Соединения

Соединения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение касается связывающих членов, особенно молекул антитела, которые ингибируют биологические эффекты IL-6. Связывающие члены полезны для лечения заболеваний, связанных с IL-6, включая воспалительные болезни и опухоли.

Интерлейкин 6 (IL-6) представляет собой 26 кДа плейотропный провоспалительный цитокин, продуцируемый рядом типов клеток, включая стимулируемые фибробласты, моноциты и эндотелиальные клетки, которые формируют главный источник IL-6 in vivo. Клетки, такие как Т клетки, В клетки, макрофаги, кератиноциты, остеобласты и несколько других, могут продуцировать IL-6 при стимуляции. IL-6 также экспрессируется из опухолевых клеточных линий и опухолевых клеток, например клеток из карциномы легкого, рака простаты, миеломы, гипернефромы и сердечной миксомы [1, 2]. При невоспалительных состояниях IL-6 секретируется из жировой ткани [3]. Регулирование экспрессии IL-6 зависит от типа клетки, которая его продуцирует. В клетках множественной миеломы IL-6, по-видимому, действует в положительной обратной петле стимулирование роста клеток, а также продуцирование больше IL-6 [4, 5]. В других типах клеток IL-6, по-видимому, ингибирует рост и активацию клеток и может действовать как отрицательный регулятор для некоторых провоспалительных цитокинов.

Чтобы инициировать передачу сигналов клетки, IL-6 связывается с низкой аффиностью с трансмембранным рецептором, рецептором альфа IL-6 (также обозначается как IL-6Rα, IL-6Ra, IL-6R, gp80 или CD126), чтобы сформировать комплекс "IL-6:IL-6Ra". Этот комплекс связывается с gp130 сигнальным рецептором; IL-6Rα и gp130 вместе формируют высокоаффинный IL-6 связывающий участок и индуцируют формирование гексамера, состоящего из двух копий каждого из IL-6, IL-6Ra и gp130 [6]. Трансмембранные и цитоплазматические домены IL-6Ra не требуются для трансдукции сигнала, поскольку IL-6Ra также существует в виде растворимой секретируемой форме (sIL-6R или sIL-6Ra). Растворимый рецептор продуцируется или путем дифференциального сплайсинга сообщения IL-6Ra или протеолитического слущивания. SIL-6R способен к формированию комплекса рецептор-лиганда с IL-6, "IL-6:sIL-6Ra". Этот комплекс может связывать gp130 на клетках и таким образом инициирует клеточную передачу сигналов в gp130 положительных клетках, даже если эти клетки не экспрессируют IL-6Ra. Таким образом, SIL-6R имеет потенциал для расширения диапазона клеток, чувствительных к IL-6, и, как считают, играет важную роль в IL-6-опосредованном воспалении [7].

Была объяснена кристаллическая структура человеческого лиганда IL-6 [6]. Кристаллическая структура внеклеточного домена человеческого IL-6Ra [8] и гексамерная структура IL-6/IL- 6R/gp130 комплекса [9] были также выявлены. Эти структуры, объединенные с исследованиями мутагенеза, идентифицировали три участка на поверхности IL-6, которые вовлечены в функциональную активность IL-6 в комплексе с различными компонентами рецептора. Остатки участка 1 вовлечены во взаимодействие между IL-6 и IL-6Ra. Остатки участка 2 вовлечены во взаимодействие между IL-6 и gp130 цитокин-связывающим доменом. Остатки в участке 3 из IL-6 вовлечены во взаимодействие с Ig-подобным доменом второго gp130 в гексамерном комплексе. Был также идентифицирован четвертый участок на IL-6, где IL-6 взаимодействует со второй молекулой IL-6 в гексамерном IL-6/IL-6R/gp130 комплексе [10].

Был выделен ряд лиганд анти-IL-6 моноклональных антител. Проводились исследования картирования, которые показывают, что они связываются с различными связывающими участками, описанными выше, на поверхности человеческого IL-6 [11, 12, 13, 14, 15].

Были также получены многие анти-IL-6Ra моноклональные антитела, и их связывающие участки на IL-6Ra картированы [16, 14, 15, 17].

IL-6 принадлежит к семейству цитокинов, которое включает Интерлейкин 11 (IL-11), цилиарный нейротрофный фактор (CNTF), Онкостатин М (OsM), фактор, ингибирующий лейкоз (LIF), кардиотрофин-подобный цитокин (CLC) и Кардиотрофин 1 (СТ-1). У каждого из членов этого семейства есть их собственные специфичные альфа-субъединицы рецептора, и они формируют комплексы с общей рецепторной субъединицей gp130. Нацеленное разрушение gp130 гена является эмбрионально летальным [18, 19]. Все члены семейства IL-6 могут индуцировать экспрессию белков острой фазы из гепатоцитов.

Передача сигналов IL-6 вовлекает фосфорилирование тирозина киназами семейства JAK, и последующую активацию двух главных внутриклеточных сигнальных каскадов, SHP2/ERK МАРК и STAT1/3 пути, приводя к генной экспрессии через NF-IL-6 и АР 1 [18, 20].

IL-6 показывает широкий спектр биологических функций, включая гематопоэз, индукцию ответов острой фазы, активацию Т клеток, стимуляцию секреции антител, защиту хозяина от инфекции, активацию клеток миеломы и остеокластов [21, 22]. Обзор эффектов IL-6 см [23]. IL-6 был первоначально идентифицирован в качестве фактора дифференцирования В-клеток, произведенных Т клетками [24], но был впоследствии идентифицирован как мощный активатор и рост-промотирующий фактор многих типов клеток. Он индуцирует заключительное созревание В клеток в антитело-продуцирующие клетки и является существенным дополнительным фактором для активации и пролиферации Т клеток. Исследования показали, что IL-6 вовлечен в активацию автореактивных Т лимфоцитов и пролиферацию и дифференцирование цитотоксических Т клеток. IL-6 был вовлечен в гематопоэз как кофактор, вызывающий активацию и дифференцирование гематопоэтических стволовых клеток. Эффект IL-6 на ответ острой фазы также хорошо задокументирован [25]. IL-6 индуцирует множество белков острой фазы, включая фибриноген, альфа-анти-химотрипсин, сывороточный амилоидный А и С-реактивный белок из человеческих гепатоцитов. Белки острой фазы контролируют иммунные ответы и воспаление и оказывают воздействие на ремоделлирование ткани. Сывороточный уровень IL-6 хорошо коррелирует с уровнем С-реактивного белка при разных патологиях, что свидетельствует о причинной роли IL-6 в ответе острой фазы. IL-6, как так же показано, продуцируется остеобластами и, по-видимому, вовлечен в активацию остеокластов и резорбцию костей [26, 27, 28]. Как это ни парадоксально, было предложено, что IL-6 действует не только как провоспалительный цитокин, но и может также, при определенных обстоятельствах и типах клеток, ослаблять эффекты других провоспалительных цитокинов, что приводит к снижению воспаления.

Поскольку у IL-6 есть множество биологических эффектов, повышение уровня IL-6 рассматривается как ключевой цитокин при множестве показаний болезней. Уровни циркулирующего IL-6, как показано, повышаются при болезнях, таких как ревматоидный артрит, болезнь Кастельмана, Ювенильный идиопатический артрит и Болезнь Крона [29]. Из-за этого IL-6 был вовлечен в ведение патологии при этих воспалительных показаниях. Кроме того, множество типов опухоли, как было показано, стимулировалось IL-6, включая меланому, почечно-клеточную карциному, саркому Капоши, карциному яичника, лимфому, лейкемию, множественную миелому и карциному простаты [30]. Кроме того, при нескольких типах рака сообщалось об увеличении циркулирующих уровней IL-6. При некоторых показаниях рака повышенные уровни IL-6 использовались в качестве прогностических индикаторов болезни.

Из-за роли IL-6 при болезни в качестве потенциальных методов лечения был разработан ряд мышиных и химерных античеловеческих IL-6 моноклональных антител.

US5856135 описывает измененное человеческое антитело к IL-6, полученное из мышиного моноклонального антитела "SK2".

JP-10-66582 сообщает о химерном антителе к IL-6, которое обозначается как распознавание спирального D участка IL-6 (участок 1).

WO2004/020633 (ЕР1536012) описывает молекулу человеческого scFv антитела к IL-6, выделенную с использованием технологии фагового дисплея. scFv, как сообщается, имеет аффинность, равную 13 нМ.

Мышиное антитело анти-IL-6, элсилимомаб (также известен как В-Е8) использовалось для лечения пациентов с Множественной миеломой [31, 32], почечно-клеточной карциномой [33] и ревматоидным артритом [34], и при определенных диагностических маркерах отмечались улучшения у леченых пациентов со всеми тремя болезнями. ВЕ-8 также использовался для лечения ВИЧ-положительных пациентов с иммунобластной или полиморфной крупноклеточной лимфомой [35] с облегчением системных симптомов (то есть лихорадки, потоотделения, кахексии) и супрессией спонтанного роста лимфомы приблизительно у 50% пациентов.

Однако быстрое выведение этого антитела из организма и возможные анафилактические реакции из-за продукции человеческих антимышиных антител (НАМА) к элсилимомабу ограничили его использование в клинической практике [36].

В целом, клиническое использование мышиных моноклональных антител ограничено, так как антитела часто вызывают НАМА. Часто продуцируются НАМА, направленные против части Fc иммуноглобулина мыши, что приводит к быстрому клиренсу анти-IL-6 mAb и возможному возникновению анафилактической реакции [36].

Также известно, что фармакокинетика антител мыши у людей отличается от человеческих антител, имеющих более короткие периоды полувыведения и увеличенные скорости клиренса.

Чтобы уменьшить иммуногенность мышиных антител у людей, были сконструированы химерные антитела с мышиными вариабельными участками и человеческими константными участками. Химерное человек-мышь антитело анти-IL-6 cCLB8 (известное как CNTO 328) использовалось для лечения пациентов с множественной миеломой [5, 37], при этом стабилизация болезни отмечалась у большинства пациентов.

Однако, хотя химерные антитела менее иммуногенны, чем мышиные MAbs, сообщалось об ответах человеческого антихимерного антитела (HACAs) [38].

Были выполнены исследования картирования cCLB8, которые показывают, что это ингибитор участка I активности IL-6. Brakenhoff и соавт. [39] продемонстрировали, что cCLB8 связывается с мутантами IL-6 аминотерминальной делеции Pro46, Ser49, Glu51, Ile53, Asp54 и также связывается с мутантами делеции Asp62

и Met77 (хотя при сниженной аффинности). Те же самые авторы показывают, что cCLB8 ингибирует IL-6 дикого типа, но не C-терминальную делецию 5 в исследовании В9-клеточной пролиферации и что cCLB8 не будет связывать IL-6 del С-4, у которого удалены последние 4 С-терминальные аминокислотные остатки. Эти данные свидетельствуют, что cCLB8 связывается с эпитопом, включающим С-терминальные остатки IL-6.

Kalai и соавт. [17] продемонстрировали, что cCLB8 был не в состоянии распознавать IL-6 мутанты F106E, F102E/F106E или R207E/R210E. Однако антитело действительно распознает IL-6 мутанты R207E и R207W. Связывание cCLB8 с мутантами R207W & R207E составляет приблизительно 50% от связывания по сравнению с диким типом, что свидетельствует о том, что остатки F106 и R210 вовлечены в CCLB8 связывающий эпитоп и остаток R207 вовлечен в связывание, но имеют меньший эффект, чем остатки F106 и R210. cCLB8 связывает мутанты IL-6 участка - I R196M, K199N/Q203L и Q203L со 100% активностью по сравнению с диким типом. Brakenhoff и соавт. [13] продемонстрировали, что cCLB8 связывает следующие варианты IL-6; Q182H, N183K, W185Q, W185G, W185R, Т190Р, Q182H/Q184P, W185R/S197N, Q187E/T190P, I164L/L186R/M189I, что не является удивительным, так как большинство из них являются дистально отделенными от остатка IL-6 участка 1.

Положительный эффект ингибирования IL-6 сигнального пути при раке и воспалительных заболеваниях был в дальнейшем подчеркнут при помощи гуманизированного анти-IL-6Ra антитела Тоцилизумаб (так же известном, как hPM-1, MRA и Actemra). Это гуманизированная версия мышиного анти-IL6Ra антитела РМ-1. Лечение пациентов с этим антителом оказалось эффективным при ряде болезней, включая ревматоидный артрит, Ювенильный идиопатический артрит, болезнь Крона, миелопролиферативное расстройство, болезнь Кастельмана и Системную красную волчанку [40].

Мы преуспели в выделении очень мощных, высокоаффинных связывающих членов для IL-6. Вследствие их высокой аффинности и мощности и их результата в функциональных исследованиях, описанного в настоящей заявке, связывающие члены согласно изобретению особенно подходят для использования в терапевтическом и/или диагностическом лечении организма животных или человека.

Связывающие члены полезны для лечения расстройств, связанных с IL-6, как подробно описано в настоящей заявке далее.

Человеческое анти-IL-6 антитело для лечения воспалительных заболеваний и рака обеспечивает существенные преимущества перед существующими подходами. Например, человеческие антитела не индуцируют ответы НАМА или НАСА и имеют более длительный период полувыведения in vivo по сравнению с нечеловеческими или химерными антителами.

Мы также установили, что связывающие члены для IL-6 предлагают существенные преимущества по сравнению со связывающими членами для IL-6Ra, особенно с точки зрения введения in vivo и лечения, как описано в настоящей заявке далее.

Как описано более подробно в Примерах, мы выделили родительскую молекулу антитела, обозначенную CAN022D10, с набором последовательностей CDR, как показано в Таблице 7. Через процесс оптимизации мы получили группу клонов антитела: Антитела 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 и 23 с последовательностями CDR, полученными из родительских последовательностей CDR и имеющих замены в положениях, обозначенных в Таблице 7.

Таким образом, например, можно отметить из Таблицы 7, что у Антитела 2 есть родительская последовательность HCDR1, в которой остаток Kabat 35 заменен на Thr (SEQ ID NO:13). Антитела 14 и 22 содержат дополнительный остаток, то есть аминокислотную инсерцию, в HCDR3: Ilе на остатке Kabat 100D, которая не присутствует в родительской последовательности HCDR3 SEQ ID NO:5. Антитела 7, 8, 10, 16-19, 21 и 23 не содержат остаток Kabat 95 в LCDR3, тогда как родительский LCDR3 (SEQ ID NO:10) включает Pro в остатке Kabat 95. У родительских HCDR3 и HCDR3 последовательностей всех антител 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 и 23 есть Trp в остатке Kabat 95 и Asp в остатке Kabat 101, что указывает на то, что Н95 Trp и Н101 Asp могут способствовать связыванию и/или силе действия для IL-6 в связывающих членах изобретения.

Домен VH, домен VL и последовательности CDR родительского антитела CAN022D10, и антител 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 и 23, описанных в настоящей заявке, показаны в приложенном списке последовательностей.

Как описано более подробно ниже, связывающие члены согласно изобретению, как показано, нейтрализовали IL-6 с высокой силой действия. Нейтрализация означает ингибирование биологической активности IL-6. Связывающие члены согласно изобретению могут нейтрализовать одну или несколько активностей IL-6. Ингибируемая биологическая активность типично представляет собой IL-6 связывание с одним или несколькими его связывающими партнерами. Например, ингибируемой биологической активностью может быть связывание IL-6 с трансмембранным и/или растворимым IL-6Ra. Это продемонстрировано в следующих испытаниях, которые кратко описаны в настоящей заявке и более подробно ниже: испытание TF-1 показывает, что связывающие члены согласно изобретению ингибируют IL-6 связывание с мембранным IL-6Ra, поскольку клетки TF-1, по-видимому, не продуцируют растворимый IL-6Ra. Также, поэтому связывающие члены согласно изобретению ингибируют IL-6 связывание с мембранным рецептором. В испытании синовиальных фибробластов связывающие члены согласно изобретению ингибируют IL-6 связывание с растворимым IL-6Ra, так как для того, чтобы оно работало, необходимо включать sIL-6Ra в это испытание. Добавленный IL-1бета вызывает выработку эндогенного IL-6, который при ингибировании связывающим членом согласно настоящему изобретению предотвращает выработку VEGF.

В соответствии с изобретением, связывание IL-6 человека или нечеловеческого примата, например обезьяны cynomolgus, с IL-6Rα, может быть ингибировано, например, связывающий член может ингибировать связывание зрелого человеческого IL-6 с IL-6Rα.

Ингибирование биологической активности может быть частичным или полным. Связывающие члены могут ингибировать биологическую активность IL-6 на 100%, или по крайней мере 95%, по крайней мере 90%, по крайней мере 85%, по крайней мере 80%, по крайней мере 75%, по крайней мере 70%, по крайней мере 60%, или по крайней мере 50% активности в отсутствии связывающего члена.

Может быть определена нейтрализирующая сила действия связывающего члена. Сила действия обычно выражается как значение IC₅₀, в нМ, если не указано иначе. В функциональных испытаниях IC₅₀ - концентрация связывающего члена, которая уменьшает биологический ответ на 50% от его максимума. В исследованиях связывания лиганда IC₅₀ - концентрация, которая уменьшает формирование комплекса рецептор-лиганд на 50% от максимального уровня специфичного связывания. IC₅₀ можно вычислить путем построения графика % максимального биологического ответа как функции логарифма концентрации связывающего члена и, используя программу, такую как Prism (GraphPad) или Origin (Origin Labs), чтобы приспособить сигмоидальную функцию к данным, для получения значений IC₅₀. Сила действия может быть определена или измерена с использованием одного или нескольких испытаний, известных квалифицированному специалисту и/или описанных либо упомянутых в настоящей заявке.

Нейтрализация активности IL-6 связывающим членом в испытании, описанном в настоящей заявке, например испытании пролиферации TF-1 или других клеточных испытаниях, описанных ниже, указывает, что связывающий член связывает и нейтрализует IL-6. Другие методы, которые могут использоваться для определения связывания связывающего члена с IL-6, включают ELISA, Вестерн блот, иммунопреципитацию, аффинную хроматографию и биохимический анализ.

Связывающие члены, описанные в настоящей заявке, как было продемонстрировано, связываются и нейтрализуют биологические эффекты эндогенного человеческого IL-6, как показано в испытании ингибирования высвобождения VEGF из человеческих синовиальных фибробластов в ответ на эндогенный человеческий IL-6, что сообщается в Примерах 1.7 и 2.7 в настоящей заявке. В этом испытании синовиальные фибробласты от пациентов с ревматоидным артритом продуцируют IL-6 в ответ на стимуляцию с помощью IL-1β и растворимого IL-6Rα, что приводит к индуцированной IL-6 секреции VEGF. 1L-6, выработанный человеческими синовиальными фибробластами, таким образом, представляет собой эндогенный человеческий IL-6. Эндогенный IL-6 - молекулярная мишень для лечения у людей, таким образом, нейтрализация эндогенного IL-6 является важным индикатором терапевтического потенциала связывающих членов. Так как испытание проводилось с синовиальными фибробластами, полученными от пациентов с ревматоидным артритом, результаты особенно значимы для использования связывающих членов для лечения ревматоидного артрита. Нейтрализирующая сила действия оптимизированных молекул антитела, проверенных в испытании высвобождения VEGF, превзошла таковую для известного антитела анти Il-6 CNTO-328.

У связывающего члена согласно изобретению может быть IC₅₀ меньше, чем 50 нМ, например меньше, чем 5 нМ, например меньше, чем 1 нМ в испытании ингибирования высвобождения VEGF из человеческих синовиальных фибробластов, стимулируемых с помощью 0,6 пкМ человеческого IL-1β и 2,4 нМ растворимого человеческого IL-6Rα.

Эндогенный IL-6, как известно, является смесью гликозилированных и негликозилированных форм. Связывание связывающего члена согласно изобретению с эндогенным IL-6 было продемонстрировано в испытании синовиальных фибробластов, так как это испытание использует IL-6 из человеческих синовиальных фибробластов, то есть эндогенный IL-6.

Связывающий член согласно изобретению может ингибировать индуцированную IL-6 пролиферацию клеток TF-1. TF-1 - человеческая предмиелоидная клеточная линия, полученная от пациента с эритролейкемией (Kitamura и соавт. 1989). Клеточная линия TF-1 требует присутствия фактора роста для выживания и пролиферации. Индивидуальные факторы роста, на которые могут ответить клетки TF-1, включают IL-6, GM-CSF и Онкостатин М. Связывающий член согласно изобретению может иметь IC₅₀ меньше, чем 100 нМ, например меньше, чем 20 нМ, 10 нМ или 1 нМ, например меньше, чем 100 пМ, 70 пМ, 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 20 пМ или 10 пМ, в испытании для ингибирования пролиферации клеток TF-1 в ответ на 20 пМ человеческого IL-6. Как описано в настоящей заявке (см. Пример 1.5), родительский IgG "CAN022D10", как показано, имел IC₅₀ в испытании пролиферации TF-1, составляющую приблизительно 93 нМ, и мы впоследствии получили оптимизированные варианты CAN022D10, имеющие существенно увеличенную силу действия (IC₅₀ вообще меньше, чем 100 пМ), как показано в Примерах 2.2, 2.5 и 2.6 (Таблицы 3, 4 и 5 соответственно). Особенно, измеренные для некоторых из оптимизированных клонов значения IC₅₀ составили всего лишь 5 пМ или меньше, например, зародышевого IgG Антитела 7, Антитела 17 и Антитела 18, представляя чрезвычайно высокую нейтрализирующую силу действия этих антител.

Связывающий член согласно изобретению может ингибировать индуцированную IL-6 пролиферацию клеток В9. Клетки В9 - подклон мышиной В-клеточной линии гибридомы, В13.29, выбранные на основе их специфичного ответа на IL-6. Клетки В9 требуют IL-6 для выживания и пролиферации и отвечают на очень низкие концентрации IL-6. Также, может быть оценена пролиферация этих клеток в присутствии антитела IL-6 и определена аффинность антитела. Пример 2.10 авторов показывает, что Антитело 18 ингибировало пролиферацию клеток В9 в ответ на IL-6 и показало высокую аффинность в этом испытании.

При ревматоидном артрите происходит выработка аутоантитела, главным образом, класса IgM. SKW6.4 - кленовая IgM секретирующая человеческая лимфобластоидная В-клеточная линия.

При стимуляции с помощью IL-6 эти клетки секретируют IgM, таким образом, это испытание было воспринято как имеющее значение для ревматоидного артрита. Клетки SKW6.4 могут использоваться в испытании для определения силы действия связывающих членов для того, чтобы нейтрализовать IL-6 путем определения ингибирования секреции IgM в ответ на IL-6. Связывающий член согласно изобретению может иметь IC₅₀, составляющую меньше, чем 10 пМ, например меньше, чем 5 пМ, в испытании с клетками SKW6.4 ингибирования секреции IgM в ответ на 100 пМ человеческого IL-6. Антитело 18, как показано, нейтрализует эффекты IL-6 в этом испытании - см. Пример 2.11 (Таблица 9).

Изобретение предлагает высокоаффинные связывающие члены для человеческого IL-6. Была также продемонстрирована высокая аффинность к IL-6 от обезьяны cynomolgus. Связывающий член согласно изобретению может связывать человеческий IL-6 и/или IL-6 cynomolgus с K_D, составляющей не больше чем 1 нМ, например не больше чем 100 пМ, 50 пМ, 30 пМ или 10 пМ. K_D может быть определена, например, с помощью поверхностного плазменного резонанса. BIAcore®. Измерения BIAcore® аффинности описаны в настоящей заявке в Примере 2.9. Характерно, аффинность Антител 7 и 18, как обнаружено, находилась вне предела, измеряемого с использованием инструмента BIAcore®, указывая на значение K_D ниже 10 пМ.

Как описано в другом месте в настоящей заявке, поверхностный плазменный резонанс вовлекает прохождение аналита в жидкую фазу через лиганд, прикрепленный к основе, и определение связывания между аналитом и лигандом. Поверхностный плазменный резонанс может, например, быть выполнен посредством пропускания IL-6 в жидкой фазе через связывающий член, прикрепленный к основанию. Данные поверхностного плазменного резонанса могут быть подогнаны к модели данных одновалентного аналита. Константа аффинности Kd может быть вычислена из соотношения констант скорости kd/ka, определенных поверхностным плазменным резонансом с использованием модели данных одновалентного аналита.

Аффинность связывающего члена для IL-16 может альтернативно быть вычислена с помощью анализа Шильда, например, основанном на испытании ингибирования пролиферации клеток TF-1 в ответ на различные концентрации человеческого IL-6. Связывающий член согласно изобретению может иметь аффинность, составляющую меньше, чем 10 пМ, например меньше, чем 1 пМ, как вычислено анализом Шильда. Как сообщается в Примере 2.10 в настоящей заявке, аффинность Антитела 18 для человеческого IL-6 была вычислена как 0,4 пМ с использованием анализа Шильда.

Связывающий член согласно изобретению может (необязательно) не реагировать перекрестно с одним или несколькими или всеми из следующих: фактор, ингибирующий лейкоз (LIF), цилиарный нейротрофный фактор (CNTF), IL-11 или онкостатин М.

Связывающий член согласно изобретению может (необязательно) не реагировать перекрестно с крысиным IL-6, мышиным IL-6 и/или собачьим IL-6.

Перекрестная реактивность связывающих членов для связывания других белков или нечеловеческого IL-6 может быть проверена, например, в испытании флюоресценции с временным разрешением для ингибирования связывания человеческого IL-6 со связывающим членом, иммобилизированным на подложке, таком как испытание конкуренции эпитопа DELFIA®, как описано в Примере 1.6. Например, любой или все из LIF, CNTF, IL-11, онкостатина М, крысиного IL-6 и мышиного IL-6 могут показать отсутствие ингибирования меньше чем 50% ингибирование, или могут иметь IC₅₀, составляющую больше чем 0,5 мМ, или больше чем 1 мМ в испытании флюоресценции с временным разрешением для ингибирования связывания меченого человеческого IL-6 со связывающим членом, иммобилизированным на подложке. Например, любой или все из LIF, CNTF, IL-11, онкостатина М, крысиного IL-6 и мышиного IL-6 могут показать отсутствие ингибирования или могут иметь IC₅₀, по крайней мере 10- или 100-кратно больше, чем таковая для немеченого человеческого IL-6 в испытании флюоресценции с временным разрешением для проверки перекрестной реактивности. В этом испытании меченый зрелый человеческий IL-6 дикого типа используется в конечной концентрации Кd его взаимодействия со связывающим членом.

Связывающий член согласно изобретению может перекрестно реагировать с IL-6 cynomolgus. Перекрестная реактивность может быть определена как ингибирование связывания меченого человеческого IL-6 со связывающим членом, иммобилизированным на подложке, в испытании флюоресценции с временным разрешением, описанном выше. Например, IL-6 cynomolgus может иметь IC₅₀, составляющую меньше, чем 5 нМ, например меньше, чем 2,5 нМ, например, приблизительно 1 нМ, в этом испытании флюоресценции с временным разрешением. У IL-6 Cynomolgus может быть IC₅₀, менее чем отличающаяся в 10 раз, например менее чем 5-кратно отличная, от IC₅₀ немеченого человеческого IL-6 в этом испытании.

Детальный протокол для испытания флюоресценции с временным разрешением для определения перекрестной реактивности предоставлен в разделе Материалы и Методы. Примеры данных перекрестной реактивности, полученных в этом испытании, показаны в Таблице 2 в Примере 1.6.

Как сообщается в Примере 2.8, связывающие члены, описанные в настоящей заявке, показали высокую перекрестную реактивность с IL-6 cynomolgus, и не показали никакой или ограниченную перекрестную реактивность с крысиным, мышиным или собачьим IL-6.

Данные перекрестной реактивности указывают, что связывающие члены, описанные в настоящей заявке, связывают эпитоп на IL-6, который сохранен между IL-6 последовательности человека и cynomolgus, и различен в мышиной, крысиной и собачьей последовательности IL-6 по сравнению с человеческой последовательностью.

Связывающие члены, описанные в настоящей заявке, как полагают, связывают участок "сайта 1" IL-6, который является участком, взаимодействующим с IL-6Rα. Связывающие члены согласно изобретению могут таким образом конкурентно ингибировать связывание IL-6 с IL-6Rα, нейтрализуя таким образом биологические эффекты IL-6, которые опосредуются через IL-6Rα.

Мы исследовали способность одного из антител, описанных в настоящей заявке. Антитела 18, связывать мутантный человеческий IL-6, в котором мутации были спроектированы в остатках сайта 1. Как описано в Примере 3, мы идентифицировали мутации в человеческом IL-6, что привело к снижению связывания Антителом 18, указывая на то, что мутированные остатки были вовлечены в распознавание Антителом 18 и могут являться частью эпитопа на IL-6, связанного этим антителом.

Например, в испытании флюоресценции с временным разрешением для ингибирования связывания меченого человеческого IL-6 дикого типа с Антителом 18, иммобилизированным на подложке, никакого ингибирования не наблюдалось для Arg207Glu мутантного человеческого IL-6 (SEQ ID NO:177), указывая на то, что Антитело 18 связывает человеческий IL-6 в остатке Arg207.

Так как Антитело 18 и Антитела 2, 3, 4, 5, 1, 8, 10, 14, 16, 17, 19, 21, 22 и 23 были все получены из родительского антитела CAN22C10, и все имеют структурно родственные CDR, все эти молекулы антитела, как ожидается, свяжут тот же самый или очень подобный перекрывающийся эпитоп. Соответственно, результаты картирования эпитопа, полученные с Антителом 18, как так же ожидается, будут характерными для CAN22D10 других оптимизированных антител, описанных в настоящей заявке.

Связывающий член согласно изобретению может связывать человеческий IL-6 в Phe102 и/или Ser204. Связывающий член согласно изобретению может также связать человеческий IL-6 в Arg207. Необязательно связывающий член может связать фланкирующие остатки или структурно соседние остатки в молекуле IL-6, в дополнение к связыванию Phe102 и/или Сера 204. По соглашению, нумерация остатков соответствует полноразмерному человеческому IL-6 (SEQ ID NO:161). Однако связывание может быть определено с использованием зрелого человеческого IL-6. Связывание с остатками IL-6 такое, как определено с помощью сайт-направленного мутагенеза, что объясняется ниже.

Мутагенез отдельных аминокислот и участков белков для того, чтобы скоррелировать структуру с активностью, хорошо известны специалисту, квалифицированному в данной области и использовались для определения участков белков, которые связываются с антителами [41]. Связывание и/или нейтрализация мутантного человеческого IL-6 может использоваться для оценки связывания связывающим членом Phe102, Ser204 и/или Arg207. Отсутствие связывания или нейтрализации, или значительно уменьшенное связывание или нейтрализация с мутантным IL-6 по сравнению с диким типом указывает на то, что связывающий член связывает мутированный остаток.

Связывание с остатком в IL-6 может быть определено с использованием IL-6, мутированного в выбранном остатке в испытании флюоресценции с временным разрешением ингибирования связывания меченого человеческого IL-6 дикого типа, со связывающим членом, иммобилизированным на подложке, причем меченый зрелый человеческий IL-6 дикого типа находится в конечной концентрации, равной Kd его взаимодействия со связывающим членом. Пример этого испытания и полученных данных по конкуренции показаны в Примере 3, с результатами, представленными в Таблице 10. В случае, когда мутантный IL-6 не ингибирует связывание меченого IL-6 дикого типа со связывающим членом, или когда мутантный IL-6 имеет IC50 больше чем IC50 немеченого IL-6 дикого типа (например, более чем 10-кратно или 100-кратно больше), это указывает на то, что мутированный остаток связан связывающим членом.

Phe102Glu мутантный человеческий IL-6 (SEQ ID NO:175), Ser204Glu мутантный человеческий IL-6 (SEQ ID NO:176) и/или Arg207Glu мутантный человеческий IL-6 (SEQ ID NO:177) могут показать отсутствие ингибирования или могут иметь IC₅₀, которая больше чем 100-кратно больше, чем IC₅₀ человеческого IL-6 дикого типа (SEQ ID NO:165), в испытании флюоресценции с временным разрешением для ингибирования связывания меченого человеческого IL-6 дикого типа, со связывающим членом изобретения, иммобилизированным на подложке, причем меченый человеческий IL-6 дикого типа находится в конечной концентрации, равной Kd его взаимодействия со связывающим членом.

Связывающий член согласно изобретению может (необязательно) не связывать и/или не нейтрализовать мутантный человеческий IL-6, имеющий мутацию в остатке Phe102, Ser204 и/или Arg207, например мутацию Phe102Glu, Ser204Glu, Ser204Tyr и/или Arg207Glu. Примеры последовательностей мутантного человеческого IL-6 включают SEQ ID NOS:175-177. Таким образом, связывающий член согласно изобретению может не ингибировать связывание одной или нескольких этих мутантных молекул IL-6 с IL-6Rα.

Связывающий член согласно изобретению может включать молекулу антитела, например молекулу человеческого антитела. Связывающий член обычно включает VH и/или VL домен антитела. VH и VL домены связывающих членов также предлагаются как часть изобретения. В пределах каждого VH и VL доменов находятся участки, определяющие комплементарность, ("CDR"), и каркасные участки, ("FR"). VH домен включает ряд HCDR, а VL домен включает ряд LCDR. Молекула антитела может включать VH домен антитела, включающий VH CDR1, CDR2 и CDR3 и каркас. Она может альтернативно или также включать VL домен антитела, включающий VL CDR1, CDR2 и CDR3 и каркас. Каркас VH или VL домена включает четыре каркасных участка, FR1, FR2, FR3 и FR4, рассеянных с CDR в следующей структуре:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

Примеры VH и VL доменов антитела и CDR согласно настоящему изобретению перечислены в приложенном списке последовательностей, который является частью настоящего раскрытия. Дальнейшие CDR раскрыты ниже и в Таблице 7. Все VH и VL последовательности, CDR последовательности, наборы CDR и наборы HCDR и наборы LCDR, раскрытые в настоящей заявке, представляют аспекты и варианты осуществления изобретения. Как описано в настоящей заявке, "набор CDR" включает CDR1, CDR2 и CDR3. Таким образом, набор HCDR касается HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и набор LCDR касается LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Если не указано иначе, "набор CDR" включает HCDR и LCDR. Типично связывающие члены согласно изобретению представляют собой моноклональные антитела.

Связывающий член согласно изобретению может включать антиген-связывающий участок в пределах молекулы неантитела, обычно предоставляемой одним или несколькими CDRM, например набором CDR в остове белка неантитела, как обсуждается далее ниже.

Описанный в настоящей заявке связывающий член, включающий родительский набор CDR, как показано в Таблице 7, для родительского CAN022D10, в котором HCDR1 - SEQ ID NO:3 (остатки Kabat 31-35), HCDR2 - SEQ ID NO:4 (остатки Rabat 50-65), HCDR3 - SEQ ID NO:5 (остатки Rabat 95-102), LCDR1 - SEQ ID NO:8 (остатки Rabat 24-34), LCDR2 - SEQ ID NO:9 (остатки Kabat 50-56) и LCDR3 SEQ ID NO:10 (остатки Rabat 89-97).

Связывающий член согласно изобретению может включать один или несколько CDR, описанных в настоящей заявке, например CDR3, и необязательно также CDR1 и CDR2, чтобы сформировать набор CDR. CDR или набор CDR могут быть родительским CDR или родительским набором CDR, или могут быть CDR или набором CDR любого из антител 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 или 23, или могут быть их вариантом, как описано в настоящей заявке.

Например, связывающий член или VL домен согласно изобретению могут включать LCDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:120.

Связывающий член может включать набор Н и/или L CDR родительского антитела или любого из антител 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 или 23 с одной или несколькими аминокислотными мутациями в пределах раскрытого набора Н и/или L CDR. Аминокислотные мутации представляют собой замены, делеции или инсерции одной аминокислоты. Например, может быть до 20, например до 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 мутаций, например замен, в пределах набора Н и/или L CDR. Например, может быть до 6, 5, 4, 3 или 2 мутаций, например замен, в HCDR3 и/или может быть до 6, 5, 4, 3, или 2 мутаций, например, замен, в LCDR3. HCDR3 и/или LCDR3 могут необязательно содержать инсерцию или делецию одной аминокислоты по сравнению с раскрытым набором Н и/или LCDR. Замены могут, например, быть в положениях, замещенных в любом из Антител 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22 или 23, как показано в Таблице 7. Таким образом, замены могут необязательно быть в числах Kabat, выбранных из следующего:

Остаток Kabat 35 в HCDR1;

Остаток Kabat 64 в HCDR2;

Остаток Kabat 96, 97, 98, 99, 100, 100А, 100В, 100С и/или 102 в HCDR3;

Остаток Kabat 34 в LCDR1;

Остаток Kabat 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96 или 97 в LCDR3.

Аминокислотные мутации могут включать мутации, как показано в Таблице 7, например, обозначенные аминокислотные замены.

Например, связывающий член или VH домен согласно изобретению могут включать родительский HCDR1 с остатком Kabat Ile 35, замещенным на Thr или Val.

Связывающий член или VH домен согласно изобретению могут включать родительский HCDR2 с остатком Kabat Lys 64, замененным на Arg.

Связывающий член или VH домен могут включать родительский HCDR3 с одной или несколькими из следующих мутаций:

остаток Kabat Ala 96 заменен на Glu;

остаток Kabat Asp 97 заменен на Glu или Asn;

остаток Kabat Asp 98 заменен на Gly, Glu или His;

остаток Kabat His 99 заменен на Gly или Thr;

остаток Kabat Tyr 100 заменен на Pro, Asn, Arg, Trp или Ala;

остаток Kabat Tyr 100А заменен на Ala, Arg, Thr, Gly, Asn, Pro или Ser;

остаток Kabat 100B заменен на His, Trp, Gln, Pro или Thr;

остаток Kabat Ile 100C заменен на Ala, Val, His, Tyr или Leu;

Ile вставленный в остаток Kabat 100D;

остаток Kabat Val 102 заменен на Leu, His, Met или Ile.

Таким образом, связывающий член или VH домен согласно изобретению могут включать HCDR3, причем остаток Kabat 100D представляет собой Ilе, или причем остаток Kabat 100D отсутствует.

Связывающий член или VL домен согласно изобретению мо