рака толстой кишки в виде (А) диаграммы, демонстрирующей средний объем опухоли в группе у подвергавшихся лечению мышей, или (В) график Каплана-Мейера, демонстрирующий процент животных, остающихся в исследовании, как функцию времени. Животные изымались из исследования, когда их опухоли достигали или превышали 1500 мм³.

Фигура 14 демонстрирует график Скэтчарда связывания ¹²⁵I-7H5 с альфа5бета1 на клеточной линии фибробластов кролика R9ab.

Фигура 15 демонстрирует график Скэтчарда связывания ¹²⁵I-7H12 с альфа5бета1 на клеточной линии фибробластов кролика R9ab.

Фигура 16 демонстрирует результаты картирования эпитопов IgG против интегрина альфа5бета1 и исследований конкурентного связывания различных антител против альфа5бета1.

Подробное описание изобретения

Не будучи связанными теорией, авторы сделали предположение, что увеличение восстановления популяции клеток стромы может доставлять к больным участкам иные факторы роста сосудов, что может компенсировать потерю активности VEGF у пациентов, подвергавшихся терапии антагонистами VEGF. Воздействие на экспрессирующие альфа5бета1 клетки стромы антителами против альфа5бета1 может приводить к уменьшению числа клеток стромы, таким образом, уменьшая продукцию потенциально компенсирующих факторов сосудистого роста. Альтернативно или дополнительно авторы предположили, что ингибирование взаимодействий между эндотелием и внеклеточным матриксом и частичное ингибирование взаимодействий связывания альфа5бета1 будет увеличивать эффективность лечения антагонистами VEGF путем ингибирования рецидивов ангиогенеза вдоль следов во внеклеточном матриксе, оставленных регрессирующими вследствие лечения антагонистом VEGF сосудами. Таким образом, лечение антагонистами альфа5бета1 одновременно с любым лечением антагонистами VEGF или после него может ингибировать восстановление сосудов после лечения антагонистом VEGF и, следовательно, возобновление неоваскулярного роста.

«Альфа5бета1», или «α5β1», или «a5б1» является интегрином, включающим два различных белка (т.е. субъединицы альфа5 и бета1). Для альфа5бета1 показано, что он связывается с фибронектином, L1-CAM и фибриногеном. Интегрин альфа5бета1 также называют белком очень поздней активации-5, VLA-5, альфа5бета1, CD49e/CD29, рецептором фибронектина, FNR и GPIc-IIa. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления альфа5бета1 является человеческим альфа5бета1.

«Альфа5» также известен как CD49e, альфа5, альфа5 субъединица интегрина, альфа субъединица VLA-5, субъединица IC GPIc-IIa и альфа цепь FNR имеет четыре изоформы, получающиеся в результате альтернативного сплайсинга (A-D). Вариации подвергаются цитоплазматические домены белков. Аминокислотные последовательности изоформ человеческого альфа5 могут быть найдены, например, под номерами доступа Genbank X07979, U33879, U33882 и U33880 соответственно.

«Бета1» также называют CD29, бета1, GPIIa тромбоцитов; бета-цепь VLA; бета-1 цепь интегрина, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 и VLA5B. Аминокислотные последовательности человеческого бета1 могут быть найдены, например под номером доступа Genbank X06256.

Термин «VEGF» или «VEGF-A», как он использован здесь, относится к 165-аминокислотному человеческому фактору роста эндотелиальных клеток сосудов и связанным 121-, 189-, и 206-аминокислотным человеческим факторам роста эндотелиальных клеток сосудов, как описано в Leung et al. Science, 246:1306 (1989), и Houck et al. Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991), наряду с встречающимися в природе аллельными и измененными их формами. Термин «VEGF» также относится к VEGF отличных от человека видов, таких как мышь, крыса или примат. Иногда VEGF от определенного вида указывается терминами, такими как hVEGF для человеческого VEGF, mVEGF для мышиного VEGF, и т.п. Термин «VEGF» также используется для обозначения укороченных форм полипептида, включающих аминокислоты от 8 до 109 или от 1 до 109 165-аминокислотного человеческого фактора роста эндотелиальных клеток сосудов. Ссылки на любые подобные формы могут быть обозначены в настоящей заявке, например, как «VEGF (8-109)», «VEGF (1-109)» или «VEGF₁₆₅». Положения аминокислот в «укороченном» природном VEGF пронумерованы, как они указаны в природной последовательности VEGF. Например, аминокислота в положении 17 (метионин) в укороченном природном VEGF соответствует аминокислоте 17 (метионину) в природном VEGF. Укороченный природный VEGF имеет сродство связывания к рецепторам KDR и FIt-1, сравнимое с природным VEGF. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления VEGF является человеческим VEGF.

Термин «антагонист VEGF» относится к молекуле, способной нейтрализовать, заблокировать, ингибировать, сделать неактивным, уменьшить или помешать действию VEGF, способом, включающим ее связывание с VEGF или одним или более рецепторов VEGF или кодирующими их нуклеиновыми кислотами. Предпочтительно, антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF. Антагонисты VEGF включают антитела против VEGF и их антиген-связывающие участки, полипептиды, которые связываются с VEGF или с рецепторами VEGF и блокируют взаимодействие лиганда с рецептором (например, иммуноадгезины, пептитела), антитела против рецептора VEGF и антагонисты рецептора VEGF, такие как низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR, аптамеры, которые связывают VEGF и нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при определенных условиях с последовательностями нуклеиновых кислот, которые кодируют VEGF или рецептор VEGF (например, иРНК). В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист VEGF связывается с VEGF и ингибирует VEGF индуцированную пролиферацию эндотелиальных клеток. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с большим сродством, нежели не с VEGF или с не с рецептором VEGF. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с Kd между 1 мкМ и 1 пМ. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с Kd между 500 нМ и 1 пМ.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, антагонист VEGF выбран из группы, состоящей из полипептида, такого как антитело, пептитело, иммуноадгезин, низкомолекулярное соединение или аптамер. В предпочтительном варианте осуществления антитело является антителом против VEGF, таким как антитело AVASTIN^® или антителом против рецептора VEGF, таким как антитела против VEGFR2 или против VEGFR3. Другие примеры антагонистов VEGF включают VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (сорафениб), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 и KRN-633.

Термин «антитело против VEGF» обозначает антитело, способное связываться с VEGF с достаточным сродством и специфичностью. Предпочтительно, антитело против VEGF по изобретению может быть использовано в качестве терапевтического препарата, ориентированного и препятствующего заболеваниям и состояниям, в которые вовлечено действие VEGF. Антитела против VEGF обычно не связываются ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как P1GF, PDGF или bFGF. Предпочтительными антителами против VEGF являются моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и моноклональные антитела против VEGF A.4.6.1, производимые гибридомой ATCC HB 10709. Более предпочтительно антитела против VEGF являются рекомбинантными гуманизированными моноклональными антителами против VEGF, выработанными в соответствии с Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, включая, но не ограничиваясь антителом, известным как бевацизумаб (BV; Avastin^®). В соответствии с другим вариантом осуществления, антитела против VEGF, которые могут быть использованы, включают, но не ограничены, антителами, раскрытыми в заявке WO 2005/012359. В соответствии с одним вариантом осуществления, антитела против VEGF включают вариабельные тяжелые и вариабельные легкие участки любого из антител, раскрытых на фигурах 24, 25, 26, 27 и 29 заявки WO 2005/012359 (например, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 и B20.4.1). В другом предпочтительном варианте осуществления, антитело против VEGF, известное как ранибизумаб является антагонистом VEGF, назначаемым при болезнях глаз, таких как диабетическая нейропатия и AMD.

Антитело против VEGF «бевацизумаб(BV)», также известное как "rhuMAb VEGF" или "Avastin^®", является рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом против VEGF, полученным в соответствии с Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. Оно включает мутантные структурные участки человеческого IgG1 и антигенсвязывающие определяющие комплементарность участки мышиного моноклонального антитела против hVEGF A.4.6.1, которое блокирует связывание человеческого VEGF с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть структурных участков, является производным человеческого IgG1, и приблизительно 7% последовательности является производным мышиного антитела A4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу приблизительно 149000 дальтон и гликозилирован. Другие антитела против VEGF включают антитела, описанные в патенте Соединенных Штатов № 6884879 и WO 2005/044853.

Антитела против VEGF ранибизумаб или антитела LUCENTIS^® или rhuFab V2 являются гуманизированными антителами со сформировавшимся сродством против человеческого фрагмента VEGF Fab. Ранибизумаб производится обычными методами рекомбинантной технологии с помощью экспрессионного вектора для Escherichia coli и бактериального ферментирования. Ранибизумаб не гликозилирован и имеет молекулярную массу приблизительно 48000 дальтон. См. WO98/45331 и US20030190317.

Термин «антагонист альфа5бета1» относится к любой молекуле, которая ингибирует биологическое действие альфа5бета1. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, молекула антагониста специфически связывает альфа5бета1. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, молекула антагониста связывается с альфа5. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист альфа5бета1 предпочтительно связывается с альфа5бета1 с большим сродством, нежели с интегринами, не являющимися альфа5бета1. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист выбран из группы, состоящей из полипептида, такого как антитело, пептитела, или иммуноадгезина, низкомолекулярного соединения или аптамера, который ингибирует связывание альфа5бета1 с его лигандами (в частности, фибронектином), или нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется при жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа5бета1 (например, иРНК, препятствующая экспрессии альфа5). Биологическое действие альфа5бета1 может быть любым из эффектов, их сочетанием или всеми эффектами, выбранными из группы, состоящей из (1) связывания с фибронектином, (2) увеличением миграции клеток на фибронектине, (3) увеличения выживаемости клеток, содержащих альфа5бета1 в присутствии фибронектина, (4) увеличения пролиферации клеток, содержащих альфа5бета1 в присутствии фибронектина, и (5) увеличения образования трубок из клеток, содержащих альфа5бета1 в присутствии фибронектина.

Примеры антагонистов-антител против альфа5бета1 включают M200 и F200 (WO 2004/089988A2), описанные здесь антитела 7Н5 и антитела 7Н12, и химерные, полностью человеческие и гуманизированные антитела на их основе. Например, антитела М200 и F200 могут быть получены из вариабельных тяжелых и вариабельных легких цепей мышиных антител против человеческого альфа5бета1, IIA1 (Pharmingen, San Diego, Ca). Примеры низкомолекулярных ингибиторов альфа5бета1 включают Ac-PHSCN-NH2 (WO-9822617A1) и (S)-2-[(2,4,6-триметилфенил)сульфонил]-амино-3-[7-бензилоксикарбонил-8-(2-пиридиниламиноэтил)-1-окса-2,7-диазаспиро-(4,4)-нон-2-ен-3-ил]карбониламино]пропионовую кислоту. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, антагонист альфа5бета1 связывается с альфа5бета1, но не связывается с альфаVбета3, альфаVбета5 или альфаVбета1. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, антагонист альфа5бета1 связывается с альфа5бета1 с Kd между 1 мкМ и 1 пМ. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения антагонист альфа5бета1 связывается с альфа5бета1 с Kd между 500 нМ и 1 пМ. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антителом против альфа5бета1 является антитело, которое может конкурировать с антителом 7Н5 или антителом 7Н12 при связывании с альфа5бета1 при исследовании конкурентного связывания. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, антителом является антитело, связывание которого с альфа5бета1 может быть полностью ингибировано антителами, производимыми гибридомой, депонированной как альфа5/бета1 7H5.4.2.8 (ATCC No. PTA-7421), или гибридомой, депонированной как Альфа5/бета1 7H12.5.1.4 (ATCC No. PTA-7420) 7 марта 2006 г.

Термин «агонист VEGFR» относится к молекуле, которая может активировать рецептор VEGF или увеличить его экспрессию. Агонисты VEGFR включают, но не ограничены, агонисты-лиганды VEGFR, варианты VEGF, антитела и активные фрагменты.

Термин «агонист альфа5бета1» относится к молекуле, которая может активировать альфа5бета1 или увеличивать его экспрессию. Агонисты альфа5бета1 включают, но не ограничены, например, лигандные агонисты альфа5бета1.

Молекулы, такие как антитела, характеризующиеся связыванием с перекрывающимися или сходными участками цели, могут быть идентифицированы путем проведения исследований конкурентного ингибирования/связывания.

В одном варианте осуществления клетки HUVEC или другие клетки, экспрессирующие альфа5бета1, использованы в исследованиях конкурентного ингибирования, для оценки расположения мест связывания двух антител против альфа5бета1 относительно друг друга был использован FACS. Например, клетки HUVEC могут быть промыты в конической пробирке и осаждены центрифугированием при 100 об/мин в течение 5 мин. Осадок обычно промывался два раза. Затем клетки могут быть ресуспендированы, подсчитаны и сохранены на льду до использования. В лунку может быть добавлено 100 мкл первого антитела против альфа5бета1 (например, начиная с концентрации 1 мкг/мл или более низкой концентрации). Затем в каждую лунку может быть добавлено 100 мкл клеток (например, 20×10⁵ клеток), после чего проводилась инкубация на льду в течение 30 мин. Затем в каждую лунку может быть добавлено по 100 мкл биотинилированных антител против альфа5бета1 (исходный раствор 5 мкг/мл), после чего проведено инкубирование на льду в течение 30 мин. Затем клетки были отмыты и осаждены центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант был удален. В лунку был добавлен (100 мкл, 1:1000) конъюгированный с R-пикоэритрином стрептавидин (Jackson 016-1 10-084). Затем планшета была завернута в фольгу и инкубирована на льду в течение 30 мин. После инкубирования осадок мог быть промыт и осажден центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок был ресуспендирован и перенесен в микропробирки для анализа FACS.

Термин «ангиогенный фактор или агент» обозначает фактор роста, который стимулирует развитие кровеносных сосудов, например, способствует ангиогенезу, росту клеток эндотелия, стабильности кровеносных сосудов, и/или васкулогенезу и т.д. Ангиогенные факторы включают, но не ограничены, например, VEGF и членами семейства VEGF, P1GF, семейством PDGF, семейством фактора роста фибробластов (FGF), лигандов TIE (ангиопоэтинов), эфрины, Del-1, факторами роста фибробластов: кислым (aFGF) и основным (bFGF), фоллистатином, фактором стимуляции колоний гранулоцитов (G-CSF), фактором роста гепатоцитов (HGF)/рассеивающим фактором (SF), интерлейкином 8 (IL-8), лептином, мидкином, плацентарным фактором роста, тромбоцитарным фактором роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF), тромбоцитарным фактором роста, в особенности PDGF-BB или PDGFR-бета, плейотрофином (PTN), програнулином, пролиферином, трансформирующим фактором роста альфа (TGF-alpha), пролиферином, трансформирующим фактором роста бета (TGF-beta), фактором некроза опухолей-альфа (TNF-alpha), фактором роста эндотелия сосудов (VEGF)/фактором проницаемости сосудов (VPF), и т.д. Они также включают факторы, ускоряющие заживление ран, такие как гормон роста, инсулин-подобный фактор роста-I (IGF-I), VIGF, эпидермальный фактор роста (EGF), CTGF и члены его семейства, и TGF-альфа и TGF-бета. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, таблицу 1, перечисляющую известные онкогенные факторы); и, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).

Термин «Kd» или «значение Kd» для антитела против VEGF в соответствии с данным