Мутантные антигены gas57 и антитела против gas57

Мутантные антигены gas57 и антитела против gas57

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и вакцинологии. В частности, настоящее изобретение относится к антигенам, происходящим от Streptococcus pyogenes, и к их использованию в целях иммунизации.

Предшествующий уровень техники

Антиген GAS57 S. pyogenes (стрептококки группы A; GAS), экспрессируемый как рекомбинантный белок и выделенный из E.coli, индуцирует активность, направленную на защиту от летального инфицирования мышей бактерией S. pyogenes. Однако GAS57 представляет собой протеазу, которая расщепляет и инактивирует человеческие хемокины, такие как интерлейкин-8 (IL-8) (Edwards et al., J. Infectious Diseases 192, 783-90, 2005; Hidalgo-Grass et al., EMBO J. 25, 4628-37, 2006). Такое свойство GAS57 не дает возможность применять этот антиген в вакцинной композиции, поскольку он может вызывать побочные эффекты. Поэтому необходимо получить антигены GAS57, которые были бы не способны расщеплять человеческие хемокины, но при этом сохраняли бы способность обеспечивать защиту от инфекции, вызываемой S. pyogenes. Необходимо также получить антитела, которые обладали бы способностью специфически связываться с антигенами GAS57 и подавляли бы способность GAS57 расщеплять IL-8 и другие субстраты.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Микрофотография полиакриламидного геля с ДСН, иллюстрирующая расщепление IL-8 антигеном GAS57 дикого типа.

Фиг. 2. Сопоставление последовательностей GAS57 дикого типа (запрос, SEQ ID NO:1) с последовательностью сериновой протеазы, относящейся к классу пептидаз C5a, путем выравнивания этих последовательностей с помощью программы BLAST (Sbjct, SEQ ID NO:9).

Фиг. 3. Микрофотография полиакриламидных гелей с ДСН, на которой показано, что точковый мутант GAS57 D151A не обладает способностью расщеплять IL-8.

Фиг. 4. График, иллюстрирующий результаты ELISA-анализа, указывающего на то, что точковый мутант GAS57 D151A не обладает способностью расщеплять IL-8.

Фиг. 5A-B. Микрофотография полиакриламидных гелей с ДСН, на которой показано, что мутанты GAS57 с одной модификацией D151A и с одной модификацией S617A и мутант с двумя модификациями D151A+S617A не обладают протеолитической активностью GAS57.

Фиг. 6. График, иллюстрирующий результаты ELISA-анализа, указывающего на то, что мутанты GAS57 с одной модификацией D151A и с одной модификацией S617A и мутант с двумя модификациями D151A+S617A не обладают протеолитической активностью GAS57.

Фиг. 7. Микрофотография полиакриламидных гелей с ДСН, на которой показано, что GAS57 дикого типа посттрансляционно модифицируется в два полипептидных фрагмента размером в 150,5 кДа и 23,4 кДа.

Фиг. 8. Микрофотография полиакриламидных гелей с ДСН, на которой показано, что мутанты GAS57, а именно D151A, S617A и D151A+S617A, в отличие от антигена дикого типа, не подвергаются посттрансляционной модификации с образованием двух полипептидных фрагментов размером 150,5 кДа и 23,4 кДа (показано черными стрелками). Поэтому яркая полоса 174 кДа, соответствующая непроцессированному белку, присутствует на дорожках, соответствующих неактивным мутантным штаммам (показано серыми стрелками).

Фиг. 9A-B. Результаты ELISA-анализа продемонстрировали дозозависимое ингибирование GAS57-опосредуемого расщепления IL-8 под действием поликлональной антисыворотки против GAS57 в двух различных экспериментальных условиях. Фиг. 9A, 8-часовое инкубирование, 0,1 мкг/мл GAS57. Фиг. 9B, 24-часовое инкубирование, 0,05 мкг/мл GAS57.

Фиг. 10A-GG. Сравнение антигенов GAS57, происходящих от различных штаммов/M-типов, путем выравнивания их последовательностей. Каталитическая триада (D, H, S) показана жирным шрифтом. Фиг. 10A, аминокислоты 1-50 (положения аминокислот, указанные наверху на каждой странице фиг. 10A-GG, относятся к аминокислотной последовательности gas57M1_SF370, SEQ ID NO:1); Фиг. 10B, аминокислоты 51-100; Фиг. 10C, аминокислоты 101-150; Фиг. 10D, аминокислоты 151-200; Фиг. 10E, аминокислоты 201-250; Фиг. 10F, аминокислоты 251-300; Фиг. 10G, аминокислоты 301-350; Фиг. 1H, аминокислоты 351-400, Фиг. 10I, аминокислоты 401-450; Фиг. 10J, аминокислоты 451-500; Фиг. 10K, аминокислоты 501-550; Фиг. 10L, аминокислоты 551-600; Фиг. 10M, аминокислоты 601-650; Фиг. 10N, аминокислоты 651-700; Фиг. 10O, аминокислоты 701-750; Фиг. 10P, аминокислоты 751-800; Фиг. 10Q, аминокислоты 801-850; Фиг. 10R, аминокислоты 851-900; Фиг. 10S, аминокислоты 901-950; Фиг. 10T, аминокислоты 951-1000; Фиг. 10U, аминокислоты 1001-1050; Фиг. 10V, аминокислоты 1051-1100; Фиг. 10W, аминокислоты 1101-1150; Фиг. 10X, аминокислоты 1151-1200; Фиг. 10Y, аминокислоты 1201-1250; Фиг. 10Z, аминокислоты 1251-1300; Фиг. 10AA, аминокислоты 1301-1350; Фиг. 10BB, аминокислоты 1351-1400; Фиг. 10CC, аминокислоты 1401-1450; Фиг. 10DD, аминокислоты 1451-1500; Фиг. 10EE, аминокислоты 1501-1550; Фиг. 10FF, аминокислоты 1551-1600; Фиг. 10GG, аминокислоты 1601-1650.

Фиг. 11. Выравнивание последовательностей человеческих хемокинов. GAS57 расщепляет CXCL8 (IL-8) (SEQ ID NO:81) между двумя аминокислотами, которые выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. CXCL4, SEQ ID NO:57; CXCL7/NAP-2, SEQ ID NO:58; CXCL1/GROα, SEQ ID NO:59; CXCL2/GROβ, SEQ ID NO:60; CXCL3/GROγ, SEQ ID NO:61; CXCL6/GCP-2, SEQ ID NO:62; CXCL12/SDF-1α, SEQ ID NO:63; CXCL12/SDF-1γ, SEQ ID NO:64; CXCL12/SDF-1β, SEQ ID NO:65; CXCL9/MIG, SEQ ID NO:66; CXCL10/IP10, SEQ ID NO:67 и CXCL11, SEQ ID NO:68.

Фиг. 12. Микрофотография полиакриламидных гелей с ДСН, иллюстрирующая расщепление хемокинов CXC под действием GAS57.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к мутантам Spy0416 или GAS57 (называемым здесь «мутантными антигенами GAS57», «мутантами GAS57», «антигенами мутанта GAS57»), которые не способны расщеплять человеческие хемокины, такие как IL-8, но при этом сохраняют способность обеспечивать защиту от S. pyogenes. Мутанты GAS57 согласно изобретению могут быть использованы в вакцинных композициях для обеспечения защиты от S. pyogenes. Настоящее изобретение также относится к антителам, которые специфически связываются с GAS57 дикого типа и подавляют способность GAS57 расщеплять IL-8 и аналогичные субстраты. При этом следует отметить, что указанные антитела могут быть использованы в качестве терапевтических средств для предупреждения и/или лечения инфекционных заболеваний, вызываемых S. pyogenes.

Антигены мутантного GAS57

«GAS57» также обозначается «Spy0416» (M1), «SpyM3_0298» (M3), «SpyM18_0464» (M18) и «prtS». GAS57 был также идентифицирован как предполагаемая протеиназа клеточной оболочки. См. WO 02/34771 и US 2006/0258849. По данным специалистов Центра лечения и профилактики заболеваний США существует 49 последовательностей GAS57, происходящих от 17 различных M-типов (1, 2, 3, 4, 6, 11, 12, 18, 22, 23, 28, 44/61, 68, 75, 77, 89, 94), причем эти антигены 17 различных M-типов ответственны за 95% и более случаев заболеваемости фарингитом и примерно за 68% случаев образования инвазивных GAS-изолятов. Аминокислотные последовательности антигенов GAS57 дикого типа представлены в списке последовательностей как SEQ ID No: 1, 10-56 и 80. GAS57 дикого типа содержит два нековалентно связанных пептида (см. пример 5 и фиг.7).

Антигены мутантного GAS57 согласно изобретению обладают протеолитической активностью, направленной на расщепление интерлейкина 8 (IL-8), которая по меньшей мере на 50% (например, на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) ниже активности GAS57 дикого типа, как было определено с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ или ELISA-анализа (см. примеры 2 и 3), но при этом указанные антигены являются иммуногенными, например, они обеспечивают защиту от летального инфицирования антигеном GAS у мышей-моделей (пример 4). Предпочтительно, мутантный GAS57 согласно изобретению также не расщепляет другие человеческие цитокины, такие как CXCL1/GROα (например, SEQ ID NO:59), CXCL2/GROβ (например, SEQ ID NO:60), CXCL3/GROγ (например, SEQ ID NO:61), CXCL4 (например, SEQ ID NO:57), CXCL12/SDF-1α (например, SEQ ID NO:63), CXCL12/SDF-1β (например, SEQ ID NO:65), CXCL12/SDF-1γ (например, SEQ ID NO:64), CXCL5/ENA78 (например, SEQ ID NO:82), CXCL6/GCP-2 (например, SEQ ID NO:62), CXCL7/NAP-2 (например, SEQ ID NO:58), CXCL9/MIG (например, SEQ ID NO:66), CXCL10/IP10 (например, SEQ ID NO:67), CXCL11 (например, SEQ ID NO:68), CXCL13 (например, SEQ ID NO:83), CXCL14 (например, SEQ ID NO:84) и CXCL16 (например, SEQ ID NO:85). Неожиданно было обнаружено, что мутанты GAS57 согласно изобретению, в отличие от GAS57 дикого типа, представляют собой одиночные полипептиды, которые подвергаются посттрансляционному процессингу (созреванию) с образованием двух нековалентно связанных пептидов (примеры 5 и 6). Возможность получения таких антигенов в виде одиночного пептида облегчает продуцирование рекомбинантного белка, используемого для вакцинации.

Мутантами GAS57 согласно изобретению являются мутанты, имеющие аминокислотные модификации (то есть замену, делецию или инсерцию) в одном или нескольких положениях аминокислоты D151, H279 или S617, пронумерованных в соответствии с последовательностью GAS57 дикого типа, представленной в SEQ ID NO:1 (см. фиг. 10).

Мутантами GAS57 согласно изобретению являются мутанты, имеющие одну, две или три аминокислотных модификаций («мутанты с одной модификацией», «мутанты с двумя модификациями», «мутанты с тремя модификациями») в положениях D151, H279 и/или S617. Так, например, мутанты GAS57 могут иметь следующие замены:

Настоящее изобретение также включает эквиваленты мутантов GAS57, представляющие собой одиночные полипептиды, которые не расщепляют IL-8, как было определено с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ или ELISA-анализа, но являются иммуногенными и обеспечивают защиту от летального инфицирования антигеном GAS у мышиной модели. Такими эквивалентами могут быть антигены мутантов GAS57 с аминокислотными делециями, инсерциями и/или заменами в положениях, не являющихся положениями D151, H279 или S617, включая делеции примерно до 40 аминокислот у N- или C-конца (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот). Такими эквивалентами также являются мутанты GAS57, имеющие делеции, инсерции и/или замены в положениях, кроме положений Dl51, H279 или S617, а также модификацию в одном или нескольких положениях аминокислот D151, H279 или S617 и S617, как описано выше.

Молекулы нуклеиновой кислоты

Настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие мутантные антигены GAS57. Настоящее изобретение также включает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 50% идентичны последовательностям таких молекул. В зависимости от конкретной последовательности, степень идентичности последовательностей предпочтительно превышает 50% (например, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более). Идентичность нуклеотидных последовательностей предпочтительно определяют с помощью алгоритма поиска гомологии Смита-Уотермана, осуществляемого с применением программы MPSRCH (Oxford Molecular), где указанный поиск проводят с введением аффинных пробелов при следующих параметрах: штраф за пробел-пропуск = 12 и штраф за пробел-удлинение = 1.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут гибридизоваться с этими молекулами. Реакции гибридизации могут быть осуществлены в различных условиях «жесткости». Реакция гибридизации в условиях повышенной жесткости хорошо известна специалистам и описана в литературе. См., например, страницу 7.52 руководства Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Примерами соответствующих условий являются (в порядке возрастания жесткости): температуры инкубирования 25°C, 37°C, 50°С, 55°C и 68°C; концентрации буферов 10X SSC, 6X SSC, 1X SSC и 0,1X SSC (где SSC означает 0,15 M NaCl и 15 мМ цитратный буфер) и эквивалентные условия с использованием других буферных систем; концентрации формамида 0%, 25%, 50% и 75%; время инкубирования от 5 минут до 24 часов; 1, 2 или более стадий промывки; время инкубирования промывок 1, 2 или 15 минут; и промывочные растворы 6X SSC, 1X SSC, 0,1X SSC или деионизованной воды. Методы гибридизации и их оптимизация хорошо известны специалистам. См., например, руководство Sambrook, 1989; Ausubel et al., eds., Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., 1999; патент США 5707829; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 30, 1987.

В некоторых вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению гибридизуются с мишенью в условиях низкой жесткости, в других вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению гибридизуются в условиях умеренной жесткости, а в предпочтительных вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению гибридизуются в условиях высокой жесткости. Примером гибридизации в условиях низкой жесткости является гибридизация при температуре 50°С и в 10X SSC. Примером гибридизации в условиях умеренной жесткости является гибридизация при температуре 55°C и в 1X SSC. Примером гибридизации в условиях высокой жесткости является гибридизация при температуре 68°C и в 0,1X SSC.

Продуцирование антигенов мутантов GAS57

Рекомбинантное продуцирование

Избыточность генетического кода хорошо известна специалистам. Так, например, любая молекула нуклеиновой кислоты (полинуклеотид), кодирующая белок GAS57 дикого типа, или мутантный белок GAS57 согласно изобретению, может быть использована для рекомбинантного продуцирования белка. Примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих GAS57 дикого типа, мутантный GAS57 D151A, мутантный GAS57 S617A и мутантный GAS D151A+S617A, представлены в SEQ ID NO:5, 6, 7 и 8 соответственно. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие GAS57 дикого типа, могут быть также выделены из соответствующей бактерии S. pyogenes стандартными методами очистки нуклеиновых кислот, либо они могут быть синтезированы методом амплификации, таким как полимеразная цепная реакция (ПЦР), или на автоматическом синтезаторе. См. Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215 223, 1980; Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225 232, 1980; Hunkapiller et al., Nature 310, 105-11, 1984; Grantham et al., Nucleic Acids Res. 9, r43-r74, 1981.

Молекулы кДНК могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии с использованием мРНК в качестве матрицы. Затем молекулы кДНК могут быть реплицированы методами молекулярной биологии, хорошо известными специалистам. Метод амплификации, такой как ПЦР, может быть применен для получения дополнительных копий полинуклеотидов согласно изобретению с использованием геномной ДНК или кДНК в качестве матрицы.

При желании полинуклеотиды могут быть сконструированы методами, по существу известными специалистам, в целях модификации антиген-кодирующих последовательностей, включая, но не ограничиваясь ими, изменения, которые позволяют модифицировать клонирование, процессинг и/или экспрессию полипептида или мРНК-продукта. Для конструирования нуклеотидных последовательностей может быть осуществлена перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторная сборка генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов, проводимая с помощью ПЦР. Так, например, сайт-направленный мутагенез может быть проведен для инсерции новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования сплайсированных вариантов, введения мутаций и т.п.

Модификации последовательностей, такие как добавление последовательности метки для очистки или оптимизация кодонов, могут быть осуществлены в целях облегчения экспрессии. Так, например, N-концевая лидерная последовательность может быть заменена последовательностью, кодирующей белок-метку, такую как полигистидин («HIS») или глутатион-S-трансфераза («GST»). Такие белки-метки могут быть использованы для облегчения очистки и детектирования экспрессируемого белка, а также для повышения его стабильности. Кодоны, предпочитаемые конкретной прокариотической или эукариотической клеткой-хозяином, могут быть выбраны для повышения уровня экспрессии белка или для продуцирования РНК-транскрипта, обладающего нужными свойствами, такими как время полужизни, которое превышает время полужизни транскрипта, продуцируемого из природной последовательности. Такие методы хорошо известны специалистам и более подробно описаны в WO05/032582.

Экспрессионные векторы

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антиген мутанта GAS57, может быть встроена в экспрессионный вектор, содержащий элементы, необходимые для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности. Для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующие последовательности и соответствующие элементы регуляции транскрипции и трансляции, могут быть применены методы, хорошо известные специалистам в данной области. Такими методами являются методы рекомбинантных ДНК in vitro, методы синтеза и методы генетической рекомбинации in vivo.

Клетки-хозяева

Клетки-хозяева для продуцирования мутантных антигенов GAS57 могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительной клеткой-хозяином является E.coli, а другими подходящими хозяевами являются Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (например, M. tuberculosis), дрожжи, бакуловирусы, клетки млекопитающих и т.п.

Штамм клетки-хозяина может быть выбран по его способности модулировать экспрессию встроенных последовательностей или процессинг экспрессируемого полипептида нужным способом. Такими модификациями полипептидов являются, но не ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизация и ацилирование. Для облегчения «правильного» встраивания, сборки и/или улучшения функций может быть также осуществлен посттрансляционный процессинг, который позволяет отщеплять «препро»-форму полипептида. Различные клетки-хозяева, обладающие специфическим клеточным механизмом и характерными механизмами посттрансляционной активности, имеются в Американской коллекции типовых культур (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) и могут быть выбраны для гарантии «правильной» модификации и «правильного» процессинга чужеродного белка. См. WO 01/98340.

Экспрессионные конструкции могут быть введены в клетку-хозяина хорошо известными методами, которыми являются, но не ограничиваются ими, перенос ДНК, опосредуемый трансферрином-поликатионами; трансфекция «оголенными» или инкапсулированными нуклеиновыми кислотами, слияние клеток, опосредуемое липосомами; внутриклеточный перенос ДНК, нанесенных на латексные сферы; слияние протопластов, инфицирование вирусом, электропорация, методы «выстреливания генов» и трансфекция, опосредуемая DEAE или фосфатом кальция.

Клетки-хозяева, трансформированные экспрессионными векторами, могут быть культивированы в условиях, подходящих для экспрессии и выделения белка из клеточной культуры. Белок, продуцированный трансформированной клеткой, может секретироваться или оставаться внутри клетки в зависимости от используемой нуклеотидной последовательности и/или от используемого экспрессионного вектора. Для специалиста в данной области очевидно, что экспрессионные векторы могут быть сконструированы так, чтобы они содержали сигнальные последовательности, которые направляют секрецию растворимых антигенов через мембрану прокариотических или эукариотических клеток.

Очистка

Сигнальные экспортные последовательности могут быть включены в рекомбинантно продуцируемый мутантный антиген GAS57 для облегчения его выделения из среды для культивирования клеток известными методами. Альтернативно рекомбинантно продуцированные мутантные антигены GAS57 согласно изобретению могут быть выделены из сконструированных клеток-хозяев и отделены от других клеточных компонентов, таких как белки, углеводы или липиды, методами, хорошо известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, эксклюзионная хроматография, фракционирование сульфатом аммония, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и электрофорез в препаративном геле. Препарат очищенных мутантных антигенов GAS57 имеет чистоту по меньшей мере 80%, а предпочтительно такие препараты имеют чистоту 90%, 95% или 99%. Чистота препаратов может быть оценена любыми методами, известными специалистам, такими как электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН. При необходимости мутантные антигены GAS57 могут быть солюбилизированы, например, мочевиной.

Химический синтез

Мутантные антигены GAS57 могут быть синтезированы, например, методами твердофазного синтеза. См., например, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 54, 1963; Roberge et al., Science 269, 202 04, 1995. Синтез белка может быть осуществлен вручную или автоматически. Автоматизированный синтез может быть осуществлен, например, на синтезаторе пептидов Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Фрагменты мутантного антигена GAS57 могут быть, но необязательно, отдельно синтезированы и объединены химическими методами с получением полноразмерной молекулы.

Антитела против GAS57

Настоящее изобретение также относится к антителам, которые специфически связываются с GAS57 дикого типа, и которые по существу ослабляют или подавляют способность GAS57 расщеплять IL-8. Некоторые антитела согласно изобретению также специфически связываются с мутантным GAS57, описанным выше. Предпочтительные антитела также ослабляют или подавляют способность GAS57 расщеплять другие субстраты, такие как гомологи IL-8 (например, CXL1/GROα, CXCL2/GROβ, CXCL3/GROγ, CXCL4, CXCL12/SDF-1α, CXCL12/SDF-1β, CXCL12/SDF-1γ, CXCL5/ENA78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL9/MIG, CXCL10/IP10, CXCL11, CXCL13, CXCL14 и CXCL16). Считается, что антитело «специфически связывается» с GAS57 дикого типа или с мутантным GAS57, если в иммунохимическом анализе оно продуцирует детектируемый сигнал, который по меньшей мере в 5, 10 или 20 раз превышает детектируемый сигнал, передаваемый белками, не являющимися GAS57. Предпочтительно, если антитела, которые специфически связываются с GAS57 дикого типа или с мутантным GAS57 в иммунохимических анализах, не распознают белки, не являющиеся GAS57, и могут осаждать GAS57 дикого типа из раствора в виде иммунопреципитата. Антитела согласно изобретению могут снижать протеолитическую активность GAS57, направленную против интерлейкина-8 (IL-8), по меньшей мере на 50% (например, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) по сравнению с протеолитической активностью GAS57 дикого типа, как было обнаружено с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ или ELISA.

В предпочтительных вариантах изобретения антитела согласно изобретению блокируют прогрессирование некротических поражений у животных, иммунизованных рекомбинантным антигеном GAS57 дикого типа или мутантного GAS57 и инфицированных GAS.

Используемый здесь термин «антитело» включает интактные молекулы иммуноглобулина, а также их фрагменты, которые специфически связываются с GAS57 дикого типа, а в некоторых случаях с мутантным антигеном GAS57. Такими антителами являются гибридные (химерные) молекулы антитела (например, Winter et al., Nature 349, 293-99, 1991; патент США 4816567); F(ab')₂- и F(ab)-фрагменты и молекулы F_v; нековалентные гетеродимеры (например, Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2659-62, 1972; Ehrlich et al., Biochem 19, 4091-96, 1980); одноцепочечные молекулы Fv (sFv) (например, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85, 5897-83, 1988); конструкции из димерных и тримерных фрагментов антител; миниантитела (например, Pack et al., Biochem. 31, 1579-84, 1992; Cumber et al., J. Immunology 149B, 120-26, 1992); молекулы гуманизованного антитела (например, Riechmann et al., Nature 332, 323-27, 1988; Verhoeyan et al., Science 239, 1534-36, 1988; и патент Великобритании № GB 2276169, опубликованный 21 сентября 1994); и любые функциональные фрагменты, полученные из таких молекул, а также антитела, полученные нестандартными методами, такими как фаговое представление.

Получение антител против GAS57

Мутантный антиген GAS57 или антиген GAS57 дикого типа может быть использован для иммунизации млекопитающего, такого как мыши, крысы, кролики, морские свинки, обезьяны или человек, в целях вырабатывания у них поликлональных антител. При желании антиген GAS57 может быть конъюгирован с белком-носителем, таким как альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. В зависимости от вида хозяина для усиления иммунного ответа могут быть использованы различные адъюванты. Такими адъювантами являются, но не ограничиваются ими, адъювант Фрейнда, минеральные гели (например, гидроксид алюминия) и поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, полиолы плюроники, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки и динитрофенол). Среди адъювантов, используемых для введения человеку, особенно подходящими являются BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum.

Моноклональные антитела, специфически связывающиеся с антигеном GAS57 дикого типа или мутантным антигеном GAS57, могут быть получены любым методом, который позволяет продуцировать молекулы антитела в непрерывной культуре клеточных линий. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, гибридомный метод, метод с использованием человеческой В-клеточной гибридомы и метод с использованием EBV-гибридомы (Kohler et al., Nature 256, 495-97, 1985; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31 42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-30, 1983; Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109-20, 1984).

Кроме того, могут быть применены методы, разработанные в целях продуцирования «химерных антител» посредством сплайсинга генов мышиного антитела с их присоединением к генам человеческого антитела и образованием молекулы, обладающей соответствующей антигенной специфичностью и биологической активностью (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-55, 1984; Neuberger et al., Nature 312, 604-08, 1984; Takeda et al., Nature 314, 452-54, 1985). Моноклональные антитела и другие антитела могут быть также «гуманизованы» для предотвращения вырабатывания у пациента иммунного ответа против антитела, используемого в терапии. Последовательности таких антител могут иметь сходство с последовательностями человеческих антител, которое является достаточным для их прямого использования в терапии или для их использования в терапии после модификации нескольких ключевых остатков. Различие последовательностей антител грызунов и человека может быть минимизировано путем замены остатков, отличающихся от остатков человеческих последовательностей, которую проводят с помощью сайт-направленного мутагенеза отдельных остатков или посредством присоединения всех гипервариабельных областей.

Альтернативно гуманизованные антитела могут быть получены рекомбинантными методами, описанными ниже. Антитела, специфически связывающиеся с конкретным антигеном, могут содержать антиген-связывающие сайты, которые являются частично или полностью гуманизованными, как описано в патенте США 5565332. Человеческие моноклональные антитела могут быть получены in vitro, как описано в публикации Simmons et al., PLoS Medicine 4(5), 928-36, 2007.

Альтернативно описанные методы продуцирования одноцепочечных антител могут быть адаптированы известными методами в целях продуцирования одноцепочечных антител, специфически связывающихся с конкретным антигеном. Антитела, имеющие родственную специфичность, но отличающийся идиотипический состав, могут быть получены путем перестановки цепей из рандомизированных комбинаторных библиотек иммуноглобулинов (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23, 1991).

Одноцепочечные антитела могут быть также сконструированы методом амплификации ДНК, таким как ПЦР, с использованием гибридомной кДНК в качестве матрицы (Thirion et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11, 1996). Одноцепочечные антитела могут быть моно- или биспецифическими и могут быть двухвалентными или четырехвалентными. Конструирование четырехвалентных биспецифических одноцепочечных антител описано, например, в публикации Coloma & Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159-63, 1997. Конструирование двухвалентных биспецифических одноцепочечных антител описано в публикации Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1994.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая одноцепочечное антитело, может быть сконструирована методом ручного или автоматического нуклеотидного синтеза, клонирована в экспрессионную конструкцию стандартными методами рекомбинантных ДНК и введена в клетку для экспрессии кодирующей последовательности, как описано ниже. Альтернативно одноцепочечные антитела могут быть непосредственно продуцированы, например, с применением техники нитчатых фагов (Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, 497-501, 1995; Nicholls et al., J. Immunol. Meth. 165, 81-91, 1993).

Антитела, которые специфически связываются с антигеном GAS57, могут быть также получены путем индуцирования их продуцирования in vivo популяцией лимфоцитов или путем скрининга библиотек иммуноглобулинов или панелей высокоспецифических связывающихся реагентов, описанных в литературе (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293 299, 1991).

Химерные антитела могут быть сконструированы, как описано в WO 93/03151. Могут быть также получены связывающие белки, которые происходят от иммуноглобулинов и которые являются поливалентными и мультиспецифическими, такими как «диантитела», описанные в WO 94/13804.

Антитела могут быть очищены методами, хорошо известными специалистам. Так, например, антитела могут быть аффинно очищены путем их пропускания через колонку, с которой связывается релевантный антиген. Затем связанные антитела элюируют с колонки с использованием буфера, имеющего высокую концентрацию соли.

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение также относится к композициям, используемым в качестве лекарственных препаратов (например, в качестве иммуногенных композиций или вакцин). Композиции согласно изобретению могут быть использованы в целях предупреждения и/или лечения заболевания, вызываемого инфицированием бактерией S. pyogenes, и содержат по меньшей мере один активный агент, которым может быть полипептид, молекула нуклеиновой кислоты или антитело. Указанными заболеваниями могут быть, например, бактериемия, менингит, послеродовой сепсис, скарлатина, рожа, фарингит, импетиго, некрозирующий фасцит, миозит или синдром токсического шока.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть использованы как в профилактических, так и терапевтических целях, но обычно они предназначены для применения в профилактических целях. В соответствии с этим, настоящее изобретение включает способ терапевтического или профилактического лечения заболевания, вызываемого инфицированием бактерией Streptococcus pyogenes. Предпочтительным животным является млекопитающее, а наиболее предпочтительно, человек. Указанные способы включают введение животному терапевтически или профилактически эффективного количества иммуногенных композиций согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям согласно изобретению, используемым для терапевтического или профилактического лечения заболевания, вызываемого инфицированием бактерией Streptococcus pyogenes у животного.

Предпочтительными иммуногенными композициями, а более предпочтительно вакцинными композициями, являются композиции, содержащие мутантный антиген GAS57 или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный антиген GAS57. pH таких композиций предпочтительно составляет от 6 до 8, более предпочтительно примерно 7. рН может поддерживаться с использованием буфера. Такая композиция может быть стерильной и/или апирогенной. Композиция может быть изотоничной с тканью человека (например, кровью).

Некоторые композиции согласно изобретению содержат один или несколько мутантных антигенов GAS57, описанных в настоящей заявке. Другие композиции согласно изобретению содержат одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих мутантный(е) антиген(ы) GAS57, и, необязательно, другие антигены, которые могут быть включены в данную композицию (см. ниже). См., например, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly et al. (1997) Ann. Rev Immunol 15:617-648; Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480; Apostolopoulos & Plebanski (2000) Curr. Opin. Mol. Ther 2:441-447; Ilan (1999) Curr. Opin. Mol. Ther 1:116-120; Dubensky et al. (2000) Mol. Med. 6:723-732; Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74; Donnelly et al. (2000) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(4 Pt 2):S190-193; Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66:84-90. Обычно молекулой нуклеиновой кислоты является молекула ДНК, например, в форме плазмиды.

Другие композиции согласно изобретению включают по меньшей мере одно антитело, которое специфически связывается с антигеном GAS57 дикого типа, описанным выше, или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую такое антитело.

В некоторых вариантах изобретения композиции согласно изобретению могут включать активный агент более чем одного типа (например, полипептидный антиген и молекулу нуклеиновой кислоты; полипептидный антиген и антитело; молекулу нуклеиновой кислоты и антитело; полипептидный антиген, молекулу нуклеиновой кислоты и антитело).

В некоторых вариантах изобретения композиции согласно изобретению могут включать один или несколько дополнительных активных агентов. Такими агентами являются, но не ограничиваются ими: (a) другой антиген мутантного GAS57 согласно изобретению, (b) полипептидный антиген, который может быть использован в качестве вакцины для детей, (c) полипептидный антиген, который может быть использован в качестве вакцины для пожилых людей или индивидуумов с ослабленным иммунитетом, (d) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антигены (a)-(c), и антитело, которое специфически связывается с антигенами (a)-(c).

Дополнительные антигены

Композиции согласно изобретению могут быть введены в комбинации с одним или несколькими антигенами, используемыми в способах терапии или профилактики согласно изобретению. Предпочтительными антигенами являются антигены, перечисленные ниже. Кроме того, композиции согласно изобретению могут быть использованы для лечения или предупреждения инфекционных заболеваний, вызываемых любыми перечисленными ниже патогенами. Композиции согласно изобретению, помимо комбинации с антигенами, описанными ниже, могут быть также объединены с адъювантом, описанным в настоящей заявке.

Антигенами, используемыми в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, один или несколько нижеследующих антигенов или антигены, происходящие от одного или нескольких перечисленных ниже патогенов.

A. Бактериальные антигены

Бактериальными антигенами, подходящими для их использования в настоящем изобретении, являются белки, полисахариды, липополисахариды и другие мембранные везикулы, которые могут быть выделены и очищены из бактерий, либо они могут происходить от этих бактерий. Кроме того, бактериальными антигенами могут быть бактериальные лизаты и инактивированные бактериальные препараты. Бактериальные антигены могут быть продуцированы посредством рекомбинантной экспрессии. Бактериальными антигенами предпочтительно являются эпитопы, которые находятся на поверхности бактерий по меньшей мере в одной стадии их жизненного цикла. Бактериальные антигены предпочтительно являются консервативными для множества серотипов. Бактериальными антигенами являются антигены, происходящие от одной или нескольких бактерий, перечисленных ниже, а также специфические антигены, примеры которых идентифицированы ниже.

Neisseria meningitidis: Антигенами Meningitides могут быть белки (такие как белки, идентифицированные в работах 1-7), сахариды (включая полисахарид, олигосахарид или липополисахарид), или внешние мембранные везикулы (работы 8, 9, 10, 11), очищенные или выделенные из серогруппы N. meningitides, такой как A, C, W135, Y и/или B. Белковые антигены Meningitides могут быть выбраны из адгезивов, аутопереносчиков, токсинов, белков, образованных в результате присоединения Fe, и мембраносвязанных белков (предпочтительно интегрального внешнего мембранного белка).

Streptococcus pneumoniae: Антигенами Streptococcus pneumoniae могут быть сахарид (включая полисахарид или олигосахарид) и/или белок, происходящий от Streptococcus pneumoniae. Сахаридные антигены могут быть выбраны из антигенов серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F и 33F. Белковые антигены могут быть выбраны из белков, идентифицированных в WO 98/18931, WO 98/18930, в патенте США № 6699703, в патенте США № 6800744, WO 97/43303 и WO 97/37026. Белки Streptococcus pneumoniae могут быть выбраны из белков семейства полигистидиновых триад (PhtX), белков, принадлежащих к семейству холин-связывающих белков (CbpX), усеченных белков CbpX, белков семейства LytX, усеченных белков LytX, химерных белков «усеченная форма CbpX - усеченная форма LytX», пневмолизина (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 или Sp133.

Streptococcus pyogenes (стрептококки группы А): Антигенами стрептококков группы А могут быть белок, идентифицированный в WO 02/34771 или WO 2005/032582 (включая GAS40), гибриды фрагментов белков GAS M (включая белки, описанные в WO 02/094851 и в работах Dale, Vaccine (1999) 17:193-200 и Dale, Vaccine 14(10): 944-948), белок, связывающийся с фибронектином (Sfb1), связанный с гемом белок стрептококков (Shp) и стрептолизин S (SagA). Другими антигенами стрептококков группы А являются, но не ограничиваются ими,