Способы профилактики и лечения ракового метастаза и разрежения кости, связанного с раковым метастазом

Способы профилактики и лечения ракового метастаза и разрежения кости, связанного с раковым метастазом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к способам профилактики и лечения остеолитических заболеваний, включающих в себя раковый метастаз и разрежение кости, связанное с раковым метастазом, путем введения субъекту антагониста M-CSF в сочетании с другим терапевтическим средством.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Остеокласты, опосредующие резорбцию кости, участвуют в нормальных и патологических процессах ремоделирования костей, включающих в себя остеолитические заболевания. Остеокласты представляют собой многоядерные клетки, дифференцирующиеся из гемопоэтических клеток. Принято считать, что остеокласты скорее образуются путем слияния одноядерных предшественников, образующихся из гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, чем в результате неполного деления клеток (Chambers, Bone and Mineral Research, 6: 1-25, 1989; Göthling et al., Clin Orthop Relat R. 120: 201-228, 1976; Kahn et al., Nature 258: 325-327, 1975, Suda et al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992; Walker, Science 180: 875, 1973; Walker, Science 190: 785-787, 1975; Walker, Science 190: 784-785, 1975). Они происходят из тех же стволовых клеток, что и клеточные линии моноцитов-макрофагов (Ash et al., Nature 283: 669-670, 1980, Kerby et al., J. Bone Miner Res 7: 353-62, 1992). Дифференцировка предшественников остеокластов в зрелые многоядерные остеокласты требует присутствия разных факторов, включающих в себя гормональные и локальные стимулы (Athanasou et al.,Bone Miner 3: 317-333, 1988; Feldman et al., Endocrinology 107: 1137-1143, 1980; Walker, Science 190: 784-785, 1975; Zheng et al., Histochem J 23: 180-188, 1991), также показано, что в развитии остеокластов важную роль играют живые кости и костные клетки (Hagenaars et al., Bone Miner 6: 179-189, 1989). Кроме того, для дифференцировки остеокластов требуются остеобластные или стромальные клетки костного мозга. Одним из факторов, продуцирующихся данными клетками и поддерживающих образование остеокластов, является макрофагальный колониестимулирующий фактор, M-CSF (Wiktor-Jedrzejczak et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 4828-4832, 1990; Yoshida et al., Nature 345: 442-444, 1990). Лиганд В рецептора-активатора NF-κ (RANKL, также известного как TRANCE, ODF и OPGL) представляет собой другой сигнал (Suda et al., Endocr Rev 13: 66-80, 1992), участвующий в стимуляции образования остеокластов и резорбции под действием остеобластных/стромальных клеток, которое опосредуется рецептором RANK (TRANCER), расположенным на остеокластах и предшественниках остеокластов (Lacey et al., Cell 93: 165-176, 1998; Tsuda et al., Biochem Biophys Res Co 234: 137-142, 1997; Wong et al., J Exp Med 186: 2075-2080, 1997; Wong et al., J Biol. Chem 272: 25190-25194, 1997; Yasuda et al., Endocrinology 139: 1329-1337, 1998: Yasuda el al., Proc Natl Acad Sci US 95: 3597-3602, 1998). Остеобласты также секретируют белок остеопротегерин (OPG, также известный как OCIF), интенсивно ингибирующий образование остеокластов, который действует как рецептор-ловушка для RANKL, ингибируя положительный сигнал между остеокластами и остеобластами через RANK и RANKL.

Остеокласты отвечают за растворение как минерального, так и органического костного матрикса (Blair et al., J Cell Biol 102: 1164-1172, 1986). Остеокласты представляют собой дифференцированные клетки, обладающие уникальной поляризованной морфологией со специализированными участками мембраны и несколькими мембранными и цитоплазматическими маркерами, такими как тартрат-устойчивая кислая фофсатаза (TRAP) (Anderson et al. 1979), карбонангидраза II (Väänänen et al., Histochemistry 78: 481-485, 1983), рецептор кальцитонина (Warshafsky et al., Bone 6: 179-185, 1985) и рецептор витронектина (Davies et al., J Cell Biol 109: 1817-1826, 1989). Многоядерные остеокласты обычно содержат менее 10 ядер, однако они могут содержать до 100 ядер, составляя от 10 до 100 мкм в диаметре (Göthling et al., Clin Orthop Relat R 120: 201-228, 1976). Это позволяет относительно легко идентифицировать их с помощью световой микроскопии. В активном состоянии они являются высоко вакуолизированными и, кроме того, содержат много митохондрий, что указывает на высокую метаболическую активность (Mundy, in Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism, pages 18-22, 1990). Поскольку остеокласты играют ключевую роль в остеолитических костных метастазах, в данной области существует потребность в новых средствах и способах предотвращения стимуляции и функционирования остеокластов.

Раковый метастаз представляет собой основную причину рецидива, встречающегося у раковых пациентов после операционного или терапевтического вмешательства. Несмотря на интенсивные усилия, направленные на разработку способов лечения, раковый метастаз по-прежнему практически не поддается лечению. Кость является одним из наиболее распространенных участков метастазирования различных раковых заболеваний человека (например, раковых заболеваний молочной железы, легкого, простаты и щитовидной железы). Появление остеолитических костных метастаз является серьезной проблемой, поскольку они сопровождаются трудноизлечимой болью, высокой вероятностью переломов, сдавливанием нерва и гиперкальцимией. Несмотря на указанные клинические проблемы существует несколько доступных способов лечения разрежения костей, связанного с раковыми метастазами.

В настоящее время используется или находится на стадии разработки несколько терапевтических стратегий, направленных на лечение остеолитических заболеваний, причем усилия в основном сфокусированы на разработке лекарственных средств, блокирующих резорбцию кости посредством ингибирования образования или активности остеокластов. Бисфосфонаты (BP), аналоги пирофосфата, которые концентрируются в кости, на сегодняшний день являются наиболее эффективными ингибиторами резорбции кости. BP поглощаются остеокластами, ингибируют их активность и стимулируют вступление клеток в апоптоз, подавляя в результате резорбцию кости. Алендронат является первым BP ингибитором резорбции кости, вызывающим значительное уменьшение переломов позвоночника/бедра, он представляет собой разрешенный препарат для лечения остеопороза. Последнее поколение BP, Zometa, представляет собой разрешенный препарат для лечения гиперкальцемии и заболевания кости при солидных опухолях и множественной миеломе, и находится в стадии исследования как потенциальное средство для лечения болезни Педжета и костного метастаза при солидных опухолях и множественной миеломе. Zometa действует в очень низких дозах, его вводят в виде 15-минутной в/в инфузии один раз в месяц, однако он также оказывает влияние на остеобласты и может вызывать побочные эффекты, такие как почечная токсичность и остеонекроз челюсти (Fromigue and Brody, J. Endocrinol. Invest. 25:39-46, 2002; Ibrahim, A. et al., Clin. Canс. Res. 9:2394-99, 2003; Body, J.J., The Breast. S2:S37-44, 2003; Yaccoby, S. et al., Brit. J. Hemat., 116:278-80, 2002; Corey, E. et al., Clin. Canс. Res. 9: 295-306, 2003; Coleman, R.E., Sem. Oncol., 29(6): 43-49, 2002; Coleman, R.E., Eur. Soc. Med. Oncol. 16:687-95, 2005; Bamias et al., J Clin Oncol 13: 8580-8587, 2005. Таким образом, в данной области остается потребность в разработке новых средств и способов профилактики или лечения остеолитических заболеваний и/или раковых метастаз, в том числе остеолитических костных метастаз.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Композиции и способы настоящего изобретения способствуют удовлетворению вышеупомянутых и других, связанных с ними, потребностей, существующих в данной области. В одном воплощении данное изобретение предлагает способ лечения субъекта, страдающего от остеолитического нарушения, или имеющего риск такого нарушения, включающий в себя введение субъекту монотерапевтически эффективного количества антагониста M-CSF и монотерапевтически эффективного количества второго противоостеокластного средства в течение переходного периода, составляющего приблизительно от 1 дня до года, в течение которого антагонист M-CSF уменьшает число активных остеокластов до терапевтически желательного уровня. Примеры антагонистов M-CSF включают в себя антитела против M-CSF, а примеры других противоостеокластных средств включают в себя бисфосфонаты и ингибиторы RANKL, в том числе антитела против RANKL. В способах и/или применениях настоящего изобретения, включающих в себя использование антитела против M-CSF и ингибитора остеокластов, необязательно исключается применение RX1-, 5H4-, MC1- и MC3-производных антител, раскрытых в международной публикации № WO 2005/068503. Длительность переходного периода может составлять, например, по меньшей мере, от одного дня до одного года, ее определяют, например, с помощью подходящих маркеров роста или по активности остеокластов. Альтернативно их можно вводить одновременно.

Например, маркеры формирования кости включают в себя, без ограничения, кальций, а также общую и специфичную для кости щелочную фосфатазу (BAP), остеокальцин (OC, костный gla-белок), проколлагена типа I C-пропептид (PICP) и проколлагена типа I N-пропептид (PINP), а маркеры резорбции кости включают в себя, без ограничения, NTX (N-концевой поперечно сшитый телопептид костного коллагена) и CTX (C-концевой поперечно сшитый телопептид костного коллагена), поперечно сшитый пиридиний (пиридинолин и дезоксипиридинолин [DPD]) и ассоциированные пептиды, продукты деградации костного коллагена типа I гидроксипролиновые и гидроксилизиновые гликозиды, устойчивую к тартрату кислую фосфатазу (TRACP) и костный сиалобелок (BSP). См. Fohr et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., November 2003, 88(11):5059-5075.

В родственных воплощениях предлагаются упомянутые выше способы, в которых второе противоостеокластное средство прекращают давать после окончания переходного периода. В других родственных воплощениях предлагаются упомянутые выше способы, в которых количество второго противоостеокластного средства уменьшают после окончания переходного периода. В следующих родственных воплощениях предлагаются упомянутые выше способы, в которых количество антагониста M-CSF уменьшают после окончания переходного периода.

Предполагается, что способы настоящего изобретения оказывают терапевтическое действие путем ингибирования взаимодействия между M-CSF и его рецептором (M-CSFR). Также предполагается, что ингибирование взаимодействия M-CSF/M-CSFR подавляет пролиферацию и/или дифференциацию остеокластов. Во всех способах или композициях данного изобретения антагонист M-CSF может представлять собой полипептид, содержащий антитело против M-CSF; полипептид, содержащий антитело против M-CSFR; растворимый полипептид, содержащий мутеин M-CSF или его производное; или растворимый полипептид, содержащий мутеин M-CSFR или его производное; или молекулу нуклеиновой кислоты, ингибирующую экспрессию M-CSF или M-CSFR. Способы идентификации, продукции и модификации разных антагонистов M-CSF описаны в международной публикации № WO 2005/068503, включенной в данное описание в качестве ссылки во всей полноте.

Антитело против M-CSF может представлять собой поликлональное антитело; моноклональное антитело; гуманизированное антитело; человеческое антитело; человеческое рекомбинантное антитело; химерное антитело; фрагмент антитела Fab, F(ab')₂ или Fv; или мутеин любого из вышеупомянутых антител.

Антитела против M-CSF настоящего изобретения, ингибирующие остеолиз, описаны в международной публикации № WO 2005/068503, которая включена в данное описание в качестве ссылки во всей полноте с целью приведения подробной информации по антителам против M-CSF.

В одном воплощении данное изобретение предлагает немышиное моноклональное антитело, содержащее функциональный фрагмент, который специфически связывается с таким же эпитопом M-CSF, как и одно из мышиных моноклональных антител RX1, MC1 или MC3, аминокислотные последовательности которых приведены на фигурах 1, 3 и 4, соответственно. В родственном воплощении предлагается вышеупомянутое антитело, где антитело выбрано из группы, включающей в себя поликлональное антитело; моноклональное антитело, в том числе Human Engineered^TM антитело; гуманизированное антитело; человеческое антитело; химерное антитело; фрагмент антитела Fab, F(ab')2; Fv; ScFv или SCA; диантитело; линейное антитело; или мутеин одного из указанных антител, причем сродство связывания упомянутого антитела предпочтительно сохраняется на уровне, составляющем, по меньшей мере, 10^-7, 10^-8, 10^-9 или выше. Также предлагается немышиное моноклональное антитело, содержащее функциональный фрагмент, которое конкурирует с моноклональным антителом RX1, MC1 и/или MC3, имеющим аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 1, за связывание с M-CSF более чем на 75%.

В другом воплощении предлагается немышиное моноклональное антитело, содержащее функциональный фрагмент, где указанное немышиное моноклональное антитело, или его функциональный фрагмент, связывает эпитоп M-CSF, который содержит, по меньшей мере, 4, 5, 6, 7 или 8 смежных остатков аминокислот 98-105 последовательности, приведенной на фигуре 7.

В другом воплощении данное изобретение предлагает немышиное моноклональное антитело, содержащее функциональный фрагмент, где указанное немышиное моноклональное антитело или его функциональный фрагмент связывает эпитоп M-CSF, который содержит, по меньшей мере, 4, 5, 6, 7 или 8 смежных остатков аминокислот 65-73 или 138-144 последовательности, приведенной на фигуре 7 (соответствующий эпитопам M-CSF, распознаваемым 5H4 или MC3).

В следующем воплощении предлагается вышеуказанное антитело, или фрагмент, связывающий эпитоп M-CSF, который содержит аминокислоты 98-105 последовательности, приведенной на фигуре 7. В родственном воплощении предлагается вышеуказанное антитело, содержащее CDR3, последовательность которого приведена на фигуре 1A. В другом воплощении предлагается антитело, содержащее, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR мышиного антитела RX1, последовательность которого приведена на фигуре 1A. Антитело, которое содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 CDR мышиного антитела RX1, также может содержать, по меньшей мере, любые 1, 2, 3, 4 или 5 CDR из 6 CDR антитела 5H4, последовательность которого приведена на фигуре 8A-B. Альтернативно антитело, которое содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 CDR мышиного антитела RX1, может также содержать, по меньшей мере, любые 1, 2, 3, 4 или 5 CDR из 6 CDR антитела MC1, последовательность которого приведена на фигуре 8A-B. В следующем альтернативном воплощении вышеуказанное антитело может также содержать, по меньшей мере, любые 1, 2, 3, 4 или 5 CDR из 6 CDR антитела MC3, последовательность которого приведена на фигуре 8A-B. В родственном воплощении предлагается антитело, которое содержит, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 CDR мышиного антитела RX1, из которых, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4 или 5 CDR могут иметь консенсусные последовательности, описанные на фигуре 8A-B. В следующем родственном воплощении в вышеуказанном антителе один или несколько остатков консенсусных CDR заменены на соответствующие остатки любого CDR мышиных антител RX1, 5H4, MC1 или MC3. Желательное сродство связывания антитела может сохраняться даже после мутации одной или нескольких аминокислот, например, в результате консервативных замен в CDR, и/или консервативных или неконсервативных изменений остатков низкого и среднего риска.

В другом воплощении данное изобретение предлагает варианты вышеуказанного антитела, содержащие вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной на ах 1A, 2, 3 или 4. В родственном воплощении антитело содержит вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной на фигурах 1A, 2, 3 или 4.

В следующем воплощении антитело содержит константный участок и один или несколько вариабельных каркасных участков тяжелой и легкой цепи последовательности человеческого антитела. В родственном воплощении антитело содержит модифицированный или не модифицированный константный участок человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В предпочтительном воплощении константный участок представляет собой последовательность человеческого IgG1 или IgG4, которая может быть необязательно модифицирована с целью усиления или ослабления некоторых свойств. В случае IgG1 модификации константного участка, в особенности шарнирного участка или участка CH2, могут усиливать или ослаблять эффекторную функцию, в том числе, активность ADCC и/или CDC. В других воплощениях константный участок IgG2 модифицируют с целью увеличения образования агрегата антитело-антиген. В случае IgG4 модификации константного участка, в особенности шарнирного участка, могут уменьшить образование половинных антител.

В одном воплощении данное изобретение предлагает немышиное моноклональное антитело, которое специфически связывается с тем же эпитопом M-CSF, что и любое из мышиных антител RX1, 5H4, MC1 или MC3, описанных в международной публикации № WO 2005/068503, или конкурирует с любым из вышеуказанных мышиных антител за связывание с M-CSF более чем на 10%, предпочтительно, более чем на 25%, более предпочтительно, более чем на 50%, еще более предпочтительно, более чем на 75%, и наиболее предпочтительно, более чем на 90%. Антитела, полученные из последовательностей таких мышиных антител, в том числе химерные, человеческие, гуманизированные, человеческие рекомбинантные антитела, или их фрагменты, мутеины или версии, полученные путем химической дериватизации, описаны в WO 2005/068503.

Термин "RX1-производное антитело" включает в себя любое из нижеследующих антител:

1) аминокислотные варианты мышиного антитела RX1, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 1, в том числе варианты, содержащие аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной на фигуре 1, и/или содержащие аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной на фигуре 1, с учетом аминокислот, считающихся подобными при определении гомологии;

2) M-CSF-связывающие полипептиды (за исключением мышиного антитела RX1), которые содержат один или несколько гипервариабельных участков (CDR) мышиного антитела RX1, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 1, предпочтительно, включающие, по меньшей мере, CDR3 тяжелой цепи RX1, и, предпочтительно, включающие два или более, три или более, четыре или более, пять или более, или все шесть CDR;

3) Антитела Human Engineered^TM, содержащие аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей, приведенные на фигурах 9B-12B, или их варианты, содержащие аминокислотные последовательности тяжелой или легкой цепей, по меньшей мере, на 60% идентичные аминокислотным последовательностям тяжелой или легкой цепей исходного Human Engineered^TM, приведенным на фигурах 9B-12B, более предпочтительно, идентичность аминокислотных последовательностей составляет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, в том числе, например, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100%;

4) M-CSF-связывающие полипептиды (за исключением мышиного антитела RX1), содержащие остатки высокого риска одного или нескольких CDR антитела Human Engineered^TM, последовательность которого приведена на фигурах 9B-12B, предпочтительно, они содержат остатки высокого риска двух или более, трех или более, четырех или более, пяти или более, или всех шести CDR;

5) Антитела или варианты Human Engineered^TM, сохраняющие аминокислотные остатки высокого риска, показанные на фигуре 1B, и содержащие одно или несколько изменений в остатках низкого или среднего риска, показанных на фигуре 1B;

например, содержащие одно или несколько изменений в остатках низкого риска и консервативные замены остатков среднего риска, показанных на фигуре 1B, или

например, сохраняющие аминокислотные остатки среднего и высокого риска, показанные на фигуре 1B, и содержащие одно или несколько изменений в остатках низкого риска,

где изменения включают в себя инсерции, делеции или замены, и могут представлять собой консервативные замены, или они могут увеличивать сходство последовательности рекомбинантного антитела с последовательностью человеческой легкой или тяжелой цепи, с последовательностью человеческой зародышевой легкой или тяжелой цепи, с консенсусной последовательностью человеческой легкой или тяжелой цепи, или с консенсусной последовательностью человеческой зародышевой легкой или тяжелой цепи;

которые сохраняют способность связывать M-CSF. Такие антитела предпочтительно связывают M-CSF со сродством, составляющим, по меньшей мере, 10^-7, 10^-8, 10^-9 или выше, и предпочтительно нейтрализуют остеокластогенез, индуцирующий активность M-CSF.

Подобным образом, термин "MC3-производное антитело" включает в себя любое из нижеследующих антител:

1) аминокислотные варианты мышиного антитела MC3, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 4, в том числе варианты, содержащие аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной на фигуре 4, и/или содержащие аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологична аминокислотной последовательности, приведенной на фигуре 4, с учетом аминокислот, считающихся подобными при определении гомологии;

2) M-CSF-связывающие полипептиды (необязательно включающие в себя или исключающие мышиное антитело MC3), которые содержат один или несколько гипервариабельных участков (CDR) мышиного антитела MC3, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 4, предпочтительно, которые содержат, по меньшей мере, CDR3 тяжелой цепи RX1, и, предпочтительно, которые содержат два или более, три или более, четыре или более, пять или более, или все шесть CDR;

3) Антитела Human Engineered^TM, полученные путем изменения мышиной последовательности в соответствии со способами, описанными в Studnicka et al., патент США № 5766886, и в примере 4A данного описания, с использованием нумерации Kabat, приведенной на фигурах 13C-13E, с целью идентификации остатков низкого, среднего и высокого риска; такие антитела содержат, по меньшей мере, одну из нижеследующих тяжелых цепей и, по меньшей мере, одну из нижеследующих легких цепей: (a) тяжелую цепь, в которой все остатки низкого риска заменены, при необходимости, на остатки стандартной последовательности человеческого иммуноглобулина, или (b) тяжелую цепь, в которой все остатки низкого и среднего риска заменены, при необходимости, на остатки стандартной последовательности человеческого иммуноглобулина, (c) легкую цепь, в которой все остатки низкого риска заменены, при необходимости, на остатки стандартной последовательности человеческого иммуноглобулина, или (b) легкую цепь, в которой все остатки низкого и среднего риска заменены, при необходимости, на остатки стандартной последовательности человеческого иммуноглобулина;

4) варианты антитела, описанного в предыдущем параграфе (3), содержащие тяжелую или легкую цепи, аминокислотные последовательности которых, по меньшей мере, на 60% идентичны аминокислотным последовательностям тяжелой или легкой цепей исходного Human Engineered^TM, более предпочтительно, идентичность аминокислотных последовательностей составляет, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, в том числе, например, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100%;

5) M-CSF-связывающие полипептиды (необязательно включающие в себя или исключающие мышиное антитело MC3), содержащие остатки высокого риска одного или нескольких CDR мышиного антитела MC3, последовательность которого приведена на фигуре 4, и предпочтительно содержащие остатки высокого риска двух или более, трех или более, четырех или более, пяти или более или всех шести CDR;

6) Антитела или варианты Human Engineered^TM, сохраняющие аминокислотные остатки мышиного антитела MC3 высокого риска и содержащие одно или несколько изменений в остатках низкого или среднего риска;

например, содержащие одно или несколько изменений в остатках низкого риска и консервативные замены остатков среднего риска, или

например, сохраняющие аминокислотные остатки среднего и высокого риска, и содержащие одно или несколько изменений в остатках низкого риска,

где изменения включают в себя инсерции, делеции или замены, и могут представлять собой консервативные замены, или они могут увеличивать сходство последовательности рекомбинантного антитела с последовательностью человеческой легкой или тяжелой цепи, с последовательностью человеческой зародышевой легкой или тяжелой цепи, с консенсусной последовательностью человеческой легкой или тяжелой цепи, или с консенсусной последовательностью человеческой зародышевой легкой или тяжелой цепи;

которые сохраняют способность связывать M-CSF. Такие антитела предпочтительно связывают M-CSF со сродством, составляющим, по меньшей мере, 10^-7, 10^-8, 10^-9 или выше, и предпочтительно нейтрализуют остеокластогенез, индуцирующий активность M-CSF.

Термины "5H4-производное антитело" или "MC1-производное антитело" имеют определения, аналогичные приведенным выше.

Как подробно описано в данном документе, RX1, 5H4, MC1 или MC3-производные антитела, в том числе антитела или варианты Human Engineered^TM, могут относиться к разным изотипам, таким как IgG, IgA, IgM или IgE. Антитела класса IgG могут содержать другой константный участок, например, антитело IgG2 можно модифицировать так, чтобы оно содержало константный участок IgG1 или IgG4. В предпочтительных воплощениях данное изобретение предлагает антитела или варианты Human Engineered^TM, содержащие модифицированный или немодифицированный константный участок IgG1 или IgG4. В случае IgG1 модификации константного участка, особенно, шарнирного участка или участка CH2, могут увеличивать или уменьшать эффекторную функцию, в том числе вктивность ADCC и/или CDC. В других воплощениях константный участок IgG2 модифицируют так, чтобы уменьшить образование агрегата антитело-антиген. В случае IgG4 модификации константного участка, в особенности шарнирного участка, могут уменьшить образование половинного антитела. В конкретных иллюстративных воплощениях предлагается изменение шарнирной последовательности IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys на шарнирную последовательность IgG1 Cys-Pro-Pro-Cys.

В соответствии с настоящим изобретением можно вводить фармацевтическую композицию, содержащую один из вышеуказанных антагонистов M-CSF или антител против M-CSF и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

Смешивание двух или более антагонистов M-CSF, или совместное введение антагониста M-CSF и второго противоостеокластного средства дает дополнительное преимущество, обеспечивая повышенную эффективность средств данного изобретения против остеолитических заболеваний, включающих в себя раковый метастаз и/или разрежение костей, связанное с раковым метастазом.

В иллюстративных воплощениях данного изобретения предлагаются вышеуказанные способы, в которых второе противоостеокластное средство представляет собой бисфосфонат. В другом воплощении бисфосфонат представляет собой золедронат, памидронат, клондронат, этидронат, тилудронат, адендронат, ибандронат или ризедронат. Примеры других противоостеокластных средств включают в себя бисфосфонаты, PTHrP-нейтрализующие средства (такие как антитело, антисмысловая последовательность, siРНК), ингибиторы катепсина K, антагонисты MIP-1-α, RANK/RANKL-нейтрализующие средства (такие как антитело против RANK, антитело против RANKL, антисмысловая последовательность, растворимый рецептор RANKL или их мутеины), вакцину RANKL, остеопротегрин (OPG), тромбоцитарные факторы роста (PDGF), ингибиторы src-киназы, мальтолат галлия и ингибиторы матриксной металлопротеиназы (MMP).

Терапевтические способы настоящего изобретения также можно использовать в сочетании с третьим терапевтическим средством, таким как противораковое химиотерапевтическое средство, или в сочетании с лучевой терапией или хирургией. Противораковые химиотерапевтические средства включают в себя, без ограничения, алкилирующие средства, такие как карбоплатин и цисплатин; алкилирующие средства на основе азотистого иприта; алкилирующие средства на основе нитрозомочевины, такие как кармустин (BCNU); антиметаболиты, такие как метотрексат; антиметаболиты на основе аналогов пурина, такие как меркаптопурин; антиметаболиты на основе аналогов пиримидина, такие как фторурацил (5-FU) и гемцитабин; гормональные противоопухолевые средства, такие как госерелин, лейпролид и тамоксифен; натуральные противоопухолевые средства, такие как альдеслейкин, интерлейкин-2, доцетаксел, этопозид (VP-16), интерферон-альфа, паклитаксел и третиноин (ATRA); антибиотические натуральные противоопухолевые средства, такие как блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин и митомицин; а также натуральные противоопухолевые средства на основе алкалоидов барвинка, такие как винбластин, винкристин, виндесин; гидроксимочевина; ацеглатон, адриамицин, ифосфамид, эноцитабин, эпитиостанол, акларубицин, анцитабин, нимустин, гидрохлорид прокарбазина, карбоквон, карбоплатин, кармофур, хромомицин A3, противоопухолевые полисахариды, противоопухолевые тромбоцитарные факторы, циклофосфамид, шизофиллан, цитарабин, дакарбазин, тиоинозин, тиотепа, тегафур, неокарзиностатин, OK-432, блеомицин, фуртулон, броксуридин, бусульфан, хонван, пепломицин, бестатин (убенимекс), интерферон-β, мепитиостан, митобронитол, мерфалан, ламининовые пептиды, лентинан, экстракт Coriolus versicolor, тегафур/урацил, эстрамустин (эстроген/мехлоретамин).

Другие средства, используемые в качестве дополнительной терапии для лечения раковых больных, включают в себя EPO, G-CSF, ганцикловир; антибиотики, лейпролид; меперидин; зидовудин (AZT); интерлейкины 1-18, в том числе их мутантные формы и аналоги; интерфероны или цитокины, такие как интерфероны α, β и γ; гормоны, такие как фактор, высвобождающий лютеинизирующий гормон (LHRH), и его аналоги, и гормон, высвобождающий гонадотропин (GnRH); факторы роста, такие как трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста нервов (NGF), фактор, высвобождающий гормон роста (GHRF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор, гомологичный фактору роста фибробластов (FGFHF), фактор роста гепатоцитов (HGF) и инсулиновый фактор роста (IGF); факторы некроза опухоли-α и β (TNF-α и β); фактор, ингибирующий инвазию-2 (IIF-2); костные морфогенетические белки 1-7 (BMP 1-7); соматостатин; тимозин-α-1; γ-глобулин; супероксиддисмутаза (SOD); факторы комплемента; противоангиогенные факторы; антигенные вещества; пролекарства; ингибиторы киназы-рецептора фактора роста; антитело против Her2; и VEGF-нейтрализующее антитело.

По окончании переходного периода количество антагониста M-CSF или количество второго противоостеокластного средства, необходимое для достижения терапевтического эффекта, может уменьшиться. Так, после данного периода времени антагонист M-CSF может увеличивать эффективность второго противоостеокластного средства или уменьшать побочные эффекты, связанные с введением второго противоостеокластного средства, или повышать безопасность второго противоостеокластного средства. Антагонист M-CSF также может увеличивать эффективность, уменьшать побочные эффекты или повышать безопасность третьего терапевтического средства, такого как противораковое химиотерапевтическое средство, другое дополнительное терапевтическое средство, хирургия или лучевая терапия. В другом воплощении данного изобретения предлагается упаковка, флакон или контейнер, содержащий лекарственное средство, в состав которого входит антагонист M-CSF и инструкции, указывающие, что данное лекарственное средство следует принимать в сочетании со вторым и/или третьим терапевтическим средством и/или с хирургией или лучевой терапией.

С помощью способов настоящего изобретения можно лечить широкий ряд остеолитических нарушений. В данном описании термин "остеолитическое нарушение" относится к любому состоянию, возникающему в результате повышенной активности остеокластов. Риск остеолитического нарушения может иметь субъект, предрасположенный к развитию остеолитического нарушения или субъект, страдающий от заболевания, которе вызывает или вносит вклад в увеличение активности остеокластов. В иллюстративных воплощениях данного изобретения остеолитическое нарушение может представлять собой метаболическое заболевание кости, связанное с относительно высокой активностью остеокластов, которое включает в себя эндокринопатию (гиперкортизолизм, гипогонадизм, первичный или вторичный гиперпаратиреоз, гипертиреоз), гиперкальцемию, дефицитное состояние (рахит/остеомаляция, цинга, недостаточное питание), хроническое заболевание (синдромы мальабсорбции, хроническая почечная недостаточность (нефрогенная остеодистрофия), хроническое заболевание печени (гепатогенная остеодистрофия)), заболевание, связанное с введением лекарственных средств (таких как глюкокортикоиды (индуцированный глюкокортикоидом остеопороз), гепарин, спирт), или наследственное заболевание (несовершенный остеогенез, гомоцистинурия), рак, остеопороз, остеопетроз, воспаление кости, связанное с артритом и ревматоидным артритом, периодонтальная болезнь, фиброзная дисплазия и/или болезнь Педжета.

В других иллюстративных воплощениях остеолитическое нарушение может представлять собой раковый метастаз в кости, где метастатический рак представляет собой рак молочной железы, рак легкого, рак почек, множественную миелому, рак щитовидной железы, рак простаты, аденокарциному, злокачественное заболевание клеток крови, включающее в себя лейкоз и лимфому; рак головы и шеи; рак желудочно-кишечного тракта, включающий в себя рак пищевода, рак желудка, рак толстой кишки, рак тонкого кишечника, рак ободочной и прямой кишки, рак прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак печени, рак желчного протока или рак желчного пузыря; злокачественное заболевание женских половых органов, включающее в себя карциному яичника, рак эндометрия, рак влагалища или рак шейки матки; рак мочевого пузыря; рак мозга, в том числе, нейробластома, саркома, остеосаркома; или рак кожи, в том числе злокачественная меланома или рак сквамозных клеток.

В иллюстративных воплощениях данного изобретения с помощью любого из вышеуказанных способов можно предотвращать или уменьшать разрежение костей, или предотвращать или уменьшать метастазирование в кость или тяжесть разрежения костей, связанного с заболеванием.

Антитело против M-CSF в соответствии с настоящим изобретением вводят в дозе, составляющей приблизительно от 2 мкг/кг до 30 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 30 мг/кг или от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг массы тела.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1A показана аминокислотная последовательность M-CSF-специфичного мышиного антитела RX1 (SEQ ID NO: 2 и 4) (кодируемого вставкой кДНК в плазмиде, находящейся на хранении в американской коллекции типовых культур, Manassas, VA, USA, под номером депозита ATCC PTA-6113) и соответствующая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1 и 3). Участки CDR пронумерованы и выделены жирным шрифтом.

На фигурах 1B и 1C показаны аминокислотные последовательности легкой (SEQ ID NO: 5) и тяжелой цепей (SEQ ID NO: 6) M-CSF-специфичного мышиного антитела RX1, соответственно, в которых остатки высокого риска (жирный шрифт), среднего риска (подчеркивание) и низкого риска идентифицированы по способу Studnicka et al., WO93/11794.

На фигурах 2, 3 и 4 показаны аминокислотные последовательности MCSF-специфичных мышиных антител 5H4 (SEQ ID NO: 10 и 11), MC1 (SEQ ID NO: 12 и 13) (полученных с использованием гибридомы, находящейся на хранении в ATCC под номером депозита PTA-6263) и MC3 (SEQ ID NO: 14 и 15) (полученных с использованием гибридомы, находящейся на хранении в ATCC под номером депозита PTA-45264), соответственно.

На фигуре 5 показана аминокислотная последовательность M-CSFα (SEQ ID NO: 7).

На фигуре 6 показана аминокислотная последовательность M-CSFβ (SEQ ID NO: 8).

На фигуре 7 показана аминокислотная последовательность M-CSFγ (SEQ ID NO: 9). Наличие полиморфизмов в молекуле ДНК может приводить к различиям в аминокислотном составе. Например, обычный полиморфизм обеспечивает присутствие в положении 104 Ala с большей вероятностью, чем Pro.

На фигурах 8A и B показан сравнительный анализ аминокислотных последовательностей участков CDR тяжелых и легких цепей человеческих M-CSF-специфичных мышиных антител RX1; 5H4; MC1 и MC3 (SEQ ID NO: 16-38).

На фигуре 9A показаны (a) линия риска для тяжелой цепи мышиного RX1 (H = высокий рис