Связывающие полипептиды и их применения

Связывающие полипептиды и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка является непредварительной заявкой, по которой испрашивается приоритет заявки США с номером No. 60/742185, поданной 2 декабря 2005, и заявки США с номером No. 60/805553, поданной 22 июня 2006, все указанные заявки приведены в настоящем описании в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение, в целом, относится к вариантам CDR, разнообразие которых создано с использованием высокоограниченного набора аминокислот, и к библиотекам, содержащим множество таких последовательностей. Изобретение также относится к слитым полипептидам, содержащим указанные варианты CDR. Изобретение также относится к способам и композициям, которые могут быть использованы для идентификации новых связывающих полипептидов для терапевтического применения или применения в качестве реагентов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Методика фагового дисплея является эффективным средством для создания и отбора новых белков, которые связываются с лигандом, таким как антиген. Применение методики фагового дисплея позволяет создавать большие библиотеки белковых вариантов, которые можно быстро сортировать по последовательностям, которые связываются с антигеном-мишенью с высокой аффинностью. Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты полипептидов, сливают с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок оболочки вируса, такой как белок гена III или белок гена VIII. Разработаны моновалентные системы фагового дисплея, в которых последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок или полипептид, сливают с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка гена III (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). В моновалентной системе фагового дисплея слияние генов экспрессируется на низких уровнях, и также экспрессируются белки гена III дикого типа, так что инфекционность частиц сохраняется. Способы создания пептидных библиотек и скрининга таких библиотек описаны во многих патентах (например, в патенте США No. 5723286, патенте США No. 5432018, патенте США No. 5580717, патенте США No. 5427908 и в патенте США No. 5498530).

Осуществление экспрессии пептидов на поверхности нитчатого фага и экспрессии функциональных фрагментов антител в периплазме E. coli важно для разработки библиотек антител в фаговом дисплее (Smith et al., Science (1985), 228:1315; Skerra and Pluckthun, Science (1988), 240:1038). Библиотеки антител или антигенсвязывающих полипептидов получены несколькими способами, включая изменение одного гена посредством инсерции случайных последовательностей ДНК или клонирование семейства родственных генов. Способы предоставления антител или антигенсвязывающих фрагментов с использованием фагового дисплея описаны в патентах США No. 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 и 5658727. После этого проводят скрининг библиотеки в отношении экспрессии антител или антигенсвязывающих белков с требуемыми свойствами.

Методика фагового дисплея имеет несколько преимуществ по сравнению с обычными способами, основанными на гибридомах и методах рекомбинации, для получения антител с требуемыми свойствами. Указанная методика позволяет создавать большие библиотеки антител с различными последовательностями за меньший период времени и без использования животных. Для получения гибридом или получения гуманизированных антител, несомненно, может потребоваться несколько месяцев. Кроме того, в отсутствие необходимости иммунизации фаговые библиотеки антител могут быть созданы для антигенов, которые являются токсичными или имеют низкую антигенность (Hogenboom, Immunotechniques (1988), 4:1-20). Фаговые библиотеки антител также могут быть использованы для создания и идентификации новых антител человека.

Антитела стали очень эффективными в качестве терапевтических средств для широкого круга заболеваний. Например, гуманизированные антитела против HER-2, опухолевого антигена, могут использоваться для диагностики и лечения рака. Другие антитела, такие как анти-INF-γ-антитело, могут использоваться для лечения воспалительных заболеваний, таких как болезнь Крона. Библиотеки на основе фагового дисплея использовали для создания наборов антител человека, полученных у иммунизированных и неиммунизированных людей, последовательностей зародышевой линии или наборов наивных Ig B-клеток (Barbas and Burton, Trends Biotech (1996), 14:230; Griffiths et al., EMBO J. (1994), 13:3245; Vaughan et al., Nat. Biotech. (1996), 14:309; Winter EP 0368684 B1). Наивные, или неиммунные, антигенсвязывающие библиотеки были созданы с использованием большого числа лимфоидных тканей. Некоторые из таких библиотек коммерчески доступны, например библиотеки, разработанные Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996); Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57 (1999)). Однако многие такие библиотеки имеют ограниченное разнообразие.

Возможность идентифицировать и выделять высокоаффинные антитела из библиотеки на основе фагового дисплея имеет важное значение для выделения новых антител человека для терапевтического применения. Традиционно считается, что выделение высокоаффинных антител из библиотеки зависит по меньшей мере частично от размера библиотеки, эффективности продуцирования в бактериальных клетках и разнообразия библиотеки. Смотри, например, Knappik et al., J. Mol. Biol. (1999), 296:57. Размер библиотеки снижается вследствие неэффективности продуцирования из-за неправильной укладки антитела или антигенсвязывающего белка и присутствия стоп-кодонов. Экспрессия в бактериальных клетках может быть ингибирована, если антитело или антигенсвязывающий домен подвергается неправильной укладке. Экспрессия может быть улучшена посредством мутирования остатков по очереди на поверхности зоны контакта вариабельных/константных областей или выбранных остатков CDR (Deng et al., J. Biol. Chem. (1994), 269:9533, Ulrich et al., PNAS (1995), 92:11907-11911; Forsberg et al., J. Biol. Chem. (1997), 272:12430). Последовательность каркасной области является фактором, обеспечивающим правильную укладку в том случае, если фаговая библиотека антител продуцируется в бактериальных клетках.

Создание библиотеки разнообразных антител или антигенсвязывающих белков также имеет значение для выделения высокоаффинных антител. Библиотеки с расширенным разнообразием ограниченных CDR были созданы с использованием различных способов. Смотри, например, Tomlinson, Nature Biotech. (2000), 18: 989-994. Области CDR3 представляют интерес отчасти из-за того, что они, как обнаружено, как правило, принимают участие в связывании антигена. Области CDR3 тяжелой цепи сильно изменяются по размеру, последовательности и структурной конформации.

Другие авторы также создавали разнообразие посредством рандомизации областей CDR вариабельных тяжелых и легких цепей с использованием всех 20 аминокислот в каждом положении. Предполагалось, что использование всех 20 аминокислот может привести к большому разнообразию последовательностей вариантов антител и увеличить возможность идентификации новых антител (Barbas, PNAS 91:3809 (1994); Yelton, DE, J. Immunology, 155:1994 (1995); Jackson, J.R., J. Immunology, 154:3310 (1995) и Hawkins, RE, J. Mol. Biology, 226:889 (1992)).

Также были предприняты попытки создания разнообразия путем ограничения группы аминокислотных замен в некоторых CDR, чтобы отразить распределение аминокислот в природных антителах. Смотри Garrard and Henner, Gene (1993), 128:103; Knappik et al., J. Mol. Biol. (1999), 296:57. Однако такие попытки имели переменный успех и применялись бессистемно и неколичественно. Создание разнообразия областей CDR при минимизации количества аминокислотных изменений было сложной проблемой. Кроме того, в некоторых случаях после создания первой библиотеки согласно одному набору критериев может быть необходимым дополнительное увеличение разнообразия первой библиотеки. Однако для этого требуется, чтобы первая библиотека имела достаточное разнообразие и при этом оставалась достаточно небольшой по размеру, так чтобы можно было ввести дополнительное разнообразие без существенного увеличения практических ограничений, таких как ограничения выхода и т.д.

Некоторые группы исследователей сообщали о теоретическом и практическом анализах минимального количества аминокислот в наборе, которое необходимо для создания белков. Однако такие анализы в целом были ограничены по своему объему и сущности, и сохранялось значительное скептическое отношение и вопросы относительно возможности создания полипептидов, обладающих сложными функциями, с использованием ограниченного набора типов аминокислот. Смотри, например, See, e.g., Riddle et al., Nat. Struct. Biol. (1997), 4(10):805-809; Shang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 91:8373-8377; Heinz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89:3751-3755; Regan & Degrado, Science (1988), 241:976-978; Kamteker et al., Science (1993), 262:1680-1685; Wang & Wang, Nat. Struct. Biol. (1999), 6(11):1033-1038; Xiong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), 92:6349-6353; Heinz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89:3751-3755; Cannata et al., Bioinformatics (2002), 18(8):1102-1108; Davidson et al., Nat. Struct. Biol. (1995), 2(10):856-863; Murphy et al., Prot. Eng. (2000), 13(3):149-152; Brown & Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:1983-1988; Akanuma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2002), 99(21):13549-13553; Chan, Nat. Struct. Biol. (1999), 6(11):994-996.

Таким образом, сохраняется необходимость в усовершенствовании способов создания библиотек, которые содержат функциональные полипептиды с достаточной степенью разнообразия последовательностей и при этом в достаточной степени поддающиеся дополнительной обработке, направленной на дальнейшее увеличение разнообразия, высокий выход экспрессии и тому подобное. Изобретение, предложенное в настоящем описании, удовлетворяет указанную потребность и обеспечивает другие преимущества.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к упрощенным и гибким способам создания полипептидов, содержащих варианты CDR, которые содержат последовательности с ограниченным разнообразием, но при этом сохраняющие способность связывать антиген-мишень. В отличие от традиционных способов, которые основаны на предположении, что адекватное разнообразие связывающих мишень агентов может быть создано только в том случае, если конкретная область CDR (области CDR) или все CDR различаются, и в отличие от традиционных представлений о том, что адекватное разнообразие зависит от того, насколько широк диапазон аминокислотных замен (обычно путем замены с использованием всех или большинства из 20 аминокислот), изобретение относится к способам, позволяющим создавать связывающие мишень агенты высокого качества, которые необязательно зависят от разнообразия конкретной области CDR (областей CDR) или от конкретного количества CDR эталонного полипептида или исходного антитела. Изобретение основано по меньшей мере частично на неожиданном обнаружении, что высококачественные библиотеки с большим разнообразием, содержащие функциональные полипептиды, способные связывать антигены-мишени, могут быть созданы изменением минимального количества положений аминокислот с использованием значительно ограниченного количества аминокислотных остатков. Способы по изобретению являются быстрыми, удобными и гибкими способами, основанными на использовании ограниченных наборов кодонов, которые кодируют небольшое количество аминокислот. Ограниченное разнообразие последовательностей и, соответственно, в целом меньший размер популяций (например, библиотек) полипептидов, созданных способами по изобретению, позволяют дополнительно увеличивать разнообразие таких популяций, при необходимости или если желательно. Такое преимущество, как правило, традиционные способы не обеспечивают. Полипептиды, являющиеся кандидатами в качестве связывающих агентов, созданные в соответствии с изобретением, обладают высококачественными параметрами связывания мишени и имеют структурные особенности, которые обеспечивают высокий выход в культуре клеток. Изобретение относится к способам создания таких связывающих полипептидов, способам применения таких полипептидов и композициям, содержащим такие полипептиды.

В одном из аспектов изобретение относится к слитым полипептидам, содержащим различную область CDR (области CDR) и гетерологичную полипептидную последовательность (в некоторых вариантах осуществления последовательность по меньшей мере части вирусного полипептида), в виде единичных полипептидов и в виде представителя множества отдельных уникальных полипептидов, которые являются кандидатами агентов, связывающих представляющие интерес мишени. Композиции (такие, как библиотеки), содержащие такие полипептиды, могут использоваться во многих случаях, например в качестве пулов кандидатов иммуноглобулиновых полипептидов (например, антител и фрагментов антител), которые связываются с представляющими интерес мишенями. Такие полипептиды также могут быть созданы с использованием неиммуноглобулиновых каркасов (например, белков, таких как гормон роста человека и т.д.). Изобретение имеет различные аспекты, включая полинуклеотиды и полипептиды, созданные в соответствии с предлагаемым в изобретении способом, и системы, наборы и изделия производства для практического осуществления способов по изобретению и/или применение полипептидов/полинуклеотидов и/или композиций по изобретению.

В одном из аспектов изобретение относится к способу создания полипептида, содержащего по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или все варианты CDR, выбранные из группы, состоящей из H1, H2, H3, L1, L2 и L3, при этом указанный полипептид способен связывать представляющий интерес антиген-мишень, и указанный способ включает (i) идентификацию по меньшей мере одного (или любого количества вплоть до всех) доступного для растворителя и имеющего большое разнообразие аминокислот положения в эталонной области CDR, соответствующей варианту CDR; и (ii) изменение аминокислоты в доступном для растворителя и имеющем большое разнообразие положении посредством создания вариантных копий CDR с использованием ограниченного набора кодонов (определение «ограниченный набор кодонов» приведено ниже).

Различные аспекты и варианты осуществления способов по изобретению применимы для создания и/или применения пула, содержащего множество полипептидов по изобретению, в частности для отбора и идентификации кандидатов в качестве агентов, связывающих представляющие интерес антигены-мишени. Например, изобретение относится к способу создания композиции, содержащей множество полипептидов, где каждый полипептид содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или все варианты CDR, выбранные из группы, состоящей из H1, H2, H3, L1, L2 и L3, при этом указанный полипептид способен связывать представляющий интерес антиген-мишень, и указанный способ включает (i) идентификацию по меньшей мере одного (или любого количества вплоть до всех) доступного для растворителя и имеющего большое разнообразие аминокислот положения в эталонной области CDR, соответствующей варианту CDR; и (ii) изменение аминокислоты в доступном для растворителя и имеющем большое разнообразие положении посредством создания вариантных копий CDR с использованием ограниченного набора кодонов; при этом множество полипептидов создают посредством амплификации матричного полинуклеотида с использованием набора олигонуклеотидов со значительно ограниченной вырожденностью последовательности, кодирующей вариант аминокислоты, при этом указанная ограниченная вырожденность отражает ограниченное количество последовательностей кодонов из ограниченного набора кодонов.

В другом примере изобретение относится к способу, включающему: конструирование экспрессирующего вектора, содержащего полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельные домены легкой цепи, тяжелой цепи или и легкой цепи и тяжелой цепи исходного антитела, содержащие по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или все CDR, выбранные из группы, состоящей из CDR L1, L2, L3, H1, H2 и H3; и мутирование по меньшей мере одной, двух, трех, четырех, пяти или всех CDR исходного антитела по меньшей мере в одном (или любом количестве, вплоть до всех) доступном для растворителя и имеющем большое разнообразие аминокислот положении с использованием ограниченного набора кодонов.

В другом примере изобретение относится к способу, включающему: конструирование библиотеки фаговых или фагмидных частиц для дисплея множества полипептидов по изобретению; осуществление контакта библиотеки частиц с антигеном-мишенью в условиях, подходящих для связывания частиц с антигеном-мишенью; и отделение частиц, которые связаны, от частиц, которые не связаны с антигеном-мишенью.

В любом из способов по изобретению, описанном в настоящем описании, доступном для растворителя и/или имеющем большое разнообразие положением аминокислоты, может быть любое положение, которое удовлетворяет критериям, которые описаны в настоящем описании, в частности может представлять собой любую комбинацию положений, указанных в настоящем описании, например любую комбинацию положений, описанных для полипептидов по изобретению (которые более подробно описаны в настоящем описании). Подходящие варианты аминокислот могут быть любыми, если они удовлетворяют критериям, указанным в настоящем описании, например вариантами аминокислот в полипептидах по изобретению, которые более подробно описаны ниже.

Конструирование различных CDR может заключаться в конструировании разнообразия по длине и/или по последовательности CDR. Например, CDRH3 может быть сделана разной по длине, например длиной от 7 до 21 аминокислот, и/или по ее последовательности, например путем изменения имеющих большое разнообразие и/или доступных для растворителя положений с использованием аминокислот, кодируемых ограниченным набором кодонов. В некоторых вариантах осуществления часть CDRH3 имеет длину от 5 до 21, от 7 до 20, от 9 до 15 или от 11 до 13 аминокислот и имеет вариант аминокислоты в одном или нескольких положениях, кодируемых ограниченным набором кодонов, который кодирует ограниченное количество аминокислот, например наборами кодонов, кодирующих не более 19, 15, 10, 8, 6, 4 или 2 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления C-конец имеет аминокислотную последовательность AM, AMDY или DY.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды по изобретению могут быть в разных формах, при условии что функция полипептидов в связывании мишени сохраняется. В некоторых вариантах осуществления полипептид по изобретению представляет собой слитый полипептид (т.е. слияние двух или более последовательностей из гетерологичных полипептидов). Полипептиды с разнообразными CDR по изобретению могут быть получены в виде полипептидов, слитых по меньшей мере с частью белка оболочки вируса, например, для применения в фаговом дисплее. Белки оболочки вируса, которые могут быть использованы для дисплея полипептидов по изобретению, включают белок pIII, основной белок оболочки pVIII, Soc (фаг T4), Hoc (фаг T4), gpD (фаг лямбда), pVI или их варианты или фрагменты. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид сливают по меньшей мере с частью белка оболочки вируса, такого как белок оболочки вируса, выбранный из группы, состоящей из pIII, pVIII, Soc, Hoc, gpD, pVI и их вариантов или фрагментов.

В некоторых вариантах осуществления, в которых полипептид с разнообразными CDR представляет собой один или несколько вариабельных доменов антител, вариабельные домены антител могут быть представлены на поверхности вируса в разных формах, включая ScFv, Fab, ScFv2, F(ab')₂ и F(ab)₂. Для дисплея полипептидов бивалентным образом слитый белок в некоторых вариантах осуществления содержит домен димеризации. Домен димеризации может содержать последовательность димеризации и/или последовательность, содержащую один или несколько остатков цистеина. Домен димеризации может быть связан, напрямую или опосредованно, с C-концом вариабельного или константного домена тяжелой цепи (например, CH1). Структура домена димеризации может изменяться в зависимости от того, продуцируется ли вариабельный домен антитела в виде компонента слитого белка с компонентом, представленным белком оболочки вируса (например, без амбер-стоп-кодона после домена димеризации), или продуцируется ли вариабельный домен антитела преимущественно без компонента, представленного белком оболочки вируса (например, с амбер-стоп-кодоном после домена димеризации). Если вариабельный домен антитела продуцируется преимущественно в виде белка, слитого с компонентом, представленным белком оболочки вируса, то одна или несколько дисульфидных связей и/или одна последовательность димеризации обеспечивают бивалентный дисплей. В случае вариабельных доменов антител, преимущественно продуцируемых без слияния с компонентом в виде белка оболочки вируса (например, с амбер-стоп-кодоном), домен димеризации может содержать как остаток цистеина, так и последовательность димеризации.

Кроме того, необязательно слитый полипептид может содержать метку, которая может быть удобной для очистки, выявления и/или скрининга, такую как FLAG, поли-his, gD-метка, c-myc, флуоресцирующий белок или B-галактозидаза. В одном из вариантов осуществления слитый полипептид содержит вариабельный или константный домен легкой цепи, слитый с полипептидной меткой.

В другом аспекте изобретения полипептид, такой как вариабельный домен антитела, получают из одной исходной или матричной молекулы. Исходная или матричная молекула может быть выбрана или сконструирована для обеспечения таких свойств, как хороший выход и стабильность в случае продуцирования в культуре прокариотических или эукариотических клеток, и/или для размещения областей CDRH3 различной длины. Последовательность матричной молекулы может быть изменена для улучшения укладки и/или дисплея вариабельного домена, если он находится в виде слитого белка с компонентом, представленным белком оболочки фага. Например, исходное антитело может содержать аминокислотную последовательность вариабельных доменов гуманизированного антитела 4D5 (вариабельный домен легкой цепи (фиг.1; SEQ ID NO:1)); (вариабельный домен тяжелой цепи (фиг.1; SEQ ID NO:2)). Например, в вариабельном домене антитела тяжелой или легкой цепи остатки каркасной области могут быть модифицированы или изменены по сравнению с исходной или матричной молекулой для улучшения укладки, выхода, представления или аффинности вариабельного домена антитела. В некоторых вариантах осуществления остатки каркасной области выбирают так, чтобы модифицировать область по сравнению с исходной или матричной молекулой в том случае, когда аминокислота в положении каркасной области исходной молекулы отличается от аминокислоты или аминокислот, обычно находящихся в данном положении в природных антителах или в консенсусной последовательности подгруппы. Аминокислоты в таких положениях могут быть заменены на аминокислоты, в большинстве случаев находящиеся в природных антителах или в консенсусной последовательности подгруппы в данном положении. В одном из вариантов осуществления каркасным остатком 71 тяжелой цепи может быть R, V или A. В другом примере каркасным остатком 93 тяжелой цепи может быть S или A. В еще одном примере каркасным остатком 94 может быть R, K или T или может кодироваться MRT. В другом примере каркасным остатком 93 является A, и каркасным остатком 94 является R. В еще одном примере каркасным остатком 49 в тяжелой цепи может быть аланин или глицин. Каркасные остатки в легкой цепи могут быть также изменены. Например, аминокислота в положении 66 может представлять собой аргинин или глицин. Каркасные области последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного антитела 4D5-8 дикого типа показаны на фиг.6 (SEQ ID NO:6-9 и 10-13 соответственно). Каркасные области вариантов последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного антитела 4D5-8, в котором легкая цепь модифицирована в положении 66, а тяжелая цепь модифицирована в положениях 71, 73 и 78, показаны на фиг.7 (SEQ ID NO:14-17 и 18-21 соответственно).

Способы по изобретению обеспечивают возможность создания большого разнообразия полипептидов, содержащих разнообразный набор последовательностей CDR. В одном из вариантов осуществления создают одну или несколько библиотек, используя способы по изобретению, которые описаны в настоящем описании. Проводят скрининг библиотек в отношении связывания с антигенами-мишенями, например DR5 и HER-2 человека.

Изобретение также относится к вариабельным доменам тяжелой цепи иммуноглобулина, рандомизированным для обеспечения разнообразия. В одном из вариантов осуществления полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором:

(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22), где G находится в положении 26, а X1 находится в положении 28 согласно системе нумерации Кабата; где X1 выбран из S и Y; где X2 выбран из Y и S; где X3 выбран из Y и S; где X4 выбран из Y и S; и где X5 выбран из Y и S;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO:23), где X1 находится в положении 50 согласно системе нумерации Кабата; где X1 выбран из Y и S; где X2 выбран из Y и S; где X3 выбран из Y и S; где X4 выбран из Y и S; где X5 выбран из Y и S; и где X6 выбран из Y и S; и

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-D-Y (SEQ ID NO:31), где X1 находится в положении 95 согласно системе нумерации Кабата; и где X1 выбран из R, Y и M; X2 выбран из Y и R; X3 выбран из Y, S, R, P и G; X4 выбран из Y и S; X5 выбран из Y, S, R и H; X6 выбран из R, Y и S; X7 выбран из G, Y и S; X8 выбран из R, Y и S; X9 выбран из G, Y и S; X10 выбран из R, Y и S; X11 выбран из G, Y и S; X12 выбран из S, Y, R, G и A; X13 выбран из G и Y; X14 выбран из L, M, R, G и A; и X15 выбран из G, F и L или отсутствует; и X16 означает F или отсутствует.

В другом варианте осуществления полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором:

(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22), где G находится в положении 26, а X1 находится в положении 28 согласно системе нумерации Кабата; где X1 выбран из Y и S; где X2 выбран из Y и S; где X3 выбран из Y и S; где X4 выбран из Y и S; и где X5 выбран из Y и S;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO:23), где X1 находится в положении 50 согласно системе нумерации Кабата; где X1 выбран из Y и S; где X2 выбран из Y и S; где X3 выбран из Y и S; где X4 выбран из Y и S; где X5 выбран из Y и S; и где X6 выбран из Y или S; и

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:24), где X1 находится в положении 95 согласно системе нумерации Кабата; и где аминокислоты в каждом из положений X1-X6 выбраны из пула аминокислот в молярном соотношении 50% Y, 25% S и 25% G; где аминокислоты в каждом из положений X7-X17 выбраны из пула аминокислот в молярном соотношении 50% Y, 25% S и 25% G или отсутствуют; где X18 выбран из G и A; и где X19 выбран из I, M, L и F.

В другом варианте осуществления полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором:

(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22), где G находится в положении 26, и X1 находится в положении 28 согласно системе нумерации Кабата; где X1 выбран из Y и S; где X2 выбран из Y и S; где X3 выбран из Y и S; где X4 выбран из Y и S; и где X5 выбран из Y и S;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO:23), где X1 находится в положении 50 согласно системе нумерации Кабата; где X1 выбран из Y и S; где X2 выбран из Y и S; где X3 выбран из Y и S; где X4 выбран из Y и S; где X5 выбран из Y и S; и где X6 выбран из Y и S; и

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:26), где X1 находится в положении 95 согласно системе нумерации Кабата; и где аминокислоты в каждом из положений X1-X6 выбраны из пула аминокислот в молярном соотношении 25% Y, 50% S и 25% R; где аминокислоты в каждом из положений X7-X17 выбраны из пула аминокислот в молярном соотношении 25% Y, 50% S и 25% R или отсутствуют; где Х18 выбран из G и A; и где Х19 выбран из I, M, L и F.

В другом варианте осуществления полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором:

(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22), где G находится в положении 26, и X1 находится в положении 28 согласно системе нумерации Кабата; где Х1 выбран из Y и S; где Х2 выбран из Y и S; где Х3 выбран из Y и S; где Х4 выбран из Y и S; и где Х5 выбран из Y и S;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO:23), где X1 находится в положении 50 согласно системе нумерации Кабата; где Х1 выбран из Y и S; где Х2 выбран из Y и S; где Х3 выбран из Y и S; где Х4 выбран из Y и S; где Х5 выбран из Y и S; и где Х6 выбран из Y и S; и

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:27), где X1 находится в положении 95 согласно системе нумерации Кабата; и где аминокислоты в каждом из положений X1-X6 выбраны из пула аминокислот в молярном соотношении 38% Y, 25% S, 25% G и 12% R; где аминокислоты в каждом из положений X7-X17 выбраны из пула аминокислот в молярном соотношении 38% Y, 25% S, 25% G и 12% R или отсутствуют; где Х18 выбран из G и A; и где Х19 выбран из I, M, L и F.

В другом варианте осуществления полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором:

(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22), где G находится в положении 26, и X1 находится в положении 28 согласно системе нумерации Кабата; где Х1 выбран из Y и S; где Х2 выбран из Y и S; где Х3 выбран из Y и S; где Х4 выбран из Y и S; и где Х5 выбран из Y и S;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность: X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO:23), где X1 находится в положении 50 согласно системе нумерации Кабата; где Х1 выбран из Y и S; где Х2 выбран из Y и S; где Х3 выбран из Y и S; где Х4 выбран из Y и S; где Х5 выбран из Y и S; и где Х6 выбран из Y и S; и

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:28), где X1 находится в положении 95 согласно системе нумерации Кабата; и где аминокислоты в каждом из положений X1-X6 выбраны из пула аминокислот в молярном соотношении 20% Y, 26% S, 26% G, 13% R, 1% A, 1% D, 1% E, 1% F, 1% H, 1% I, 1% K, 1% L, 1% M, 1% N, 1% P, 1% Q, 1% T, 1% V и 1% W; где аминокислоты в каждом из положений X7-X17 выбраны из пула аминокислот в молярном соотношении 20% Y, 26% S, 26% G, 13% R, 1% A, 1% D, 1% E, 1% F, 1% H, 1% I, 1% K, 1% L, 1% M, 1% N, 1% P, 1% Q, 1% T, 1% V и 1% W или отсутствуют; где Х18 выбран из G и A; и где Х19 выбран из I, M, L и F.

В одном из аспектов CDRH1 содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:524-540 и 189-294, или по меньшей мере одну аминокислотную последовательность CDR1, выбранную из последовательностей, показанных на фиг.11A или фиг.15. CDRH2 содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:541-557 и 295-400, или по меньшей мере одну аминокислотную последовательность CDHR2, выбранную из последовательностей, показанных на фиг.11A или фиг.15. CDRH3 содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:558-574 и 401-506, или по меньшей мере одну аминокислотную последовательность CDHR3, выбранную из последовательностей, показанных на фиг.11A или фиг.15.

В другом аспекте CDRH3 содержит X1, выбранную из R и Y; X3 означает S; X8 означает S; X9 означает Y; и X10 означает Y или R. В другом варианте осуществления CDRH3 содержит аминокислотную последовательность X1-R-S-Y-R-Y-G-S-Y-X10-G-S-Y-X14-F-D-Y (SEQ ID NO:575).

В другом аспекте полипептид связывается с DR5 человека или связывается с DR5 человека и DR5 мыши. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой антитело.

В одном из вариантов осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий: (i) CDRH1, содержащую аминокислотную последовательность GFYISSSSIH (SEQ ID NO:576); ii) CDRH2, содержащую аминокислотную последовательность SISPSSGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:577); и iii) CDRH3, содержащую аминокислотную последовательность YRSYRYGSYYGSYGFDY (SEQ ID NO:578). В одном из вариантов осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий: i) CDRH1, содержащую аминокислотную последовательность GFYIYSSSIH (SEQ ID NO:579); ii) CDRH2, содержащую аминокислотную последовательность SISPSSGYTSYADSVKG (SEQ ID NO:580); и iii) CDRH3, содержащую аминокислотную последовательность RRSYRYGSYRGSYAFDY (SEQ ID NO:581).

В другом аспекте полипептид дополнительно содержит вариабельный домен легкой цепи, в котором

(i) CDRL3 содержит аминокислотную последовательность Q-Q-X1-X2-X3-X4-P-X5-T (SEQ ID NO:25); где X1 находится в положении 91 и выбран из Y, H и S; Х2 выбран из Y и S; Х3 выбран из Y, S и T; Х4 выбран из Y, S и T; и Х5 выбран из S, P и Y. В одном из вариантов осуществления CDRL1 содержит аминокислотную последовательность RASQDVNTAVA (SEQ ID NO:29). В одном из вариантов осуществления CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SASSLYS (SEQ ID NO:30).

В другом варианте осуществления полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором (i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22); где X1 находится в положении 28 согласно нумерации Кабата и выбран из S и Y; Х2 выбран из S и Y; Х3 выбран из S и Y; Х4 выбран из S и Y; и Х5 выбран из S и Y; (ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO:23); где X1 находится в положении аминокислоты 50 согласно нумерации Кабата и выбран из S и Y; Х2 выбран из S и Y; Х3 выбран из S и Y; Х4 выбран из S и Y; Х5 выбран из S и Y; и Х6 выбран из S и Y; и (iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-D-Y (SEQ ID NO:582), где X1 находится в положении аминокислоты 95 согласно нумерации Кабата и выбран из Y и R; Х2 выбран из Y, S и R; Х3 выбран из S, G, Y и H; Х4 выбран из S, G, Y и R; Х5 выбран из G и A; Х6 выбран из F, M, L и A; и Х7 выбран из F, M, и L или отсутствует.

В одном из аспектов CDRH1 содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:189-198. CDRH2 содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:295-304. CDRH3 содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:401-410.

В другом варианте осуществления полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором (i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22); где X1 находится в положении 28 согласно нумерации Кабата и выбран из S и Y; Х2 выбран из S и Y; Х3 выбран из S и Y; Х4 выбран из S и Y; и Х5 выбран из S и Y; (ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO:22); где X1 находится в положении аминокислоты 50 согласно нумерации Кабата и выбран из S и Y; Х2 выбран из S и Y; Х3 выбран из S и Y; Х4 выбран из S и Y; и Х5 выбран из S и Y; и (iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-D-Y (SEQ ID NO:583), где X1 находится в положении аминокислоты 95 согласно нумерации Кабата и выбран из Y, S и G; Х2 выбран из Y, S, G, R, A и M; Х3 выбран из G, Y, S и R; Х4 выбран из G, Y и F; Х5 выбран из Y, S, N и G; Х6 выбран из Y, R, H и W; Х7 выбран из G и A; и Х8 выбран из F, M, L и I.

В одном из аспектов CDRH1 содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:199-216. CDRH2 содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO:305-322. CDRH3 содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:411-428.

В другом варианте осуществления полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором

(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H (SEQ ID NO:22); где X1 находится в положении 28 согласно нумерации Кабата и выбран из S и Y; Х2 выбран из S и Y; Х3 выбран из S и Y; Х4 выбран из S и Y; и Х5 выбран из S и Y;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность X1-I-X2-P-X3-X4-G-X5-T-X6-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO:23); где X1 находится в положении аминокислоты 50 согласно нумерации Кабата и выбран из S и Y; Х2 выбран из S и Y; Х3 выбран из S и Y; Х4 выбран из S и Y; и Х5 выбран из S и Y; и

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-D-Y (SEQ ID NO:584), где X1 находится в положении аминокислоты 95 и выбран из Y, S, R, G и E; Х2 выбран из Y, S, R и G; Х3 выбран из S, Y, G и W; Х4 выбран из S, Y, G и Q; Х5 выбран из G, Y и S; Х6 выбран из G, Y, S, R и V; Х7 выбран из S, Y, G и R; Х8 выбран из Y, S, G, R, P и V; Х9 выбран из G, A, Y, S и R; Х10 выбран из M, F, G, Y, S и R; Х11 выбран из A, Y, S, G и R или отсутствует; Х12 выбран из I, M, F, L, A, G, S, Y, R и T или отсутствует; Х13 выбран из F, M, L, G, A, Y, T и S или отсутствует; Х14 выбран из L, M, F, I, G, Y, A и T или отсутствует; Х15 выбран из M, L, Y, G и R или отсутствует; Х16 выбран из Y и G или отсутствует; Х17 выбран из R, M и G или отсутствует; Х18 выбран из P и A или отсутствует; и X19 означает L или отсутствует.

В другом варианте осуществления полипептид содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, в котором:

(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность G-F-X1-I-X2-X3-X4-X5-I-H, где G находится в положении 26 и X1 находится в положении